मौलिक रोगाणु कोशिकाओं (PGCs) शुक्राणु और अंडे दोनों के आम अग्रदूत हैं । मानव भ्रूण PGCs साइटोकिंस की बातचीत के माध्यम से pluripotent epiblast कोशिकाओं से निर्दिष्ट कर रहे हैं । यहां, हम एक 13 दिन के प्रोटोकॉल का वर्णन मानव कोशिकाओं transcriptomally जैसी PGCs embryoid निकायों की सतह पर प्रधानमंत्री-pluripotency प्रेरित pluripotent स्टेम कोशिकाओं से प्रेरित ।
मौलिक रोगाणु कोशिकाएं (PGCs) सभी germline कोशिकाओं के आम पुरोगामी हैं । माउस भ्रूण में, के एक संस्थापक जनसंख्या ~ ४० PGCs pluripotent epiblast कोशिकाओं से प्रेरित कर रहे है साइटोकिंस के लिए एक्सपोजर द्वारा आर्केस्ट्रा, अस्थि morphogenetic प्रोटीन 4 (Bmp4) सहित । मानव भ्रूण में, जल्दी से PGCs की जर्दी थैली के endodermal दीवार पर हमल के 3rd सप्ताह के अंत के आसपास की पहचान की गई है, लेकिन थोड़ा मानव PGC विनिर्देश और उनके प्रारंभिक विकास की प्रक्रिया के बारे में जाना जाता है । मानव भ्रूण PGCs के अध्ययन के तकनीकी और नैतिक बाधाओं को दरकिनार, किराए सेल संस्कृति मॉडल हाल ही में pluripotent स्टेम सेल से उत्पंन किया गया है । यहां, हम मानव PGC की तरह कोशिकाओं (hPGCLCs) के मजबूत उत्पादन के लिए एक 13 दिन के प्रोटोकॉल का वर्णन । मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (hiPSCs) प्रधान pluripotency राज्य में बनाए रखा ४८ घंटे के लिए 4i भोली reprogramminging माध्यम में मशीन हैं, एकल कोशिकाओं को असंबद्ध, और microwells में पैक । भोले pluripotency राज्य में hiPSCs के लंबे समय तक रखरखाव महत्वपूर्ण गुणसूत्र विचलन का कारण बनता है और बचा जाना चाहिए । microwells में hiPSCs को embryoid निकायों (EBs) के रूप में एक अतिरिक्त 24 घंटे के लिए बनाए रखा जाता है, जो तब plasticware प्रेरण माध्यम में एक कमाल की स्थिति के तहत कम पालन hPGCLC में कल्चरित होते हैं, जिनमें उच्च एकाग्रता होती है । रिकॉमबिनेंट मानव BMP4 । EBs आगे के लिए प्रसंस्कृत में 8 दिनों के लिए कर रहे है कमाल, गैर अनुयाई हालत hPGCLCs की अधिकतम पैदावार प्राप्त करने के लिए । immunohistochemistry द्वारा, hPGCLCs आसानी से लगभग सभी EBs में अपनी सतह पर विशेष रूप से OCT4 व्यक्त कोशिकाओं के रूप में पता चला रहे हैं । जब EBs enzymatically असंबद्ध और FACS संवर्धन के अधीन हैं, hPGCLCs CD38 + कोशिकाओं के रूप में 40-45% उपज के साथ एकत्र किया जा सकता है ।
मौलिक रोगाणु कोशिकाओं (PGCs) दोनों लिंगों में सभी germline कोशिकाओं के आम पुरोगामी हैं । स्तनधारी भ्रूण में PGCs के विकास पर हमारे ज्ञान के अधिकांश प्रयोगशाला चूहों1,2के अध्ययन के माध्यम से प्राप्त किया गया है । भ्रूण के दिन 6.0, माउस भ्रूण, 6 या इसी तरह की छोटी संख्या के PGC के अग्रदूतों में epiblast में स्थित हैं, और के एक संस्थापक जनसंख्या ~ ४० PGCs उन से एक हड्डी morphogenetic प्रोटीन पर निर्भर तरीके से प्रेरित कर रहे है Bmp2 और Bmp4 से सटे स्रावित कक्षों. जल्दी से जल्द मानव PGCs अब तक भ्रूण में पहचान3हमल के तीसरे सप्ताह के अंत में चारों ओर जर्दी थैली के endodermal दीवार पर थे । क्योंकि इस पलायन PGCs माउस भ्रूण में मनाया जाता है के रूप में एक ही स्थान है, यह संभव है कि मनाया मानव PGCs प्रवास के पथ पर नहीं बल्कि संस्थापक जनसंख्या में थे । हालांकि, PGCs या मानव भ्रूण में PGC अग्रदूतों के पहले के चरणों वापस अनुरेखण अध्ययन लापता हो गया है ।
मानव भ्रूण PGCs के लिए उपयोग दोनों तकनीकी और नैतिक बाधाओं के कारण चुनौतीपूर्ण है । इन बाधाओं को दूर करने के लिए PGC सेल कल्चर मॉडल्स को ह्यूमन pluripotent स्टेम सेल (पीएससी) से हाल ही में जेनरेट किया गया है । Pluripotency germline और तीन भ्रूण रोगाणु परतों4में अंतर करने के लिए सेलुलर क्षमता है । जबकि मानव पीएससी mTeSR1 माध्यम में बनाए रखा (एक तैयार करने के लिए उपयोग करते हैं, वाणिज्यिक उपलब्ध माध्यम प्राइम pluripotency राज्य में मानव पीएससी के रखरखाव के लिए तैयार) extracellular मैट्रिक्स प्रोटीन के साथ लेपित व्यंजन पर है प्राइम-स्टेट pluripotency 4, २०१३ में याकूब हैना की लैब से पता चला है कि प्राइम pluripotency कोशिकाओं को भोली pluripotency अवस्था में रूपांतरित कर भोले मानव स्टेम सेल मीडियम (NHSM) से प्रोटीन से युक्त केमिकल अवरोधक kinases ERK1/2, GSK3, JNK, रॉक, PKC, और p38 MAPK के साथ ही वृद्धि कारक लिफ, TGF, bFGF5. भोले-pluripotency मानव पीएससी से, २०१५ में हैना और अजीम सुरांनी के नेतृत्व में एक शोध समूह ने hPGCLCs6से मानव PGC की तरह कोशिकाओं (पीएससी) का पहला मजबूत उत्पादन पूरा किया । बाद में, हमारे सहित कई अंय प्रयोगशालाओं, पीएससी से थोड़ा अलग प्रोटोकॉल7,8,9,10का उपयोग कर hPGCLCs के उत्पादन की सूचना दी । हमारे अध्ययन सबूत प्रदान की है कि hPGCLCs विभिंन प्रोटोकॉल का उपयोग कर उत्पंन (जो हमारे पहले प्रकाशित अध्ययन के एस10तालिका में संक्षेप हैं) एक दूसरे10के समान transcriptomally हैं । उपलब्ध साक्ष्य प्रारंभिक चरण मानव भ्रूण PGCs करने के लिए मानव PGCLCs की समानता का समर्थन करता है से पहले वैश्विक epigenetic विलोपन7 और/या chemotactic माइग्रेशन10।
माउस भ्रूण PGCs, माउस PGCLCs, और मानव PGCLCs के अध्ययन (लेकिन मानव PGCs के लिए केवल बहुत ही सीमित उपयोग के साथ) से पता चला है कि PGC विनिर्देशन के आणविक तंत्र माउस और मानव1,6के बीच काफी अलग हैं, 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16 ,17. उदाहरण के लिए, Prdm14 माउस भ्रूण में PGC विनिर्देशन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, लेकिन मानव PGC विनिर्देशन में अपनी भूमिका1,15सीमित लगता है । इसके विपरीत, EOMESODERMIN द्वारा SOX17 की प्रेरण PGC विनिर्देश6,11,14के लिए आवश्यक है, जबकि इन प्रतिलेखन कारकों माउस PGC विनिर्देश15के लिए औषधालय लग रहे हैं । अध्ययन के इन प्रारंभिक उपलब्धियों का उपयोग hPGCLCs दृढ़ता से मानव भ्रूण PGCs के एक किराए के रूप में इस सेल संस्कृति मॉडल के महत्व का समर्थन ।
हाल ही में प्रकाशित अध्ययन, जीनोमिक डीएनए कॉपी संख्या विश्लेषण के हमारे लैब गहरी अनुक्रमण मूल्यांकन शामिल है, पता चला है कि भोली pluripotency राज्य में पीएससी के लंबे समय तक रखरखाव गुणसूत्र अस्थिरता के जोखिम को काफी बढ़ जाती है और संरचनात्मक विसंगतियों । यह घटना दोनों माउस18 और मानव19 पीएससी के साथ मनाया गया । हैना/सुरांनी द्वारा रिपोर्ट किए गए मूल hPGCLC उत्पादन प्रोटोकॉल को पीएससी में बनाए रखने के लिए विकसित किया गया था । मानव पीएससी और PGCLCs के सामान्य द्विगुणित कैरयोटाइप को संरक्षित करने के लिए हमने एक संशोधित प्रोटोकाल विकसित किया जिसमें मानव पीएससी केवल ७२ घंटे10के लिए 4i माध्यम के संपर्क में आ रहे हैं, जो इस लेख में प्रस्तुत है । प्राइम pluripotency राज्य के अंतर्गत मानव iPSCs (hiPSCs) बनाए रखे जाते हैं. तुरंत EB गठन से पहले, कोशिकाओं ४८ घंटे के लिए 4i भोली reprogramminging मध्यम (एक संशोधित NHSM माध्यम) में मशीन हैं । इसके बाद असंबद्ध और microwells में पैक किया जाता है जो 4i माध् यम में अतिरिक् त 24 घंटों के लिए EBs बनाते हैं । EBs hPGCLC प्रेरण माध्यम में बनाए रखा जाता है रिकॉमबिनेंट मानव BMP4 के एक उच्च एकाग्रता के लिए एक कमाल की हालत के तहत नहीं लगाव संस्कृति के लिए 8 दिनों के लिए hPGCLCs की अधिकतम उपज प्राप्त करने के लिए । 8 दिन EB संस्कृति के बाद, hPGCLCs असंबद्ध EB कोशिकाओं से FACS के रूप में CD38 + कोशिकाओं को FACS-sortable एकल सेल निलंबन में ~ ४०% उपज के साथ अलग किया जा सकता है । जबकि अन्य प्रकाशित तरीकों7,8,9, हमारे संशोधनों से पहले मूल प्रोटोकॉल सहित6, आम तौर पर विशिष्ट के बिना सहज रूप से गठित सेल समुच्चय में hPGCLCs उत्पन्न स्थानीयकरण, हमारे प्रोटोकॉल द्वारा उत्पादित hPGCLC embryoid निकायों (EBs) की सतह पर मनाया जाता है ।
hPGCLCs का मजबूत उत्पादन यहां वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग कर सामांय द्विगुणित कैरयोटाइप10के साथ मानव iPSCs के तीन स्वतंत्र क्लोन के साथ पुष्टि की गई । ये iPSC क्लोन एक ही मानव नवजात चमड़े की त्वचा fibroblast सेल संस्कृति10से प्राप्त किए गए थे । वे अनुरोध पर जांचकर्ताओं को इस लेख के लेखकों द्वारा प्रदान की जाएगी और उचित सामग्री हस्तांतरण समझौते और जमे हुए रहते मानव कोशिकाओं के शिपिंग व्यवस्था के तहत । यह वर्तमान में है कि सामांय कैरयोटाइप मजबूत hPGCLC उत्पादन के लिए हमारे प्रोटोकॉल या अंय प्रयोगशालाओं द्वारा सूचित उन का उपयोग करने के लिए आवश्यक है के रूप में अज्ञात है ।
हाल के अध्ययनों से पता चला है कि hiPSCs11 या ESCs14 से hPGCLCs का उत्पादन क्योटो विश्वविद्यालय8 के Saitou समूह द्वारा वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग EOMESODERMIN की अभिव्यक्ति पर निर्भर है, एक टी बॉक्स प्रतिलेखन के लिए आवश्यक कारक SOX17 की प्रेरण । SOX17 को मास्टर वंश मानव pluripotent स्टेम सेल6के germline भेदभाव में प्रतिलेखन कारक का निर्धारण के रूप में कार्य करने लगता है । EOMESODERMIN EOMES जीन द्वारा इनकोडिंग है, और CRISPR/EOMES के Cas9 नॉकआउट की वजह से SOX17 में प्रेरण के लगभग पूरा अभाव hPGCLC उत्पादन की स्थिति11, और अंय जीनों की अभिव्यक्ति का एक ही पैटर्न के बाद SOX17-अशक्त पीटकर कोशिकाओं । hPGCLC प्रेरण संस्कृति के दौरान EOMES-नल नॉकआउट कोशिकाओं में एक inducible वेक्टर से EOMESODERMIN का इजहार कुशलतापूर्वक hPGCLC सहित germline जीन की प्रेरण के रूप में अच्छी तरह से मजबूत SOX17 उत्पादन को बचाया । इसके विपरीत, प्रेरित SOX17 भी मजबूत PGCLC उत्पादन बचाया लेकिन EOMES उत्प्रेरण के बिना । इस प्रकार, EOMESODERMIN SOX17 के एक महत्वपूर्ण नदी के ऊपर उत्प्रेरण है, और यह मानव pluripotent स्टेम कोशिकाओं से hPGCLC प्रेरण में EOMESODERMIN की सबसे महत्वपूर्ण भूमिका है । हमारे प्रोटोकॉल hiPSCs10में SOX17 लाती है, लेकिन EOMESODERMINE प्रेरण पर अपनी निर्भरता के लिए निर्धारित होने का इंतजार कर रहा है ।
यह प्रोटोकॉल प्राइमेड धर्मांतरित-pluripotency ह्यूमन iPSCs को mTeSR1 मीडियम में बनाए रखने के लिए ERK-इंडिपेंडेंट भोली pluripotency को 4i reprogramminging मीडियम6में ९६ घंटे के लिए रखा गया है, जो एक संशोधित भोली मानव स्टेम सेल मीडियम (NHSM)5है । हमारा प्रयास वही मानव iPSC क्लोन के साथ शुरू hPGCLCs उत्पंन करने के लिए, लेकिन अंय व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मानव iPSC विकास मीडिया में बनाए रखने से पहले इस 4i reprogramminging मध्यम कम hPGCLC पैदावार की डिग्री बदलती में हुई । हालांकि अब चाहे दूसरे मीडिया में अवधि के अनुकूलन hPGCLC उत्पादन में सुधार या नहीं रहता है भविष्य के अध्ययन में निर्धारित किया जाना है, इस अवलोकन से पता चलता है कि मानव iPSCs के प्राइमेड pluripotency की सटीक स्थिति से पहले 4i reprogramminging काफी hPGCLC माध्यम में 4i माध् यम और EB विभेद में EB गठन पर प्रभाव डालता है ।
hiPSCs से hPGCLCs का उत्पादन हमारे प्रोटोकॉल निंनलिखित मजबूत और उच्च reproducible है, आंशिक रूप से microwell प्लेटों के उपयोग के कारण है कि EBs की एक बड़ी संख्या के कुशल उत्पादन सक्षम (~ ८,००० EBs प्रति बैच) एक समान आकार के साथ (३,००० hiPSCs प्रति EB) । EBs की संख्या आसानी से प्रयोग के एक बैच में हमारे प्रोटोकॉल का उपयोग कर का उत्पादन अभी तक नियमित रूप से U-नीचे सेल संस्कृति कुओं का उपयोग कर तरीकों से बड़ा हो सकता है । समान रूप से hPGCLCs के साथ जड़ी EBs आकार की एक बड़ी संख्या का उत्पादन उच्च प्रवाह रासायनिक प्रदर्शन के अद्वितीय अवसर प्रदान करने के लिए छोटे आणविक वजन उत्प्रेरक या अवरोधकों को प्रभावित करने की पहचान कर सकते है PGC विनिर्देश या उनके epigenetic reprogramminging जैसे जैविक विशेषताओं । इस तरह के EBs भी germline सेल विषालु की बड़ी संख्या के विषाक्तता आकलन के लिए उपयोगी हो सकता है, न केवल पर्यावरण प्रदूषण सहित, लेकिन यह भी नैदानिक रूप से निर्धारित दवाओं कीमोथेरेपी एजेंटों के रूप में ।
प्रस्तुत प्रोटोकॉल का उपयोग hPGCLCs के मजबूत और reproducible उत्पादन के महत्वपूर्ण कारकों में शामिल हैं (i) extracellular मैट्रिक्स प्रोटीन पर mTeSR1 में बनाए रखा स्वस्थ hiPSCs का उपयोग, (ii) निर्दिष्ट और कड़ाई के रूप में कोशिकाओं की सही संख्या inoculate करने के लिए मध्यम परिवर्तन और उपसंस्कृति के समय का पालन करें, (iii) मानव रिकॉमबिनेंट BMP4 का एक अच्छा बहुत का चयन करने के लिए, और (iv) रॉकिंग संस्कृति के दौरान EBs की शारीरिक क्षति को कम करने के लिए । यह हमारा अनुभव है कि BMP4 रिएजेंट का सबसे अच्छा बहुत BMP4 पुनर्अभिकर्ताओं के अंय बहुत जबकि 2x या अधिक से अधिक खुराक की आवश्यकता १०० एनजी/ दूसरी ओर, hPGCLCs उत्पादन की उपज BMP4 की सबसे अच्छी जगह का उपयोग कर के बजाय BMP4 की उच्च खुराक में कमी आई (जैसे, २०० एनजी/ हम रिकॉमबिनेंट मानव BMP4 hPGCLC पीढ़ी के समर्थन में अपने प्रदर्शन के लिए कई विक्रेताओं से प्राप्त की और सबसे अच्छा बहुत की एक बड़ी राशि सुरक्षित एजेंट के कई अलग बहुत परीक्षण करने की सलाह देते हैं ।
हमारे hPGCLC प्रोटोकॉल की एक अनूठी विशेषता है कि hPGCLCs EBs10 (चित्रा 8) के सबसे बाहरी सतह परत पर स्थानीयकृत कर रहे हैं, जबकि अन्य प्रोटोकॉल सेल एग्रीगेट6,8के बीच में hPGCLCs उत्पन्न कर सकते हैं । Embryoid निकायों ऐसी सतह के रूप में कई अलग परतों के रूप में करते हैं, बाहरी कवच, भीतरी खोल, और कोर, और केंद्रीय कोर क्षेत्रों अक्सर पोषक तत्वों की सीमित आपूर्ति के कारण, ऑक्सीजन, के रूप में अच्छी तरह के रूप में प्रो-जीवित विकास कारकों संस्कृति फार्म प्रदान की जाती है माध्यम फैलाना20. EBs के केंद्र की ओर सीमित प्रसार के कारण संभव प्रतिबंधों के बिना EBs की सतह पर hPGCLCs का स्थानीयकरण प्रत्यक्ष, समय और खुराक के लिए फायदेमंद हो सकता है hPGCLCs की दवाओं या औषधीय पदार्थों के लिए जोखिम नियंत्रित या विषाक्तता अध्ययन ।
जबकि माउस PGCLCs दिखाने के मजबूत जीनोम-वाइड डीएनए विमुद्रण नियंत्रण क्षेत्रों को शामिल कम आंशिक रूप से7,19,20, hPGCLCs में वैश्विक gDNA के स्तर की डिग्री के लिए माउस से कमजोर लगता है PGCLCS या PGCs6,7. Transcriptomal प्रोफ़ाइल hPGCLCs माउस PGCLCs10से भ्रूण PGCs की एक पूर्व अवस्था के समान हो सकता है कि सुझाव है । यह बताया गया है कि hPGCLC उत्पादन की स्थिति के तहत EBs की लंबे समय तक संस्कृति gDNA के एक वृद्धि की डिग्री के कारण7; तथापि, चाहे EBs में hPGCLCs की संस्कृति की एक विस्तारित अवधि या अलग कोशिकाओं के रूप में germline भेदभाव के अधिक उंनत चरणों को प्राप्त कर सकते है भविष्य के अध्ययन के द्वारा निर्धारित की जरूरत है ।
The authors have nothing to disclose.
हम प्रारंभिक अध्ययन के दौरान तकनीकी सहायता के लिए शिओमी Yawata और ची Owa स्वीकार करते हैं. इस अध्ययन NIEHS/NIH अनुदान R01 ES023316 और R21ES024861 द्वारा टीएस के लिए, और उड़ान परिचर चिकित्सा अनुसंधान संस्थान (FAMRI) अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था JHH ।
Primed pluripotency hiPSC culture | |||
Matrigel | Corning | 354277 | Aliquot Matrigel at the volume indicated by the manufacturer (about 200 μL). Use cold tubes. Store at -80 °C |
DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 21041-025 | Store at 4 °C. |
mTeSR1 | STEMCELL Technologies | 85850 | Reconstitute by adding 5X Supplement to Basal Medium. The reconstituted medium can be stored at 4 °C for up to 4 weeks without affecting cell culture performance. |
Y27632 | Axon | 1683 | Dilute 5 mg Y27632 (MW 320.26) with 312.2 μL water to prepare 50 mM Y27632 stock solution. Sterilize by filtration (0.22 μm). Aliquot 20 μL/tube x 15 tubes and store at -20 °C. |
CryoStor CS10 | STEMCELL Technologies | 07930 | Store at 4 °C. |
Accutase | Innovative cell technologies | AT104-500 | Cell dissociation enzyme; aliquot 40 mL/tube x 12 tubes and store at -20 °C. |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
4i hiPSC culture | |||
KnockOut DMEM | Thermo Fisher Scientific | A1286101 | |
KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | Aliquot 40 mL/tube x 12 tubes and store at -20 °C. |
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x) | Thermo Fisher Scientific | 10378016 | |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Thermo Fisher Scientific | 11140050 | |
Insulin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | I1882-100MG | Add 0.1 mL glacial acetic acid to 10 mL water. Sterilize by filtration (0.22 um). Dilute 100 mg insulin lyophilized powder with cold 10 mL the acidified water to make 10 mg/mL stock solution. Aliquot 650 μL/tube x 15 tubes and store at -80 °C. |
human LIF | PeproTech | 300-05 | Reconstitute 250 μg human LIF with 250 μL water. Add 750 μL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 250 μg/mL human LIF stock solution. Specific activity of this product is >10,000 units/μg. Aliquot 40 ul/tube x 25 tubes and store at -80 °C. |
human FGF2 | R&D Systems | 4114-TC | Reconstitute 1 mg human FGF2 with 5 mL PBS(-) to make 200 μg/mL human FGF2 stock solution. Aliquot 100 μL/tube x 50 tubes and store at -80 °C. |
human TGF-β1 | PeproTech | 100-21 | Reconstitite 50 μg with 50 μL of 10 mM Citric Acid (pH 3.0). Add 150 μL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 250 μg/mL human TGF-β1 stock solution. Aliquot 4 μL/tube x 50 tubes and store at -80 °C. |
4i basal medium | Mix the following reagents to make 4i basal medium. 500 mL of KnockOut DMEM 100 mL of KnockOut Serum Replacement 6 mL of Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x) 6 mL of MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) 650 µL of 10 mg/mL Insulin from bovine pancreas 40 µL of 250 µg/mL human LIF 20 µl of 200 µg/ml human FGF2 4 µl of 250 µg/ml human TGF-β1 Aliquots 40 ml/tube and store at -80 °C. |
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CHIR99021 | Axon | 1386 | Reconstitute 25 mg CHIR99021 (MW 465.34) with 1791 μL DMSO to make 30 mM CHIR99021 stock solution. Aliquot 50 μL/tube x 35 tubes and store at -20 °C. |
PD0325901 | Axon | 1408 | Reconstitute 5 mg PD0325901 (MW 482.19) with 1037 μL DMSO to make 10 mM PD0325901 stock solution. Aliquot 50 μL/tube x 20 tubes and store at -20 °C. |
BIRB796 | Axon | 1358 | Reconstitute 10 mg BIRB796 (MW 527.66) with 948 μL DMSO to make 20 mM BIRB796 stock solution. Aliquot 50 μL/tube x 18 tubes and store at -20 °C. |
SP600125 | Tocris | 1496 | Reconstitute 10 mg SP600125 (MW220.23) with 908 μL DMSO to make 50 mM SP600125 stock solution. Aliquot 50 μL/tube x 18 tubes and store at -20 °C. |
AggreWell400 | STEMCELL Technologies | 27845 | Microwell plate |
Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | Reconstitute 5 g Pluronic F-127 in 100 mL water to make 5%(w/v) Pluronic F127 stock solution. Sterilize by filtration (0.22 um). Aliqout 50 mL/tube x 2 tubes and store at r.t. |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
hPGCLC culture | |||
Glasgow’s MEM | Thermo Fisher Scientific | 11710035 | |
Sodium pyruvate (100 mM) | Thermo Fisher Scientific | 11360070 | |
Penicillin-Streptomycin (100x) | Corning | 30-002-CI | |
hPGCLC basal medium | Mix the following reagents to make hPGCLC basal medium. 500 mL of Glasgow’s MEM 75 mL of KnockOut Serum Replacement 6 mL of MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) 6 mL of 100 mM Sodium pyruvate 6 mL of Penicillin-Streptomycin (x100) Aliquots 40 mL/tube and store at -20 °C. |
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2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | Dilute 350 μL 2-Mercaptoethanol (14.3 M) in 9.65 mL PBS(-) to make 500 mM 2-Mercaptoethanol stock solution . Store at 4 °C. |
L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | Reconstitute 400 mg L-Ascorbic acid with 20 mL water to make 20 mg/mL L-Ascorbic acid stock solution. Sterilize by filtration (0.22 um). Aliquot 500 μL/tube x 40 tubes and store at -20 °C. |
Recombinant human BMP4 | R&D Systems | 314-BP | Reconstitute 1 mg recombinant human BMP4 with 10 mL of 4mM HCl aq. to make 100 μg/mL recombinant human BMP4 stock solution. Aliquot 250 μL/tube x 40 tubes and store at -80 °C. |
Human SCF | PeproTech | 300-07 | Reconstitute 250 μg human SCF with 500 μL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 500 μg/mL human SCF stock solution. Aliquot 35 μL/tube x 14 tubes and store at -80 °C. |
Human EGF | PeproTech | AF-100-15 | Reconstitute 1 mg human EGF with 1 mL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 1 mg/mL human EGF stock solution. Aliqot 100 μL/tube x 10 tubes. Dilute 100 μL of 1 mg/ml human EGF stock solution with 300 μL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 250 μg/mL humanEGF stock solution. Aliquot 20 μL/tube x 20 tubes. Store at -80 °C. |
Cell strainer | Corning | 352340 | Pore size = 40 μm. |
50 ml polypropylene conical tube | Corning | 352070 | |
Low attachment plate | Corning | 3471 | |
Vari-Mix Platform Rocker | Thermofisher | M79735Q | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Immunohistochemical staining | |||
BLOXALL Blocking Solution | VECTOR | SP-6000 | |
Normal Horse serum ImmPRESS Reagent Anti-Goat IgG |
VECTOR | MP-7405 | |
OCT-3/4 Antibody | Santa Cruz | SC-8629 | |
ImmPACT DAB | VECTOR | SK-4105 | |
Permount | Thermofisher | SP15-100 | Mounting medium |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Isolating hPGCLC | |||
Embryoid Body Dissociation Kit | Miltenyi Biotec | 130-096-348 | |
Anti-CD38 antibody conjugated to APC | abcam | ab134399 |