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Developmental Biology

Génération de cellules humaines de ressemblant cellules germinales primordiales à la Surface du corps embryoïdes de pluripotence amorcée induite par les cellules souches pluripotentes

Published: January 11, 2019 doi: 10.3791/58297
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1
1Center for Cancer Research, Massachusetts General Hospital, 2Department of Molecular Genetics, Weizmann Institute of Science

Summary

Les cellules germinales primordiales (PGC) sont des précurseurs communs du sperme et des œufs. PGC embryonnaires humaines est spécifiées de pluripotentes épiblaste grâce à des interactions des cytokines. Nous décrivons ici un protocole 13 jours d’induire les cellules humaines transcriptomally ressemblant à des PGC à la surface du corps embryoïdes d’apprêté-induite la pluripotence des cellules souches pluripotentes.

Abstract

Les cellules germinales primordiales (PGC) sont des précurseurs communs de toutes les cellules de la lignée germinale. Chez les embryons de souris, une population fondatrice de ~ 40 PGC sont induits des cellules pluripotentes épiblaste par exposition orchestrée aux cytokines, dont la protéine morphogénétique osseuse 4 (Bmp4). Sur les embryons humains, le PGC plus tôt ont été identifiés sur la paroi endodermique du sac vitellin vers la fin de la semaine 3rd de la gestation, mais on connaît mal le processus de spécification du PGC humaine et leur développement précoce. Afin de contourner les barrières techniques et éthiques d’étudier le PGC embryonnaires humaines, modèles de culture de cellules porteuses ont été récemment générés à partir de cellules souches pluripotentes. Nous décrivons ici un protocole de 13 jours pour une production robuste de cellules humaines de PGC-Like (hPGCLCs). Les cellules souches humaines pluripotentes induites (hiPSCs) maintenus dans l’état de pluripotence apprêtée sont incubées dans les naïfs 4i reprogrammation moyen pendant 48 heures, monocellules se dissociés et emballés dans des micropuits. Maintenance prolongée de hiPSCs dans l’état de pluripotence naïf provoque des aberrations chromosomiques importantes et devrait être évité. hiPSCs dans les puits sont maintenues pour supplémentaires 24 heures dans le milieu de 4i à corps embryoïdes forme (EBs), qui sont ensuite cultivées en basse-respect des ustensiles en plastique sous une condition bascule dans le milieu de l’induction de hPGCLC contenant une forte concentration de BMP4 humaine recombinante. EBs sont ensuite mis en culture pendant 8 jours dans l’état bascule, non adhérents d’obtenir des rendements maximaux de hPGCLCs. Par immunohistochimie, les hPGCLCs sont facilement détectés comme cellules exprimant fortement OCT4 dans presque tous les EBs exclusivement sur leur surface. Lorsque EBs sont enzymatiquement dissociées et soumis à l’enrichissement de FACS, hPGCLCs peuvent être collectées comme cellules CD38 + jusqu'à 40-45 % rendement.

Introduction

Les cellules germinales primordiales (PGC) sont des précurseurs communs de toutes les cellules de la lignée germinale chez les deux sexes. La plupart de nos connaissances sur le développement de PGC dans des embryons de mammifères a été obtenue grâce à l’étude des souris de laboratoire1,2. À jour embryonnaire 6,0 à 6,5 des embryons de souris, 6 ou même de petits nombres de précurseurs PGC sont situés dans l’épiblaste et une population fondatrice de ~ 40 que PGC est induites d’eux d’une manière dépendante de protéines morphogénétiques osseuses Bmp2 et Bmp4 sécrétée par adjacentes cellules. Les premiers PGC humaine jusqu'à présent identifié chez les embryons était sur le mur endodermique du sac vitellin à vers la fin de la troisième semaine de gestation3. Parce que c’est au même endroit que la migration PGC est observées chez des embryons de souris, il est probable que le PGC humains observés était sur le chemin de migration, mais pas la population fondatrice. Toutefois, des études remontant des stades antérieurs du PGC ou PGC précurseurs sur les embryons humains ont disparu.

Accès au PGC embryonnaire humaine est difficile en raison d’obstacles techniques et éthiques. Pour surmonter ces obstacles, modèles de culture de cellules PGC ont été récemment générées à partir des cellules souches pluripotentes humaines (PSC). La pluripotence est la capacité cellulaire à se différencier en la lignée germinale et trois couches de germe embryonnaires4. Alors que la PSC humaine maintenue dans le milieu de mTeSR1 (un milieu prêt à l’emploi, disponible dans le commerce formulé pour l’entretien de PSC humaine dans l’état de pluripotence apprêté) sur plats revêtus de la protéine de la matrice extracellulaire ont apprêté-état pluripotence 4, en 2013, laboratoire de Jacob Hanna a montré que les cellules de pluripotence apprêté peuvent être convertis en un état de pluripotence naïve en exposant au milieu de cellules souches humaines naïves (NHSM) contenant des inhibiteurs chimiques aux protéines kinases ERK1/2 GSK3, JNK, ROCK, PKC, et p38 MAPK ainsi que les facteurs de croissance FRV, TGF, bFGF5. De la PSC humaine naïve-pluripotence, en 2015, un groupe de recherche dirigé par Hanna et Azim Surani a accompli la première production robuste de cellules humaines de PGC-Like (hPGCLCs) du PSC6. Plus tard, plusieurs autres laboratoires, y compris la nôtre, a signalé de génération de hPGCLCs de PSC en utilisant légèrement différents protocoles7,8,9,10. Notre étude a prouvé que hPGCLCs générés à l’aide de différents protocoles (qui sont résumées dans le tableau S1 de notre étude précédemment publiée10) sont transcriptomally semblable à l’autre10. Éléments de preuve disponibles soutient la ressemblance des humains PGCLCs au début des PGC embryonnaires humaines avant l’effacement épigénétique global7 et/ou migration chimiotactique10.

Études de souris embryonnaires PGC, souris PGCLCs et PGCLCs humains (mais avec seulement un accès très limité aux PGC humaine) ont révélé que les mécanismes moléculaires de la spécification du PGC diffèrent sensiblement entre les souris et les humains1,6, 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16 ,,17. Par exemple, Prdm14 joue un rôle crucial dans la spécification de PGC dans des embryons de souris, mais son rôle dans la spécification du PGC humaine semble limitée1,15. En revanche, l’induction de SOX17 par EOMESODERMIN est essentielle pour PGC spécification6,11,14, alors que ces facteurs de transcription semblent dispensables pour souris PGC spécification15. Ces réalisations initiales des études utilisant la hPGCLCs fortement confirment l’importance de ce modèle de culture cellulaire comme substitut du PGC embryonnaires humaines.

Des études publiées récemment, impliquant l’évaluation de séquençage en profondeur de notre laboratoire d’ADN copie numéro l’analyse génomique, ont montré que maintenance prolongée de PSC dans l’état de pluripotence naïf augmente considérablement le risque d’une instabilité chromosomique et anomalies structurales. Ce phénomène a été observé avec les deux souris18 et humaine19 PSC. Le protocole initial de production de hPGCLC rapporté par Hanna/Surani a été développé pour PSC humaine maintenus dans le milieu de la pluripotence 4i naïf au moins 2 semaines,6. Afin de préserver le caryotype diploïde normal de la PSC et PGCLCs, nous avons développé un protocole modifié dans lequel PSC humains est exposés au milieu de 4i pour seulement 72 heures10, qui est présenté dans cet article. CISP humaine (hiPSCs) est maintenues en vertu de l’état de pluripotence apprêtée. Immédiatement avant la formation de EB, les cellules sont incubées dans le milieu de reprogrammation de naïf de 4i (un milieu modifié de NHSM) pendant 48 heures. Les cellules sont alors dissociées et emballés dans des micropuits de forme EBs pour 24 heures supplémentaires dans le milieu de 4i. EBs sont maintenus dans un milieu d’induction hPGCLC contenant une forte concentration de recombinant BMP4 humaine condition bascule pour la culture de la non-pièce jointe jusqu'à 8 jours pour obtenir le rendement maximal de hPGCLCs. Après la culture EB 8 jours, hPGCLCs peuvent être isolés des cellules dissociées de EB de FACS, en tant que cellules CD38 + jusqu'à environ 40 % en FACS-sortable suspension monocellulaire. Alors que l’autre publié méthodes7,8,9, y compris le protocole initial avant nos modifications6, génèrent habituellement de hPGCLCs dans les agrégats de cellules spontanément formé sans spécifiques localisation, hPGCLC produite par notre protocole sont observées à la surface du corps embryoïdes (EBs).

Protocol

1. cellules Culture de hiPSCs dans l’état de pluripotence Primed

  1. Préparation de plats enduit de protéines de la matrice extracellulaire
    1. Décongeler le Matrigel (protéine de la matrice extracellulaire) sur la glace dans un réfrigérateur ou une chambre froide pendant la nuit (ne pas dégeler à température ambiante ou à l’aide d’un bain d’eau chaude). Protéine de la matrice aliquote (~ 200 μL ; le volume de l’aliquote est déterminé par le fabricant pour chaque lot et indiqué sur l’étiquette du flacon) dans des tubes à centrifuger de basse-bind stérile ou tubes de cryoconservation de cellules sur la glace. Il est important de garder les protéines de la matrice extracellulaire glacée durant la distribution afin d’éviter la solidification. Stocker les aliquotes à-80 ° C.
    2. Pour enrober la cellule en plastique pétri avec les protéines de la matrice extracellulaire, diluer une aliquote avec 25 mL glacée DMEM/F12 et propagation à trois plats de 10 cm (environ 8 mL/boîte). Incuber les plats à température ambiante pendant au moins 1 heure. Après le revêtement, plats peuvent être scellés à l’aide de Parafilm et conserver à température ambiante jusqu'à une semaine.
    3. Aspirer le moyen de vaisselle immédiatement avant l’inoculation de pluripotence apprêté hiPSCs. Il n’est pas nécessaire de laver la vaisselle couchée avec support ou une solution saline tamponnée au phosphate sans calcium/magnésium [PBS(-)].
  2. Initiation de la culture de hiPSC dans l’état de pluripotence apprêté
    1. Ajouter 2 µL de 50 mM Y27632 [inhibiteur de la protéine associée à Rho kinase (ROCK)] dans 10 mL de milieu de mTeSR1 dans un tube à centrifuger de 15 mL. Préparer deux tubes de ROCK additionnés d’inhibiteur de 10 mL de milieu d’ouvrir la culture de cellules dans un plat de 10 cm de 1 mL congelé stock cellulaire. Utiliser Y27632-complété le même jour. Préchauffer le milieu additionné de Y27632 dans un bain-marie à 37 ° C pendant 5 min.
      Remarque : Ce protocole fonctionne bien avec hiPSCs maintenu en mTeSR1. Lorsque hiPSCs sont maintenues dans d’autres médias soutenant la croissance humaine CFP avec différents degrés d’apprêté ou naïf pluripotence, rendement de hPGCLCs peut-être varier considérablement.
      Remarque : La durée de conservation de mTeSR1 complet est 2 semaines à 4 ° C et 6 mois à-20 ° C, mais re-congélation causes mauvaise performance. Nous gelons 40 ml de mTeSR1 à-20 ° C jusqu'à l’utilisation.
    2. Décongeler un flacon de pluripotence apprêté hiPSC congelés stock (1,0 à 3,0 x 106 cellules dans 1 mL de milieu de cryoconservation) à l’aide d’un bain-marie à 37 ° C. Immédiatement après l’achèvement de la fonte, transférer tout le contenu d’un flacon dans un tube (10 mL) de préchauffée milieu additionné de Y27632.
    3. Suspension de cellules de centrifugeuse à température ambiante, 300 x g pour 8 min. jeter le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire 10 ml préchauffé additionné de Y27632 de l’autre tube.
    4. Étendre uniformément la suspension cellulaire dans un plat de 10 cm de protéine-enduit matrice extracellulaire. Placer le plat dans un incubateur à CO tri-gaz2 (37 ° C, 6,5 % O2, 5 % de CO2). Maintenir la culture hiPSC sous une pression de faible teneur en oxygène.
    5. Moyen de changement (mTeSR1 sans Y27632) tous les jours. L’inhibiteur de la roche (Y27632) est critique pour la survie de hiPSC immédiatement après la dissociation en cellules individuelles. Une fois que hiPSCs adhérer sur la surface d’enduit de protéine de matrice extracellulaire comme répartis uniformément petits agrégats avec > confluence de 10 % (ce qui est généralement réalisé dans les 16 heures après l’inoculation), Y27632 est dispensable. Changement médiatique trop tôt après l’inoculation de dissocié hiPSCs sans Y27632 peut provoquer la mort cellulaire presque complète.
  3. Passaging amorcée pluripotence hiPSCs
    Remarque : Passage amorcée pluripotence hiPSCs lorsque les colonies occupent environ 80 % de la surface de croissance efficace. Les densités et les procédures de passage corrects est important pour la reproductibilité expérimentale. Nous avons vu que l’efficacité de l’induction de hPGCLC n’est pas significativement différente entre les cultures de hiPSC 6 jours après le début d’un stock congelé (impliquant un ou deux passages) ou d’un mois (impliquant > 10 passages). Induction de hPGCLC a été effectuée avec succès de hiPSCs maintenue pendant plus de deux mois, même si l’efficacité n’a pas été évaluée quantitativement.
    1. Prenez 4 mL de mélange d’enzymes dissociation cellulaire dans un tube à centrifuger de 15 mL et est proportionnelle à la température ambiante pendant 5 min.
    2. Préchauffer 10 mL PBS(-) dans une centrifugeuse 15 mL tube depuis > 5 min à 37 ° C dans un bain d’eau.
    3. Ajouter 2 µL de 50 mM Y27632 (inhibiteur de la roche) au milieu de mTeSR1 de 10 mL dans un tube à centrifuger de 15 mL. Préparer deux tubes du milieu ROCK additionnés d’inhibiteur de 10 mL et utiliser dans la même journée. Dans un autre tube à centrifuger de 15 mL, prendre 5 mL mTeSR1 sans ajouter Y27632. Préchauffer la moyenne +/-Y27632 dans un bain-marie à 37 ° C pendant 5 min.
      Note : Tous les aliquotes moyens établis à l’étape 1.3.3 peuvent contenir Y27632.
    4. Aspirer le vieux moyen d’a 10 cm plat et rincer les cellules une fois avec préchauffée 10 mL PBS(-). Jeter les PBS(-) et ajouter 4 mL d’enzyme de dissociation au plat. Placer le plat dans un incubateur à CO2 (incubateur de tri-gaz fonctionne, mais pas nécessaire) de ~ 4 min jusqu'à ce que les cellules se détachent du fond. Doucement les cellules de pipette up et down pour faire suspension monocellulaire.
    5. Transférer suspension monocellulaire hiPSC au tube préchauffée contenant 5 mL de milieu sans Y27632 (volume total dans un tube de 15 mL est d’environ 9 mL). Centrifuger la suspension de cellules à température ambiante, 300 x g pendant 8 min.
    6. Jeter le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire avec 10 mL de milieu moyen préchauffée contenant Y27632.
    7. Enlever des agrégats cellulaires à l’aide d’une passoire de cellule de 40 µm et déterminer la densité des cellules en utilisant un compteur Coulter.
    8. Diluer la suspension cellulaire avec préchauffée milieu additionné de Y27632 pour atteindre 3,0 x 106 cellules dans 10 mL d’inoculer un plat de 10 cm enduit de protéines de la matrice extracellulaire. Placer la capsule inoculée dans un incubateur à CO tri-gaz2 (37 ° C, 6,5 % O2, 5 % de CO2).
    9. Moyen de changement (mTeSR1 sans Y27632) tous les jours.

2. génération de hPGCLCs

Remarque : Effectuer les étapes suivantes lorsqu’hiPSC cellules dans un plat de 10 cm (moyenne mTeSR1, enduit de protéines de la matrice extracellulaire) atteint à la confluence de ~ 80 % (environ 107 cellules).

  1. Préparation de plats d’enduit de protéines de la matrice extracellulaire (jour 1)
    1. Décongeler une aliquote de protéine de la matrice extracellulaire sur la glace et diluer 25 mL de DMEM glacee/F12.
    2. Verser les protéine de la matrice extracellulaire diluée à 6 plats (1 mL/puits). Une aliquote est suffisante pour recouvrir les 24 puits (4 plaques). Incuber les plaques à température ambiante pendant au moins 1 heure. Plaques revêtues inutilisés peuvent être scellés et conserver à température ambiante jusqu'à une semaine.
    3. Aspirer le milieu à partir de plaques immédiatement avant l’inoculation de pluripotence apprêté hiPSCs. Il n’est pas nécessaire de laver la vaisselle couchée avec support ou PBS(-).
  2. Inoculation de pluripotence apprêté hiPSCs en plaques d’enduit de protéines de la matrice extracellulaire (jour 1)
    1. Prenez 4 mL d’enzyme de dissociation cellulaire dans un tube à centrifuger de 15 mL et est proportionnelle à la température ambiante pendant 5 min.
    2. Préchauffer 10 mL PBS(-) dans une centrifugeuse 15 mL tube depuis > 5 min à 37 ° C dans un bain d’eau.
    3. Ajouter 7 µL de 50 mM Y27632 (inhibiteur de la roche) dans 35 mL de milieu de mTeSR1 dans un tube à centrifuger de 50 mL. Utiliser Y27632-complétée dans la même journée. Faire deux tubes pour total 70 mL milieu supplémenté Y27632 et préchauffer le milieu dans un bain-marie à 37 ° C pendant 15 min.
    4. Aspirer le vieux moyen d’a 10 cm plat et rincer les cellules une fois avec préchauffée 10 mL PBS(-). Jeter les PBS(-) et ajouter 4 mL d’enzyme de dissociation cellulaire au plat. Placer le plat dans un incubateur à CO2 (incubateur de tri-gaz fonctionne, mais pas nécessaire) de ~ 4 min jusqu'à ce que les cellules se détachent du fond. Doucement les cellules de pipette up et down pour faire suspension monocellulaire.
    5. Transférer suspension monocellulaire hiPSC au préchauffée tube contenant 10 mL de milieu additionné de Y27632. Centrifuger la suspension de cellules à température ambiante, 300 x g pendant 8 min.
    6. Jeter le surnageant et resuspendre le culot cellulaire avec 10 mL de milieu de Y27632-complétée préchauffée.
    7. Filtrer sur un tamis de cellule (taille de pore de 40 µm) pour enlever des agrégats cellulaires et de compter les cellules en utilisant un compteur Coulter suspension cellulaire.
    8. Diluer la suspension monocellulaire hiPSC à 5,0 x 106 cellules dans un milieu additionné de Y27632 préchauffée 50 mL.
    9. Ensemencer la suspension de cellules de 2 mL (2,0 x 105 cellules) dans chaque puits des plaques 6 puits couchés (4 plaques, 24 puits). Assurez-vous que les cellules sont réparties uniformément dans chaque puits. Placer les plaques de culture cellulaire dans une étuve à2 tri-gas CO (37 ° C, 6,5 % O2, 5 % de CO2).
      Remarque : La densité cellulaire inoculum et la répartition homogène dans chaque bien est essentiel. Parce que l’inoculation de la hiPSCs dans des plats de 10 cm peut provoquer la densité cellulaire nettement plus élevée que d’autres régions. Même la densité cellulaire de cellules individuelles hiPSCs peut être atteint plus facilement avec plaques 6 puits.
    10. Changer le milieu avec 2 mL/puits mTeSR1 (sans Y27632) à 24 heures après l’inoculation.
  3. Conversion de la pluripotence apprêtée état hiPSCs aux cellules pluripotentes 4i-naïf (ERK-indépendant) (jour 3 et jour 4)
    1. Préparer 4i naïf complet pluripotence milieu dans un tube à centrifuger de 50 mL comme suit (jour 3 et jour 4) : 50 mL de milieu basal 4i, 5 µL de 30 mM CHIR99021, 5 µL de 10 mM PD0325901, 5 µL de 20 mM BIRB796, 5 µL de 50 mM SP600125 et 5 µL de 50 mM Y27632.
      Remarque : Magasin 4i milieu basal à-80 ° C et décongélation au réfrigérateur toute la nuit. Préparer le milieu complet 4i frais immédiatement avant l’emploi. Éviter l’exposition des produits chimiques 4i (CHIR, PD, BIRB et SP) à une forte lumière. Ne stockez pas de 4i complet moyen à 4 ° C ou congelé pendant une nuit ou plus.
    2. Milieu complet de chaud 50 mL 4i dans un lot d’eau de 37 ° C pour 15 min. moyen de changement avec préchauffé 4i milieu complet (2 mL/puits) à 48 et 72 heures après l’inoculation. Timing des changement médiatique est important de parvenir à rendement élevé de hPGCLC et la reproductibilité expérimentale.
      Remarque : La densité de la culture de hiPSC 4i est élevée dans ces conditions et devenir confluente à 48-72 heures après l’inoculation, mais c’est normal.
  4. Formation EB à l’aide de plaques microwell (jour 5)
    1. Préparation de 50 mL de milieu complet 4i dans un tube à centrifuger de 50 mL et il préchauffer dans un bain d’eau de 37 ° C pendant environ 15 min avant utilisation.
    2. Réchauffer au préalable les 35 mL DMEM/F12 dans un tube à centrifuger de 50 mL dans un bain d’eau de 37 ° C pendant environ 15 min avant utilisation.
    3. Préparer une plaque de microtitration
      1. Ajoutez 5 % (p/v) stérilisée par filtration Pluronique F-127 détergent dans 8 puits actives d’une plaque de microtitration (voir Table des matières; 0,5 mL/puits).
      2. Centrifuger la plaque de microtitration à température ambiante, 1 000 g, pendant 5 min. Inspectez micropuits avec un microscope inversé pour s’assurer de l’absence de bulles d’air. Laisser la plaque de microtitration pendant 30 min à température ambiante pour recouvrir les puits avec du détergent.
      3. Jeter la solution détergente des puits de la plaque de microtitration par puits de pipetage et rincer avec préchauffée DMEM/F12 (2 mL/puits).
      4. Centrifuger la plaque de microtitration à température ambiante, 1 000 x g pendant 5 min. Inspectez micropuits avec un microscope inversé pour s’assurer de l’absence de bulles d’air.
        Remarque : Quand on observe encore des bulles d’air dans des micropuits, examiner si la feuille de microtitration est toujours fermement collée au fond du puits.
      5. Jetez DMEM/F12 de puits de la plaque de microtitration par puits de pipetage et rinçage avec préchauffée DMEM/F12 (2 mL/puits).
      6. Répétez les étapes 2.4.3.3 - 2.4.3.4.
      7. Ajouter 4i milieu complet dans les rincés au puits de la plaque de microtitration (1 mL/puits). Garder le milieu complet de 4i restants dans un bain-marie à 37 ° C.
      8. Centrifuger la plaque de microtitration à température ambiante, 1 000 x g pendant 5 min. Inspectez micropuits avec un microscope inversé pour s’assurer de l’absence de bulles d’air.
      9. Placer la plaque de microtitration dans un incubateur à tri-gaz (37 ° C, 6,5 % O2, 5 % de CO2) jusqu'à ce que l’inoculation de 4i hiPSCs.
    4. Inoculation de 4i CISP dans une plaque de microtitration
      1. Prenez les 13 mL d’enzyme de dissociation cellulaire dans un tube à centrifuger de 15 mL et est proportionnelle à la température ambiante pendant 5 min.
      2. Préchauffer 50 mL PBS(-) dans une centrifugeuse 50 mL tube depuis > 5 min à 37 ° C dans un bain d’eau.
      3. Aspirer le vieux moyen de 24 puits de naïve hiPSC culture et rincer les cellules une fois avec préchauffée 2 mL/bien PBS(-). Jeter les PBS(-) et ajouter 0,5 mL/puits enzyme de dissociation. Placer les plaques de culture cellulaire dans un incubateur à CO2 (37 ° C) pendant environ 4 min jusqu'à ce que les cellules se détachent du fond. Doucement les cellules de pipette up et down pour faire suspension monocellulaire.
      4. Transfert en suspension monocellulaire hiPSC à milieu complet de 4i préchauffée 20 mL. Centrifuger la suspension de cellules à température ambiante, 300 x g pendant 8 min.
      5. Jeter le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire avec 5 mL de milieu complet de 4i préchauffée.
      6. Filtrer suspension cellulaire à travers un tamis de cellule (taille de pore de 40 µm) pour supprimer des agrégats cellulaires. Lavez tamis cellulaire 3 fois avec 1 mL de milieu complet de 4i préchauffée. Compter les cellules en utilisant un compteur Coulter.
      7. Diluer la suspension monocellulaire de 4i naïve hiPSCs à 27,0-32,4 x 106 cellules dans 9 mL de milieu complet de 4i préchauffée. Notez que milieu complet 4i contient déjà Y27632.
      8. Prendre la plaque de microtitration contenant 1 mL de milieu complet 4i 8 bien d’un incubateur de tri-gaz (2.4.3.9). Inoculer mL 1 4i naïve hiPSC suspension (3.0-3,6 x 106 cellules/puits) dans chaque puits. Cette densité cellulaire est critique. Assurez-vous que les cellules sont réparties uniformément dans chaque puits de pipetage doucement.
      9. Centrifuger la plaque de microtitration à température ambiante, 100 g pendant 3 minutes.
      10. Placer la plaque de microtitration dans une étuve à2 tri-gas CO (37 ° C, 6,5 % O2, 5 % de CO2). Ne pas déranger les granulés dans des micropuits de cellules. Incuber les cellules pendant 24 à 30 heures. Une nuit d’incubation (environ 16 heures) est généralement insuffisante pour formation d’EBs serré.
  5. Transfert de l’EBs à plaques de fixation basse pour bascule culture (jour 6)
    1. Préparer le milieu complet hPGCLC dans un tube à centrifuger 50 mL comme suit (jour 6 - journée 13) :
      20 mL de milieu basal de hPGCLC, 4 μL de 500 mM 2-mercaptoéthanol, 50 μL de 20 mg/mL d’acide L-ascorbique, 4 μL de 50 mM Y27632, 50 μL de 100 μg/mL BMP4 humaine recombinante, 4 μL de 500 μg/mL humaine SCF, 4 μL de 250 μg/mL humaine EGF et 8 μL de 250 μg/mL FRV humaine.
      Remarque : Préparer le milieu complet hPGCLC frais immédiatement avant utilisation et éviter l’exposition à la lumière. Ne stockez pas de hPGCLC complet moyen à 4 ° C ou congelé pendant une nuit ou plus.
      Remarque : La concentration de BMP4 est très élevée. La concentration optimale de BMP4 peut-être différer entre les lots de BMP4. La différence de lot à lot de BMP4 affecter fortement la production de hPGCLC. En l’absence de BMP4 dans le milieu de hPGCLC complète, le rendement de hPGCLCs est très faible6. L’importance d’autres cytokines dans le milieu de hPGCLC complet a été décrit par Hanna/Surani6.
      Remarque : Dans ce protocole, la concentration finale de FRV humain dans le milieu hPGCLC complète est de 100 ng/mL6,10. La concentration finale de FRV utilisée dans les études déjà publiées, y compris la nôtre, était de 1 μg/mL. Quelle est l’activité spécifique du réactif de FRV humaine > 10 000 unités/μg (ED50 < 0,1 ng/mL), 100 ng/mL FRV est suffisante pour supporter la génération de hPGCLC de l’EBs.
    2. Transfert d’EBs
      1. Préchauffer le milieu basal de hPGCLC 5 mL et 20 mL de milieu complet de hPGCLC pour > 5 min à 37 ° C dans un bain d’eau.
      2. Placez délicatement une passoire de cellule à l’envers au sommet d’un tube conique polypropylène de 50 mL.
      3. Pipette de chaque puits de la microwell plaque très doucement plaque pour détacher EBs micropuits. Filtrer tous les contenus de chaque puits sur la crépine de la cellule pour éliminer les cellules non incorporés dans EBs.
      4. EBs laver accumulée sur la crépine de la cellule avec 1 mL de milieu de base hPGCLC préchauffée. Doucement le lavage répétez 5 fois.
      5. EBs lavées sont maintenant conservés sur la membrane d’une crépine, qui se trouve sur un tube conique de 50 mL à l’envers. Placer un nouveau tube conique de 50 mL sur la crépine de la cellule de sorte que la crépine de la cellule est normalement positionnée dans le nouveau tube. Puis rapidement inverser la crépine de la cellule avec le nouveau tube. La crépine de la cellule et le tube sont maintenant en position normale, et EBs sont au-dessous de la membrane de la crépine de la cellule.
      6. EBs s’accumuler dans le tube à fond conique en ajoutant le milieu complet de 18 mL hPGCLC préchauffée par dessus la membrane de la crépine de la cellule. Ainsi, moyen va passer à travers la membrane et de recueillir EBs attaché sur le côté inférieur de la membrane vers le bas de la tube à centrifuger.
      7. Suspension de la plaque d’EBs dans le puits d’une plaque de 6 puits de basse-attachment (3 mL/puits).
      8. Placer la plaque de fixation basse sur un balancier de déplacement à la balançoire dans un incubateur à tri-gaz (37 ° C, 6,5 % O2, 5 % de CO2). Régler la vitesse de balancement à ~ 20 tours / min.
        Remarque : Ne s’appliquent pas mouvement tourbillonnant car agrégat EBs au centre du puits et fusible. Ajuster soigneusement vitesse bascule afin que l’EBs ne s’agrègent pas. À bascule trop vigoureuse sera endommagé physiquement EBs.
        Remarque : La pression d’oxygène est fortement recommandée pour la culture de l’EB.
  6. Génération de hPGCLCs sur la surface de l’EBs (jour 7 - jour 13)
  7. Fraîchement préparer 20 mL de milieu complet de hPGCLC chaque jour. Sans bascule, EBs sera précipité au fond des puits dans ~ 1 min. retirer ancien milieu sans séchage EBs (~0.2 mL/puits vieux moyen peut rester) et ajoutez les frais hPGCLC milieu complet tous les jours (3 mL/puits).

3. Immunohistochemical souillant d’EBs (jour 10 – jour 13)

  1. EBs encastrement dans des blocs de protéine de matrice extracellulaire pour formaldéhyde-fixes et paraffine immunostaining (FFIP)
    1. Pour identifier les hPGCLCs comme OCT4+ cellules, récolter EBs dans un tube de microcentrifuge basse-lier de 1,5 mL. Laissez EBs couler au fond ou brièvement centrifuger (2 secondes) à la température ambiante et ne du milieu. Rincez EBs avec PBS(-) glacée.
    2. Supprimer PBS(-) et incuber EBs dans 1 mL d’azide de sodium 1%(w/v) glacée au PBS(-) pendant 5 min sur la glace. Laisser l’EBs couler au fond ou centrifuger brièvement (2 secondes) à la température ambiante. Jeter le surnageant et rincer EBs avec PBS(-) glacée.
      Remarque : Ajout de l’azide de sodium ralentit la dégradation des protéines intracellulaires et ARN transcrits.
    3. Décongeler les 200 µL de protéine de la matrice extracellulaire sur la glace et ajouter dans le tube de microcentrifuge contenant EBs. Maintenir le tube à température ambiante pendant environ 10 min jusqu'à ce que le gel est solidifié.
    4. Ajouter 1 mL de 4 % de formaldéhyde dans PBS(-) et incuber à température ambiante pendant 15 minutes avec le doux balancement.
      Note : Les EBs et les protéines de la matrice extracellulaire sont fixés au cours de cette étape. Sans fixation, les blocs de gel peuvent se décomposer pendant le processus de déshydratation. Si EBs prédéterminés sont intégrés dans le bloc de gel, EBs sont fixés à nouveau avec le bloc de gel et peut être trop fixe.
    5. Jetez de formaldéhyde et rincez EBs une fois avec PBS(-) glacée. Ajouter 1 mL d’éthanol à 70 %. EBs gel incorporés peuvent être stockés dans l’éthanol à 70 % à 4 ° C pendant une semaine.
    6. Traiter l’EBs gel-encastré avec un protocole standard de FFIP. Préparer 5 μm diapositives FFIP épaisseur. Laissez les diapositives sécher toute la nuit et les stocker à température ambiante jusqu'à immunostaining.
      Remarque : Notre routine protocole FFPE est comme suit : 70 % éthanol, deux changements, 1 heure chacune ; 80 % d’éthanol, un seul changement, 1 heure ; éthanol à 95 %, un changement, 1 heure ; 100 % éthanol, trois changements, 1,5 heure chacune ; xylène, trois changements, 1,5 heure chacune ; cire de paraffine (58-60 ° C), deux changements, environ 2 heures chacune. Les tissus déshydratés sont incorporés dans des blocs de paraffine et couper à 3-10 μm (typiquement 5 μm).
    7. Pour la coloration, glisse dans le four de 56 ° C pendant au moins 30 min Deparaffinize de sécher complètement et hydrater diapositives avec xylènes et série graduée de l’alcool. Puis les lames dans l’eau du robinet pendant 5 min.
    8. Pour inactiver les peroxydases endogènes, incuber les lames réhydratés avec Solution de blocage BLOXALL à température ambiante pendant 10 min. Puis laver les lames avec du PBS pendant 5 min.
    9. Bloc glisse avec sérum de cheval Normal (ou sérums normaux d’autres anticorps secondaire espèces générées) à température ambiante pendant 20 min.
    10. Incuber les lames avec un anticorps primaire anti-OCT-3/4 chèvre dilué avec 0,1 % de BSA dans PBS(-) à 4 ° C durant la nuit (optimiser les conditions de dilution et d’incubation pour chaque anticorps primaire). Laver ensuite les diapositives avec PBS(-) trois fois à la température ambiante, 5 min chacun.
    11. Incuber les lames avec le anti-chèvre IgG (anticorps secondaire couplé à la peroxydase au raifort générés par cheval ; voir Table des matières) à température ambiante pendant 30 min. Laver ensuite les diapositives avec PBS(-) trois fois à la température ambiante, 5 min chacun.
    12. Mélanger une quantité nécessaire la DAB coloration des substrats (voir Table des matières) immédiatement avant utilisation et incuber les lames en complet DAB coloration solution à température ambiante pendant 5 min. moniteur DAB coloration à l’aide d’un microscope inversé et arrêter la réaction Lorsque OCT4+ cellules sont visualisées en rinçant rapidement glisse dans l’eau qui coule du robinet.
    13. Déshydrater les lames avec une série graduée de l’alcool et les xylènes. Les diapositives sont prêts pour la microdissection laser-capture. Préparer permanente FFIP diapositives à l’aide du milieu de montage (voir Table des matières) pour les observations en microscopie à haute résolution.

4. enrichissement de FACS des hPGCLCs de l’EBs (jour 10 – jour 13)

  1. Préparer le mélange enzymatique de Kit de Dissociation corps embryoïdes
    1. Préparer, Enzyme Mix 1 en ajoutant 50 µL Enzyme P à 1 900 µL de tampon X et vortex. Préchauffer Enzyme Mix 1 dans un bain-marie à 37 ° C pendant 15 min.
    2. Préparer, Enzyme Mix 2 en ajoutant 10 µL Enzyme A à 20 µL de tampon Y.
    3. Mélanger mélanges Enzyme 1 et 2 pour préparer EB complète Dissociation enzymatique Mix.
  2. Se dissociant EBs
    1. EBs récolte de plaques de fixation faible et centrifuger à température ambiante dans un tube à centrifuger de 15 mL, 300 g de x pendant 2 min. jeter le surnageant et remettre en suspension EBs 10 ml PBS(-). Centrifuger à nouveau.
    2. Jeter le surnageant et remettre en suspension les EBs avec complet EB Dissociation enzymatique Mix (4.1.3). Incuber suspension EB dans un bain d’eau de 37 ° C pendant 15-20 min jusqu'à ce que l’EBs sont dissociées. Durant l’incubation, doucement la pipette EBs à toutes les 3-5 min pour faciliter la dissociation. Alternativement, utilisez un dissociator automatisé avec programme de Dissociation corps embryoïdes.
    3. Ajouter glacee 8 mL PBS(-) de suspension de cellules dissociée EB. Filtrer la suspension cellulaire à travers un tamis de cellule de 40 µm. Crépine de cellule laver avec 1 mL PBS(-) glacée trois fois.
    4. Compter les cellules en suspension de cellules filtrées à l’aide d’un compteur Coulter.
    5. Centrifuger la suspension cellulaire à 4 ° C, 300 x g pendant 8 min et jeter le surnageant. Resuspendre le culot cellulaire glacée 10 ml PBS(-).
    6. Suspension cellulaire divisent de deux tubes, un pour le contrôle non tachant (cellules de5 ~ 10) et l’autre pour anti-CD38 coloration (toutes les cellules restantes).
    7. Centrifuger les deux tubes à 4 ° C, 300 x g pendant 8 min.
  3. Anti-CD38 coloration et enrichissement des FACS de hPGCLCs
    1. Resuspendre le culot cellulaire pour le contrôle non tachant avec 200 µL glacée 3 % (p/v) BSA et azide de sodium 1 % (p/v) dans PBS(-). Placer sur la glace jusqu’en cytométrie en flux.
      Remarque : Ajout de l’azide de sodium ralentit internalisation de CD38 de surface cellulaire.
    2. Resuspendre le culot cellulaire pour anti-CD38 coloration et glacée 3 % (p/v) BSA azide de sodium 1 % (p/v) dans PBS(-) à 1 x 106 cellules / µL 100.
    3. Ajouter 10 µL par 1 x 106 cellules d’une note-FACS, anticorps anti-CD38 APC-conjugués. Couvrir le tube avec du papier aluminium pour éviter l’exposition à la lumière. Incuber à 4 ° C pendant 45 min avec le doux balancement.
    4. Ajouter 5 mL glacee PBS(-) et centrifuger à 4 ° C, 300 x g pendant 8 min. jetez surnageant et remettre cellule pellet 5 ml PBS(-) glacée. Répétez les laver avec de le PBS(-) trois fois au total.
    5. Resuspendre le culot cellulaire avec l’azoture de sodium 500 μL glacée 3 % (p/v) BSA et 1 % (p/v) dans PBS(-) à une densité suffisante pour FACS.
    6. Enrichir les hPGCLCs comme CD38+ cellules, qui forment généralement population cellulaire bien différenciées. Utilisez le contrôle non tachant pour assurer l’identification du CD38+ cellules. Un rendement typique de hPGCLCs sont de 1 à 5 % de toutes les FACS-examiné des cellules individuelles de jour 10 EBs et de 20 à 40 % de jour 13 EBs.

Representative Results

La plaque de microtitration utilisée ici est dans le format de 24 puits et dispose de 8 puits tenant les feuilles de microtitration, dont chacun prend en charge la formation pouvant atteindre 1 200 EBs. D’environ 24 millions de cellules de pluripotence 4i naïve, cette plaque de microtitration génère généralement ~ 8 000 EBs composé de ~ 3 000 cellules par EB. Au cours de la culture non adhérents d’EBs avec balancement constant, le nombre d’EBs intact progressivement diminue en raison de la spontanée un démantèlement et ~ 3 000 EBs survivre jusqu’au jour 13 du protocole. La plupart de ces survivants EBs ont 50-200 hPGCLCs sur leur surface (estimée par détection immunohistochimique des cellules OCT4 + dans des coupes sériées de EBs ; voir Figure 8), ce qui donne ~ 100 000 OCT4 + hPGCLCs au total. Digestion enzymatique de l’EBs en cellules individuelles est un processus relativement inefficace, en réduisant le rendement des FACS enrichi CD38 + hPGCLCs à 9 000-47 000 cellules. Dans nos mains, une moyenne de six lots indépendants mais consécutifs d’expériences a été 14 038 ± 5 731 (moyenne ± SEM). Parce que les cellules négatives CD38 EB expriment OCT4 ARNm (qPCR) ou des protéines (immunohistochimie) que très faiblement, si ce n’est pas complètement absent, toutes les cellules EB fortement exprimant la protéine OCT4 sont pratiquement équivalent à l’ensemble de la population de la CD38 + hPGCLCs.

Le paramètre critique du présent protocole inclut la densité cellulaire. 2.0 x 105 humain CISP sont inoculées dans une matrice extracellulaire protéines-enduit puits de la plaque de culture de cellules de 6 puits (surface de croissance2 cm 9,60 / puits) avec 2 mL de milieu de Y27632-complétée (2.2.9), cellules atteindra environ 20-30 % confluency à 24 heures suivant l’inoculation (Figure 1). Après une culture de 24 heures supplémentaire dans le milieu de mTeSR1 en l’absence de Y7632, de cellules agrégées et de former des colonies, occupant environ 30 % de la surface de croissance (Figure 2). Les cellules sont ensuite cultivées dans le milieu de reprogrammation 4i (2.3.2). Après 24 heures de culture dans le confluent de devenir des cellules moyennes, 4i (Figure 3). Une culture de 24 heures supplémentaire dans le milieu de 4i rend les cellules dense (Figure 4). Le moment exact du changement médiatique (toutes les 24 heures +/-4 heures) et la densité des cellules sont indispensables pour une formation réussie d’EBs et hPGCLCs.

Après 48 heures culture dans le milieu de 4i, les cellules sont dissociées et inoculés à la plaque de microtitration, qui possède des puits 400 µm taille (2.4). Bien que cette plaque de microtitration disponibles dans le commerce est enduite de faible adhérence par le constructeur, frais de re-enduit avec du détergent (2.4.3) est recommandé pour réduire le risque d’adhérence des cellules indésirables. 800 µm micropuits entraîné avec un rendement réduit de hPGCLCs, ce qui suggère l’importance de la taille EB pour différencier correctement dirigée. Les cellules inoculées dans le milieu de 4i formeront EBs dans des micropuits à 24 à 30 heures, que l'on peut observer à l’aide d’un standard, inversé phase microscope à contraste (Figure 5). Le contour circulaire d’EBs deviennent clairement visibles et après 24 heures d’incubation. EBs de récolte à une époque antérieure (p. ex., 16 heures après l’inoculation) avant leur contour circulaire est clairement visible n’est pas recommandée car ces EBs sont très vulnérables aux dommages mécaniques et démonter facilement. Notez que des quantités significatives de naïve hiPSCs ne sont pas incorporées dans EBs, ce qui est normal. Ces cellules individuelles vont être emportés avant le démarrage de la culture de l’EBs sur surface peu adhérentes (2.5.2) à bascule. Notez également que, dans notre protocole, EBs se forment dans le milieu de la pluripotence 4i naïve - pas dans le milieu de hPGCLC. Formation préalable de EBs solide dans le milieu de 4i avant l’exposition au milieu de hPGCLC est importante pour la distribution des hPGCLCs sur la surface de l’EBs.

EBs a maintenu dans le milieu de hPGCLC sous une bascule, condition de culture non adhérents maintiendront leur forme sphérique sans agrégation ou fusion (Figure 6 et Figure 7). Trop faible condition à bascule provoquera l’agrégation EB et fusion, mais trop dure condition démantèlerons EBs. PGCLCs humaines émergent comme cellules exprimant OCT4 sur la surface de l’EBs après dès que la culture de 5 jours dans le milieu de hPGCLC et leur nombre augmente jusqu'à ce que la culture de 8 jours (Figure 8). L’incubation supplémentaire de EBs peut causer démantèlement d’EBs et perte de hPGCLCs. PGCLCs humaines peuvent être enrichis de cellules EB enzymatiquement dissociées après 5 à 8 jours de culture dans le milieu hPGCLC par FACS comme cellules CD38 + (Figure 9).

Figure 1
Figure 1 : culture de cellules humaines iPSC dans un milieu additionné de Y27632 24 heures après l’inoculation. La densité cellulaire est d’environ 20-30 % confluentes. En présence de l’inhibiteur de la roche Y27632, les cellules ont tendance à se répandre bien avec élongation longue, pointe. Echelle = 100 μm. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : culture de cellules humaines iPSC 48 heures après l’inoculation. Agrégation de former des colonies, occupant environ 30 % de la surface de croissance des cellules. Echelle = 100 μm. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : la culture de cellules humaines iPSC incubé dans le milieu de reprogrammation 4i pendant 24 heures. Cellules atteignent à la confluence. Echelle = 100 μm. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : la culture de cellules humaines iPSC incubé dans le milieu de reprogrammation 4i pendant 48 heures. Confluentes sont dense. Echelle = 100 μm. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : humain iPSC EBs formé dans des micropuits après 24 heures d’incubation dans la 4i reprogrammation moyen. Le contour circulaire d’EBs deviennent visibles à 24 à 30 heures après l’inoculation. Lorsque le contour est confirmé sous un microscope à contraste de phase, EBs sont prêts pour le transfert à une condition de culture bascule. Echelle = 500 μm. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : humain iPSC EBs incubée pendant 24 heures dans le milieu de hPGCLC. EBs a largement maintenir leur forme sphérique. Echelle = 500 μm. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Figure 7 : humain iPSC EBs incubé pendant 192 heures dans le milieu de hPGCLC. EBs sont agrandies par rapport à leur apparition à la culture de 24 heures, mais ils affirment encore largement des formes sphériques avec aucune agrégation ou la fusion. Echelle = 500 μm. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 8
Figure 8 : humains PGCLCs exprimer OCT4 sont localisés sur la surface du hiPSC EBs incubé pendant 192 heures dans le milieu de hPGCLC. EBs ont été incorporés dans les protéines de la matrice extracellulaire et traitées pour FFIP diapositive marquage immunohistochimique de OCT4 (substrat DAB). Echelle = 1 mm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 9
Figure 9 : PGCLCs humaines sont enrichis de cellules EB enzymatiquement dissociées par FACS comme CD38+ cellules. Après une incubation dans le milieu de hPGCLC de 5 à 8 jours, EBs peut être dissocié par digestion enzymatique pour préparer la suspension cellulaire unique. hPGCLCs peut être enrichi comme CD38+ cellules de FACS (points rouges). Cellules EB qui n’expriment pas CD38 (points bleus) devraient également être collectées comme contrôle négatif. Portes de FACS de cellules CD38-positifs et négatifs CD38 doivent être séparés par une large marge (points verts) pour éviter la contamination de chaque type de cellules. Les panneaux supérieurs et inférieurs montrent des profils de FACS sans ou avec les anticorps anti-CD38 coloration, respectivement. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Discussion

Fabrication robuste de hPGCLCs en utilisant le protocole décrit ici a été confirmée avec trois clones indépendants de CISP humaine avec le caryotype diploïde normale10. Ces clones iPSC provenaient de la peau cutanée néonatale humaine même fibroblaste cellule culture10. Ils seront fournis par les auteurs de cet article aux enquêteurs sur demande et sous l’accord de transfert de matériel approprié et arrangement de cellules humaines vivantes congelés d’expédition. On ignore actuellement si le caryotype normal est nécessaire pour la production de hPGCLC robuste en utilisant notre protocole ou celles rapportées par d’autres laboratoires.

Des études récentes ont montré que la production de hPGCLCs de hiPSCs11 ou ESCs14 en utilisant un protocole décrit par groupe de Saitou de l’Université de Kyoto8 dépend de l’expression de EOMESODERMIN, un facteur de transcription T-box requis pour induction de SOX17. SOX17 semble fonctionner comme la lignée de maître déterminer le facteur de transcription dans la différenciation de cellules souches pluripotentes humaines6germinale. EOMESODERMIN est codée par le gène LAEVIS , CRISPR/Cas9 knockout de LAEVIS causé une absence presque totale d’induction SOX17 dans la hPGCLC produisant des condition11et expression d’autres gènes a suivi le même schéma de la Cellules nulles SOX17 knockout. La surexpression de la EOMESODERMIN d’un vecteur inductible dans l' LAEVIS-cellules null knockout durant la culture induction hPGCLC efficacement secourus le robuste hPGCLC production ainsi que l’induction de gènes, cellules germinales, y compris SOX17. En revanche, induite par la surexpression SOX17 secouru également la production de PGCLC robuste mais sans provoquer de LAEVIS. Ainsi, EOMESODERMIN est un inducteur critique en amont de SOX17, et cela semble le rôle le plus important simple de EOMESODERMIN dans hPGCLC induction de cellules souches pluripotentes humaines. Notre protocole induit SOX17 hiPSCs10, mais sa dépendance sur l’induction EOMESODERMINE vous attend à déterminer.

Ce protocole convertit apprêté-pluripotence CISP humaine maintenus dans le milieu mTeSR1 pour ERK-indépendant naïve pluripotence pendant 96 heures dans le 4i reprogrammation moyenne6, qui est une mis à jour le naïf des cellules souches humaines medium (NHSM)5. Nos tentatives pour générer des hPGCLCs commençant par les mêmes clones humains iPSC, mais conservés dans d’autres milieux de croissance iPSC humain disponible dans le commerce avant la culture dans la 4i reprogrammation moyen a donné lieu à des degrés divers des rendements inférieurs à hPGCLC. Bien que si l’adaptation à long terme dans d’autres médias améliore la production de hPGCLC ou ne reste pas être déterminée dans de futures études, cette observation suggère que l’état exact de la pluripotence apprêtée de CISP humaine avant la 4i reprogrammation significativement impact formation EB dans le milieu de 4i et différenciation EB dans un milieu hPGCLC.

Production de hPGCLCs de hiPSCs selon notre protocole est robuste et hautement reproductible, en partie à cause de l’utilisation des plaques microwell qui permettent la production efficace d’un grand nombre d’EBs (~ 8 000 EBs par lot) avec une taille unique (3 000 hiPSCs par EB). Le nombre d’EBs facilement produites en un seul lot d’expérience, en utilisant notre protocole peut être beaucoup plus grand que les méthodes utilisant des puits de culture cellulaire U-bas régulières. Production d’un grand nombre de même taille EBs uniformément parsemé de hPGCLCs peut-être offrir des possibilités uniques de haut débit projections chimiques à identifier petit poids moléculaire activateurs ou inhibiteurs de spécification du PGC ou leur caractéristiques biologiques telles que la reprogrammation épigénétique. Ces EBs peut aussi être utile pour les évaluations toxicologiques d’un grand nombre de substances toxiques de la cellule germinale, en incluant non seulement les polluants environnementaux mais aussi cliniquement les médicaments tels que les agents chimiothérapeutiques.

Les facteurs critiques de la production robuste et reproductible de hPGCLCs en utilisant le protocole présenté comprennent (i) l’utilisation de saine hiPSCs maintenu en mTeSR1 sur la protéine de la matrice extracellulaire, (ii) à inoculer le nombre exact de cellules tel que spécifié et strictement Suivez les timings de changement médiatique et sous-culture, (iii) pour sélectionner la bonne beaucoup de BMP4 recombinante humaine et (iv) afin de minimiser les dommages physiques de EBs pendant le balancement de la culture. C’est notre expérience qui le meilleur lot de réactif BMP4 travaillait à 100 concentration ng/mL alors que l’autre lot de réactifs BMP4 requis 2 X ou plus doses. En revanche, rendement de hPGCLCs production en utilisant le meilleur lot de BMP4 plutôt diminué des doses élevées de BMP4 (p. ex. 200 ng/mL). Nous vous recommandons de tester plusieurs différents lots de recombinant humain BMP4 réactifs provenant de plusieurs fournisseurs pour leur performance en soutenant hPGCLC génération et pour garantir une grande quantité du meilleur lot.

Une particularité de notre protocole de hPGCLC est que hPGCLCs sont localisées sur la couche de surface extérieure de l’EBs10 (Figure 8), tandis que les autres protocoles peuvent générer des hPGCLCs au milieu de la cellule agrégats6,8. Corps embryoïdes tendent à former plusieurs couches distinctes telles que surface, enveloppe extérieure, coque intérieure et noyau, et les régions de noyau central sont souvent nécrotiques en raison de la quantité limitée de nutriments, oxygène, ainsi que pro-survivant des facteurs de croissance fournies forme la culture medium de diffusion20. Localisation de hPGCLCs sur la surface de l’EBs sans restrictions possibles en raison de la faible diffusion vers le centre de l’EBs peut être bénéfique pour l’exposition directe, et dose-temporisation, de hPGCLCs aux drogues ou de substances toxiques pour pharmacologique ou études toxicologiques.

Alors que les souris PGCLCs voir la robuste génome ADN déméthylation impliquant l’impression contrôler des régions au moins en partie7,19,20, le degré de déméthylation Adng global en hPGCLCs semble plus faible que la souris PGCLCS ou PGC6,7. Transcriptomal profils suggèrent que hPGCLCs peut ressembler à un stade plus précoce du PGC embryonnaires de souris PGCLCs10. Il a été rapporté que culture prolongée d’EBs dans des conditions de production de hPGCLC a provoqué un degré accru d’Adng déméthylation7; Toutefois, si une longue période de culture de hPGCLCs dans EBs ou sous forme de cellules isolées peut atteindre des stades plus avancés de la différenciation de la lignée germinale doit être déterminé par les études à venir.

Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Nous reconnaissons Shiomi Yawata et Chie Owa pour l’assistance technique pendant les études initiales. Cette étude a été financée par des subventions NIEHS/NIH R01 ES023316 et R21ES024861 de TS et de subvention de l’Institut de recherche médicale de bord (FAMRI) à Amina.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Primed pluripotency hiPSC culture
Matrigel Corning 354277 Aliquot Matrigel at the volume indicated by the manufacturer (about 200 μL). Use cold tubes. Store at -80 °C
DMEM/F-12 Thermo Fisher Scientific 21041-025 Store at 4 °C.
mTeSR1 STEMCELL Technologies 85850 Reconstitute by adding 5X Supplement to Basal Medium. The reconstituted medium can be stored at 4 °C for up to
4 weeks without affecting cell culture performance.
Y27632 Axon 1683 Dilute 5 mg Y27632 (MW 320.26) with 312.2 μL water to prepare 50 mM Y27632 stock solution. Sterilize by filtration (0.22 μm). Aliquot 20 μL/tube x 15 tubes and store at -20 °C.
CryoStor CS10 STEMCELL Technologies 07930 Store at 4 °C.
Accutase Innovative cell technologies AT104-500 Cell dissociation enzyme; aliquot 40 mL/tube x 12 tubes and store at -20 °C.
Name Company Catalog Number Comments
4i hiPSC culture
KnockOut DMEM Thermo Fisher Scientific A1286101
KnockOut Serum Replacement Thermo Fisher Scientific 10828028 Aliquot 40 mL/tube x 12 tubes and store at -20 °C.
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x) Thermo Fisher Scientific 10378016
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) Thermo Fisher Scientific 11140050
Insulin from bovine pancreas Sigma-Aldrich I1882-100MG Add 0.1 mL glacial acetic acid to 10 mL water. Sterilize by filtration (0.22 um). Dilute 100 mg insulin lyophilized powder with cold 10 mL the acidified water to make 10 mg/mL stock solution. Aliquot 650 μL/tube x 15 tubes and store at -80 °C.
human LIF PeproTech 300-05 Reconstitute 250 μg human LIF with 250 μL water. Add 750 μL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 250 μg/mL human LIF stock solution. Specific activity of this product is >10,000 units/μg. Aliquot 40 ul/tube x 25 tubes and store at -80 °C.
human FGF2 R&D Systems 4114-TC Reconstitute 1 mg human FGF2 with 5 mL PBS(-) to make 200 μg/mL human FGF2 stock solution. Aliquot 100 μL/tube x 50 tubes and store at -80 °C.
human TGF-β1 PeproTech 100-21 Reconstitite 50 μg with 50 μL of 10 mM Citric Acid (pH 3.0). Add 150 μL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 250 μg/mL human TGF-β1 stock solution. Aliquot 4 μL/tube x 50 tubes and store at -80 °C.
4i basal medium Mix the following reagents to make 4i basal medium.
500 mL of KnockOut DMEM
100 mL of KnockOut Serum Replacement
6 mL of Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x)
6 mL of MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)
650 µL of 10 mg/mL Insulin from bovine pancreas
40 µL of 250 µg/mL human LIF
20 µl of 200 µg/ml human FGF2
4 µl of 250 µg/ml human TGF-β1
Aliquots 40 ml/tube and store at -80 °C.
CHIR99021 Axon 1386 Reconstitute 25 mg CHIR99021 (MW 465.34) with 1791 μL DMSO to make 30 mM CHIR99021 stock solution. Aliquot 50 μL/tube x 35 tubes and store at -20 °C.
PD0325901 Axon 1408 Reconstitute 5 mg PD0325901 (MW 482.19) with 1037 μL DMSO to make 10 mM PD0325901 stock solution. Aliquot 50 μL/tube x 20 tubes and store at -20 °C.
BIRB796 Axon 1358 Reconstitute 10 mg BIRB796 (MW 527.66) with 948 μL DMSO to make 20 mM BIRB796 stock solution. Aliquot 50 μL/tube x 18 tubes and store at -20 °C.
SP600125 Tocris 1496 Reconstitute 10 mg SP600125 (MW220.23) with 908 μL DMSO to make 50 mM SP600125 stock solution. Aliquot 50 μL/tube x 18 tubes and store at -20 °C.
AggreWell400 STEMCELL Technologies 27845 Microwell plate
Pluronic F-127 Sigma-Aldrich P2443 Reconstitute 5 g Pluronic F-127 in 100 mL water to make 5%(w/v) Pluronic F127 stock solution. Sterilize by filtration (0.22 um). Aliqout 50 mL/tube x 2 tubes and store at r.t.
Name Company Catalog Number Comments
hPGCLC culture
Glasgow’s MEM Thermo Fisher Scientific 11710035
Sodium pyruvate (100 mM) Thermo Fisher Scientific 11360070
Penicillin-Streptomycin (100x) Corning 30-002-CI
hPGCLC basal medium Mix the following reagents to make hPGCLC basal medium.
500 mL of Glasgow’s MEM
75 mL of KnockOut Serum Replacement
6 mL of MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)
6 mL of 100 mM Sodium pyruvate
6 mL of Penicillin-Streptomycin (x100)
Aliquots 40 mL/tube and store at -20 °C.
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148 Dilute 350 μL 2-Mercaptoethanol (14.3 M) in 9.65 mL PBS(-) to make 500 mM 2-Mercaptoethanol stock solution . Store at 4 °C.
L-Ascorbic acid Sigma-Aldrich A4544 Reconstitute 400 mg L-Ascorbic acid with 20 mL water to make 20 mg/mL L-Ascorbic acid stock solution. Sterilize by filtration (0.22 um). Aliquot 500 μL/tube x 40 tubes and store at -20 °C.
Recombinant human BMP4 R&D Systems 314-BP Reconstitute 1 mg recombinant human BMP4 with 10 mL of 4mM HCl aq. to make 100 μg/mL recombinant human BMP4 stock solution. Aliquot 250 μL/tube x 40 tubes and store at -80 °C.
Human SCF PeproTech 300-07 Reconstitute 250 μg human SCF with 500 μL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 500 μg/mL human SCF stock solution. Aliquot 35 μL/tube x 14 tubes and store at -80 °C.
Human EGF PeproTech AF-100-15 Reconstitute 1 mg human EGF with 1 mL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 1 mg/mL human EGF stock solution. Aliqot 100 μL/tube x 10 tubes. Dilute 100 μL of 1 mg/ml human EGF stock solution with 300 μL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 250 μg/mL humanEGF stock solution. Aliquot 20 μL/tube x 20 tubes. Store at -80 °C.
Cell strainer Corning 352340 Pore size = 40 μm.
50 ml polypropylene conical tube Corning 352070
Low attachment plate Corning 3471
Vari-Mix Platform Rocker Thermofisher M79735Q
Name Company Catalog Number Comments
Immunohistochemical staining
BLOXALL Blocking Solution VECTOR SP-6000
Normal Horse serum
ImmPRESS Reagent Anti-Goat IgG		 VECTOR MP-7405
OCT-3/4 Antibody Santa Cruz SC-8629
ImmPACT DAB VECTOR SK-4105
Permount Thermofisher SP15-100 Mounting medium
Name Company Catalog Number Comments
Isolating hPGCLC
Embryoid Body Dissociation Kit Miltenyi Biotec 130-096-348
Anti-CD38 antibody conjugated to APC abcam ab134399

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References

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Developmental Biology numéro 143 cellules germinales primordiales des cellules semblables à des cellules germinales primordiales (PGCLCs) pluripotentes induites tige corps embryoïdes naïve pluripotence pluripotence apprêtée cellules
Génération de cellules humaines de ressemblant cellules germinales primordiales à la Surface du corps embryoïdes de pluripotence amorcée induite par les cellules souches pluripotentes
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Mitsunaga, S., Shioda, K., Isselbacher, K. J., Hanna, J. H., Shioda, T. Generation of Human Primordial Germ Cell-like Cells at the Surface of Embryoid Bodies from Primed-pluripotency Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (143), e58297, doi:10.3791/58297 (2019).

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