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Developmental Biology

从原生多能诱导干细胞中生成胚胎体表面的人原始生殖细胞样细胞

Published: January 11, 2019 doi: 10.3791/58297
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1
1Center for Cancer Research, Massachusetts General Hospital, 2Department of Molecular Genetics, Weizmann Institute of Science

Summary

原始生殖细胞 (pgc) 是精子和卵子的常见前体。人类胚胎 pgc 是通过细胞因子的相互作用从多能细胞中指定的。在这里, 我们描述了一个为期13-day 的方案, 诱导人类细胞转录类似于 pgc 在胚胎体表面从初级多能诱导多能干细胞。

Abstract

原始生殖细胞 (pgc) 是所有胚系细胞的常见前体。在小鼠胚胎中, 通过精心接触细胞因子 (包括骨形态发生蛋白 4 (bmp4), 从多能表外细胞中诱导了 ~ 40个 pgc 的建立种群。在人类胚胎中, 在妊娠第3周结束前后的卵黄囊内皮壁上发现了最早的 pgc, 但对人类 pgc 规范的过程及其早期发育了解甚少。为了规避研究人类胚胎 pgc 的技术和伦理障碍, 最近从多能干细胞中产生了替代细胞培养模型。在这里, 我们描述了一个为期13-day 的方法, 用于可靠地生产人的 pgc 样细胞 (hPGCLCs)。人类诱导多能干细胞 (hipsc) 保持在引种多能状态下, 在4i 幼稚的重新编程介质中孵育 48小时, 与单个细胞分离, 并被包装成微束。在天真的多能状态下长期维持高 psc 会导致严重的染色体畸变, 应避免。微叶中的 hpsc 在4i 培养基中保持额外的 24小时, 形成胚胎体 (eb), 然后在 hpgclc 诱导培养基中的低粘附塑料体中培养, 在摇凝状态下培养低粘附的塑料制品, 其中含有高浓度的重组人 bmp4。在摇摆不定的非粘附条件下, 再培养28天的 e b, 以获得 hPGCLCs 的最大产量。通过免疫组织化学, hPGCLCs 很容易被检测为在其表面的几乎所有 eb 中强烈表达 oct4 的细胞。当 eb 被酶解离并经过流式细胞仪的富集化时, hPGCLCs 可以作为 cd38 + 细胞收集, 产率高达40-45%。

Introduction

原始生殖细胞 (pgc) 是所有两性生殖细胞的常见前体。我们关于哺乳动物胚胎中 pgc 发育的大部分知识是通过研究实验室小鼠1,2获得的。在胚胎期6.0-6.5 小鼠胚胎中, 6个或类似的少量 pgc 前体位于表爆中, 并以依赖于从相邻分泌的骨形态发生蛋白 bmp2 和 Bmp2 的方式从它们中诱导出大约 40个 pgc 的建立种群细胞。迄今在胚胎中发现的最早的人类 pgc 是在妊娠3周结束时的卵黄囊内皮壁上。由于这与在小鼠胚胎中观察到的迁移 pgc 相同的地方, 观察到的人类 pgc 很可能处于迁徙的道路上, 但不是建国人口。然而, 追踪人类胚胎中 pgc 或 pgc 前体早期阶段的研究一直缺失。

由于技术和道德障碍, 获得人类胚胎 pgc 具有挑战性。为了克服这些障碍, 最近从人类多能干细胞 (psc) 中产生了类似 pgc 的细胞培养模型。多能性是细胞分化为种系和三个胚胎胚芽层4的能力。而人类 psc 保持在 mtesr1 培养基 (一种随时可用的, 商业上可获得的介质, 用于维持人类 psc 在引脚多能状态) 上的菜肴上, 其在含有细胞外基质蛋白的菜肴上具有引种状态多能性4, 2013年雅各布·汉娜的实验室表明, 引物多能细胞可以转化为一种天真的多能性状态, 通过将含有化学抑制剂的天真的人类干细胞培养基 (nhsm) 暴露在蛋白质激酶 k女式 k半、gsk3、jnk、rock、pkc (和 p38 mapk 以及生长因子 lif、tgf、bfgf5。2015年, 由 hanna 和 azim surani 领导的一个研究小组从 psc 6 中首次完成了人类 pgc 样细胞 (hPGCLCs) 的稳健生产.后来, 包括我们的实验室在内的其他几个实验室报告说, 私营保安公司使用稍有不同的协议7、8、9、10生成了hPGCLCs。我们的研究提供的证据表明, 使用不同协议产生的 hPGCLCs (我们以前发表的研究报告 10的表 s1 总结了这些协议) 在转录上彼此相似。现有证据支持人类 pgclc 与早期人类胚胎 pgc 在全球表观遗传过程7和/或趋化迁移之前的相似性。

对小鼠胚胎 pgc、小鼠 pgclc 和人 pgclc (但接触人类 pgc 的机会非常有限) 的研究表明, 小鼠和人类1,6、 7,8,9,10,11,12, 13,14,15,16 ,17岁。例如, prdm14 在小鼠胚胎的 pgc 规范中起着关键作用, 但它在人类 pgc 规范中的作用似乎有限, 为1,15.相反, eomesodemin 诱导 sox17 对于 pgc 规格6、11、14是必不可少的, 而这些转录因子对于小鼠 pgc 规范15来说似乎是可有可无的。使用 hPGCLCs 进行的这些初步研究成果有力地支持了这种细胞培养模型作为人类胚胎 pgc 的替代品的重要性。

最近发表的研究涉及我们实验室对基因组 dna 拷贝数分析的深度测序评估, 研究表明, 在极净的多能状态下长期维持 psc, 会显著增加染色体不稳定的风险。结构异常。这一现象在小鼠18和人类19个psc 中都有观察到。hana/surani 报告的原始 hpgclc 生产协议是为在4i 天真多能介质中保持至少 2周6的人 psc 开发的。为了保持人 psc 和 pgclc 的正常二倍体核型, 我们开发了一个改进的协议, 其中人类 psc 接触4i 介质的时间只有 72小时,本文介绍了这一方案。人类 ipsc (hipsc) 保持在引种多能状态下。在 eb 形成之前, 细胞在4i 幼稚的重编程介质 (改良的 nhsm 培养基) 中孵育48小时。然后将细胞分离并包装成微束, 在4i 介质中增加24小时形成 eb。在含有高浓度重组人 bmp4 的 hpgclc 诱导培养基中保持 eb, 在无附着培养的摇摆条件下最多 8天, 以获得 hpgclc 的最大产量。在8天的 eb 培养后, 利用 facs 将 hPGCLCs 作为 cd38 + 细胞从离解的 eb 细胞中分离出来, 在 fts 可分等级单细胞悬浮液中的收率高达40%。而其他已发布的方法7,8,9, 包括我们修改之前的原始协议 6, 通常在自发形成的细胞群中生成 hPGCLCs, 而没有特定的在胚胎体 (eb) 的表面观察到了我们的协议所产生的 hpgclc 的定位。

Protocol

1. 高维及多能性状态下高保生压器的细胞培养

  1. 细胞外基质蛋白包衣盘的制备
    1. 在冰箱或寒冷的房间里过夜的冰上解冻 matrigel (细胞外基质蛋白) (不要在室温下解冻或使用温水浴)。aliquot 基质蛋白 (~ 200μl; 每批的基质体积由制造商为每批产品确定, 并在小瓶标签上注明) 转化为无菌低结合离心管或冰上细胞冷冻保存管。重要的是要保持细胞外基质蛋白在分配过程中的冰凉, 以避免凝固。将等价物存放在-80°c。
    2. 用细胞外基质蛋白包衣细胞培养塑料盘, 用25毫升冰凉 dmem/f12 稀释一个小盘, 并推广到三个10厘米的培养皿 (~ 8 ml/盘)。在室温下将菜品孵化至少1小时。涂布后, 菜可以使用 parafilm 密封, 并在室温下存放长达一周。
    3. 在接种启动多能高 psc 之前, 从菜肴中提取培养基。不需要用中或钙/无镁脱脂盐水清洗涂层盘 [pbs (-)]。
  2. hipsc 培养在引种多能状态下的萌发
    1. 在15毫升离心管中加入2μl 的 50 mm y27632 [与 ro 相关的蛋白激酶 (rock) 抑制剂] 到 mtesr1 培养基的 10 ml 中。准备两管 rock 抑制剂补充 10 ml 培养基, 从1毫升冷冻细胞库存开始细胞培养在一个10厘米的盘中。当天使用 y27632 补充培养基。预热 y27632 补充培养基在37°c 的水浴中5分钟。
      注意: 此协议适用于 mtesr1 中维护的 hipsc。当 hpsc 在支持人类 psc 生长的其他介质中保持不同程度的引物或幼稚多能性时, hPGCLCs 的产量可能会有很大差异。
      注: 完整 mtesr1 的保质期为 4°c 2周,-20°c 时 6个月, 但重新冻结会导致性能不佳。我们在-20°c 下冷冻40毫升 mtesr1 的 aliquots, 直到使用。
    2. 用37°c 的水浴解冻一小瓶引种多能高能的高能冷冻库存 (1.0-3.0 x 1 毫升介质中的 10 6 细胞)。解冻完成后, 立即将小瓶的全部含量转移到一个管 (10 毫升) 的预热632补充介质中。
    3. 在室温下离心细胞悬浮液, 300 x g 8分钟, 丢弃上清液, 并从另一管补充10毫升预热 y27632 的细胞颗粒重新悬浮细胞颗粒。
    4. 均匀地将细胞悬浮液扩散到细胞外基质蛋白涂层10厘米的盘子中。将盘放在三气 co 2 孵化器中 (37°c、6.5% o2、5% co2)。在低氧压力下保持 hipsc 培养。
    5. 每天更换介质 (mtesr1, 不含 y27632)。rock 抑制剂 (y27632) 是分离后立即 hipsc 生存的关键。一旦 hpsc 坚持在细胞外基质蛋白涂层表面作为均匀分布的小集合体 & gt;10 融合 (通常在接种后16小时内完成), y27632 是可有可无的。在没有 y27632 的情况下接种离解的高环秘书长后, 过早的培养基变化可能会导致几乎完全的细胞死亡。
  3. 通过底漆多能性hpsc
    注: 当菌落占有效生长面积的80% 时, 通道启动多能高 psc。正确的过路程序和密度对于实验重现性非常重要。我们已经看到, hpgclc 诱导的效率在 hpclc 培养物从冷冻库存 (涉及一两个通道) 开始6天后或一个月 (涉及和 gt;10 通道) 开始后, 没有明显差异。hpgclc 的诱导成功地从维持了两个多月的 hpsc 中进行, 尽管没有对效率进行定量分析。
    1. 在15-ml 离心管中取4毫升细胞离解酶混合物, 并平衡至室温5分钟。
    2. 在15-ml 离心管中预热10毫升 pbs (-), 在37°c 的水浴中为 gt;5。
    3. 在15毫升离心管中加入2μl 的 50mm y27632 (rock 抑制剂) 到 10 ml mtesr1 介质中。制备两管 rock 抑制剂, 补充 10 ml 介质, 并在同一天使用。在另一个15毫升离心管中, 在不添加 y27632 的情况下, 取5毫升 mtesr1。在37°c 的水浴中, 在37°c 的水浴中, 预热介质 +/-y27632 5分钟。
      注: 在步骤1.3.3 中制备的所有中等等价物可能含有27632日元。
    4. 从10厘米的盘子中吸出旧培养基, 用预热的10毫升 pbs (-) 冲洗细胞一次。丢弃 pbs (-) 并在盘中加入4毫升的离解酶。将盘放入 co2 孵化器 (三气孵化器工作, 但不需要) ~ 4分钟, 直到细胞从底部分离。轻轻向上和向下移液细胞, 使单细胞悬浮液。
    5. 将 hipsc 单细胞悬浮液转移到含有5毫升介质而不含 y27632 的预热管 (15 毫升管的总体积约为 9 ml)。在室温下离心细胞悬浮液, 300 x g, 8分钟。
    6. 将上清液和再悬浮细胞颗粒与含有 y27632 的预热介质10毫升。
    7. 使用40μm 电池过滤器去除细胞集料, 并使用库尔特计数器确定细胞密度。
    8. 稀释细胞悬浮液与预热 y27632 补充介质, 以达到 3.0 x 10 6细胞在10毫升, 接种细胞外基质蛋白涂层10厘米的盘子。将接种的盘放入三气 co2 孵化器 ( 37°c、6.5% o2、5% co2)。
    9. 每天更换介质 (mtesr1, 不含 y27632)。

2. hPGCLCs 的产生

注意: 当10厘米盘中的 hipsc 细胞 (mtesr1 培养基, 细胞外基质蛋白包覆) 达到 ~ 80% 融合 (约 107个细胞) 时, 启动以下步骤。

  1. 细胞外基质蛋白包衣菜肴的制备 (第1天)
    1. 在冰凉 dmm传递 f12 25 毫升的冰上和稀释物中解冻一种细胞外基质蛋白。
    2. 将稀释后的细胞外基质蛋白分配给6孔板 (1 mL/well)。一个就足以覆盖24口井 (4个板块)。在室温下孵化板至少1小时。未使用的涂层板可以密封, 并在室温下储存长达一周。
    3. 在接种引种多能高 psc 之前, 从板中提取吸出培养基。不需要用介质或 pbs (-) 清洗涂布盘。
  2. 将引脚多能高 psc 接种到细胞外基质蛋白包覆板 (第1天)
    1. 在15-ml 离心管中取4毫升细胞离解酶, 平衡至室温5分钟。
    2. 在15-ml 离心管中预热10毫升 pbs (-), 在37°c 的水浴中为 gt;5。
    3. 在50-ml 离心管中加入7μl 的 50mm y27632 (rock 抑制剂) 到 35 ml mtesr1 介质中。在同一天使用 y27632 补充培养基。在37°c 的水浴中, 用总共70毫升 y27632 补充培养基制作两管, 并对介质进行预热15分钟。
    4. 从10厘米的盘子中吸出旧培养基, 用预热的10毫升 pbs (-) 冲洗细胞一次。丢弃 pbs (-) 并在盘中添加4毫升的细胞离解酶。将盘放入 co2 孵化器 (三气孵化器工作, 但不需要) ~ 4分钟, 直到细胞从底部分离。轻轻向上和向下移液细胞, 使单细胞悬浮液。
    5. 将 hipsc 单细胞悬浮液转移到含有10毫升 y27632 补充介质的预热管中。在室温下离心细胞悬浮液, 300 x g, 8分钟。
    6. 用10毫升预热 y27632 补充培养基丢弃上清液并重新悬浮细胞颗粒。
    7. 过滤细胞悬浮通过细胞过滤器 (40μm 孔径), 使用库尔特计数器去除细胞聚集物并计数细胞。
    8. 在50毫升预热 y27632 补充培养基中稀释 hipsc 单细胞悬浮液至 5.0x 10 6 细胞。
    9. 在涂布6孔板 (4 板, 24孔)的每口井中接种2毫升细胞悬浮液 (2.0 x 10 5 细胞)。确保细胞均匀分布在每口井中。将细胞培养板放入三气 co 2 孵化器 (37°c、6.5% o2、5% co2).
      注: 接种细胞密度和每口井均匀分布至关重要。因为将 hpsc 接种到10厘米的培养皿中可能会导致比其他区域明显高的细胞密度。单孔高 psc 的细胞密度可以更容易地通过6孔板实现。
    10. 接种后24小时内, 用 2 mlwell mtsr1 (不含 y27632) 改变培养基。
  3. 将引信的多能状态高 psc 转换为4i 天真 (与 erk 无关) 的多能细胞 (第3天和第4天)
    1. 在50毫升离心管中准备4i 完全的天真多能介质 (第3天和第4天): 4i 基部培养基50毫升, 5μl 30 mm chir99021, 5μl 10 mm pd0325901, 5μl 20 mm BIRB796, 5μl 50 mm sp600125, 和5μl 的 50 mm y27632。
      注: 将4i 基部介质存放在-80°c, 并在冰箱中解冻过夜。使用前立即准备好新鲜的4i 介质。避免将4i 化学品 (chir、pr、bird 和 sp) 暴露在强光下。不要将4i 完整介质存放在4i 或隔夜或更长时间内冷冻。
    2. 在37°c 的水批次中加热50毫升4i 完整介质 15分钟. 接种后48小时和72小时用预热4i 完整介质 (2mlwell) 更换培养基。介质变化的精确时间对实现高 hpgclc 产率和实验重现性具有重要意义。
      注: 在这种情况下, 4i hipsc 培养的密度很高, 在接种48-72小时后变成融合, 但这是正常的。
  4. 使用微孔板形成 eb (第5天)
    1. 在50毫升离心管中制备50毫升的4i 完整介质, 并在37°c 的水浴中预热约 15分钟, 然后再使用。
    2. 预热35毫升 dmm/f12 在一个50-ml 的离心管在37°c 的水浴中约15分钟使用前。
    3. 准备微井板
      1. 将 5% 的滤化灭菌 pluonic f - 127 洗涤剂加入胶井板的 8 性井 ( 见材料表; 0 . 5 ml / 井 ) 。
      2. 在室温 1, 000 x 克的温度下离心微井板 5分钟, 用倒置显微镜检查微管, 以确保没有气泡。在室温下离开微井板 30分钟, 用洗涤剂覆盖微孔。
      3. 用预加热的 dmm/f12 (2mlwell) 移入微井板井中的洗涤剂溶液, 并冲洗井。
      4. 在室温下离心微井板, 1, 000 x 克, 5分钟, 用倒置显微镜检查微管, 以确保没有气泡。
        注意: 当微孔中仍观察到气泡时, 请检查微井片是否仍牢固地粘附在井底。
      5. 用预加热的 dmemmcf12 (2 mlwell) 移液冲洗微井板的水井, 将 dmemm/f12 丢弃。
      6. 重复步骤 2.4.3.3-2.4.3.4。
      7. 在微井板 (1 ml/well) 的冲洗井中加入4i 完整介质。将剩余的4i 介质保存在37°c 的水浴中。
      8. 在室温下离心微井板, 1, 000 x 克, 5分钟, 用倒置显微镜检查微管, 以确保没有气泡。
      9. 将微井板放入三气孵化器 (37°c、6.5% o2、5% co 2)中, 直至接种 4i hpsc.
    4. 将 4i ipsc 接种到微井板中
      1. 在15-ml 离心管中取13毫升细胞离解酶, 平衡至室温5分钟。
      2. 在一个50毫升的离心管中预热50毫升 pbs (-), 在37°c 的水浴中为 & gt;5。
      3. 从24口天真的 hipsc 细胞培养井中提取旧培养基, 用预热的 2 mlwell pbs (-) 冲洗细胞一次。丢弃 pbs (-) 并添加 0.5 ml·井离解酶。将细胞培养板放入 co2孵化器 (37°c) ~ 4分钟, 直到细胞从底部分离。轻轻向上和向下移液细胞, 使单细胞悬浮液。
      4. 将 hipsc 单细胞悬浮液转移到预热的20毫升4i 培养基上。在室温下离心细胞悬浮液, 300 x g, 8分钟。
      5. 用5毫升预热4i 培养基丢弃上清液并重新悬浮细胞颗粒。
      6. 过滤细胞悬浮通过细胞过滤器 (40μm 孔径), 以去除细胞集料。用1毫升预热4i 培养基清洗细胞过滤器3次。使用库尔特计数器对单元格进行计数。
      7. 在9毫升预热4i 完全培养基中, 将4i 天真的 hpsc 的单细胞悬浮液稀释至 27.0-32.4 x10 6 细胞。请注意, 4i 完整介质已经包含 y27632。
      8. 从三气孵化器 (2.4.3.9) 中取出8口中含有1毫升4i 完整介质的微井板。接种1毫升4i 天真的 hipsc 悬浮液 (3.0-3.6 x10 6 cells/well well) 进入每口井。这种细胞密度是至关重要的。通过轻轻移液, 确保细胞均匀分布在每口井中。
      9. 在室温下离心微井板, 100 x 克3分钟。
      10. 将微井板放入三气 co2 孵化器 ( 37°c、6.5% o2、5% co2)。不要干扰微孔中颗粒的细胞。培养细胞24-30小时。隔夜孵育 (~ 16小时) 通常不足以形成紧密的 eb。
  5. 将 eb 转移到低附着板, 用于摇摇培养 (第6天)
    1. 在50毫升离心管中准备 hpgclc 完整介质 (第6天-第13天):
      20毫升 hpgclc 基部培养基, 4μl 的 500 mm 2-硫醇, 50μl 为 20μml l-抗坏血酸, 4μl 为 50 mm y27632, 50μl 为100μgml 重组人 bmp4, 4μl 500μgml 人 scf, 4μl 为250μg/ml 人 egf和8μl 的250μgml 人 lif。
      注意: 使用前立即准备好新鲜的 hpgclc 培养基, 避免暴露在光线下。不要将 hpgclc 完整介质储存在4°c 或隔夜或更长时间内冷冻。
      注意: bmp4 的浓度非常高。最佳 bmp4 浓度在 bmp4 批次之间可能有所不同。bmp4 的批量差异对 hpgclc 的生产有很大影响。在完全 hpgclc 介质中没有 bmp4 的情况下, hpgclc 的产率很低6。hPGCLC surani 6 介绍了其他细胞因子在 hpgclc培养基中的重要性。
      注: 在本协议中, 人 lif 在完整的 hpgclc 介质中的最终浓度为 100 ngml6,10。包括我们在内的先前发表的研究中使用的最终 lif 浓度为1μgml。当人 lif 试剂的特异性活性为 & gt;10,000 unitsμg (ed50 < 0.1 ng/ml) 时, 100 ng/ml lif 足以支持来自 eb 的 hpgclc 生成。
    2. 传输 eb
      1. 预热5毫升 hpgclc 基部培养基和20毫升 hpgclc 在37°c 水浴中的 gt;5 量的完整培养基。
      2. 小心地将电池过滤器倒置在50毫升聚丙烯锥形管的上方。
      3. 微井板的每口井都非常温和地将 eb 从微孔中分离出来。通过单元格过滤器筛选每个井的所有内容, 以删除未纳入 eb 的单元格。
      4. 用预热 hpgclc 基部培养基1毫升清洗细胞过滤器上保留的 eb。轻轻重复洗5次。
      5. 洗涤的 eb 现在保留在过滤器的膜上, 它是在一个50毫升的锥形管倒置。在细胞过滤器上放置一个新鲜的50毫升锥形管, 使细胞过滤器通常位于新管中。然后用新管快速反转电池过滤器。细胞过滤器和管现在处于正常位置, eb 在细胞过滤器的膜下面。
      6. 通过在细胞过滤器膜上方加入18毫升预热 hpgclc 完整培养基, 在锥形管中收集 eb。因此, 培养基将穿过膜, 收集附着在膜下部的 eb, 直至离心管底部。
      7. eb 的板悬浮到低连接6井板 (3 ml/井) 的井中。
      8. 将低连接板放置在三气孵化器 (37°c、6.5% o2、5% co 2) 中的散热片上.将摇摇速度设置为每分钟约20圈。
        注意: 不要施加旋流运动, 因为 eb 聚集在井和保险丝的中心。仔细调整摇摇速度, 使 eb 不聚合。过于剧烈的晃动会对 eb 造成身体伤害。
        注意: 对于 eb 培养物, 强烈建议使用低氧压力。
  6. 在 eb 表面生成 hPGCLCs (第7天-第13天)
  7. 每天准备20毫升 hpgclc 完整的培养基。在不摇晃的情况下, eb 将在 ~ 1分钟内沉入井底, 在不干燥 eb 的情况下去除旧介质 (可能会保持约 0.2 mL/well 旧培养基), 并每天添加新鲜的 hpgclc 完整介质 (3 mL/well)。

3. eb 的免疫组化染色 (第10天–第13天)

  1. 在甲醛固定、石蜡包埋 (ffpe) 免疫染色的细胞外基质蛋白块中嵌入 eb
    1. 要将 hPGCLCs 识别为 oct4+细胞, 请在 1.5 ml 低结合微离心管中收获 eb。让 eb 沉到底部或在室温下短暂离心 (2秒), 并丢弃介质。用冰凉的 pbs (-) 冲洗 eb。
    2. 在 pbs (-) 中取出 pbs (-) 并在1毫升的冰凉 1%(w/v) 中孵育 eb 5分钟。让 eb 沉到底部或在室温下短暂离心 (2秒)。丢弃上清液, 并用冰凉 pbs (-) 冲洗 eb。
      注意: 添加氮化钠会减缓细胞内蛋白质和 rna 转录的降解。
    3. 在冰上解冻200μl 细胞外基质蛋白, 并加入含有 eb 的微离心管。在室温下离开管 ~ 10分钟, 直到凝胶凝固。
    4. 在 pbs (-) 中加入1毫升4% 甲醛, 在室温下孵育 15分钟, 轻轻摇晃。
      注意: 在这一步中, eb 和细胞外基质蛋白都是固定的。在没有固定的情况下, 凝胶块可能会在脱水过程中分解。如果预先固定的 eb 嵌入到凝胶块中, 则 eb 会再次用凝胶块固定, 并且可以过度固定。
    5. 丢弃甲醛, 用冰凉 pbs (-) 冲洗 eb 一次。加入1毫升的70% 乙醇。凝胶嵌入的 eb 可在4°c 下在70% 乙醇中储存一周。
    6. 使用标准 ffpe 协议处理凝胶嵌入式 eb。准备5微米厚度 ffpe 滑块。让幻灯片连夜干燥, 并在室温下存放, 直到免疫染色。
      注: 我们的常规 ffpe 协议如下: 70% 乙醇, 两个变化, 每个 1小时;80% 乙醇, 一次变化, 1小时;95% 乙醇, 一次变化, 1小时;100% 乙醇, 三种变化, 每次1.5 小时;二甲苯, 三个变化, 每个1.5 小时;石蜡 (58-60°c), 两个变化, 每个2小时。脱水组织被嵌入石蜡块中, 并在 3-10μm (通常为 5μm) 处切割。
    7. 对于染色, 在56°c 的烤箱中完全干燥的幻灯片至少 30分钟. 用二甲苯和分级酒精系列进行分离和水合滑块。然后在自来水中清洗滑梯5分钟。
    8. 为了抑制内源性过氧化物酶, 在室温下用 bloxall 阻滞液孵育再水化滑块10分钟。然后用 pbs 清洗幻灯片5分钟。
    9. 在室温下, 用正常马血清 (或其他物种产生的正常血清产生二级抗体) 块滑块20分钟。
    10. 在4°c 的 pbs (-) 中, 用 0.1% bsa 稀释的抗 oct---山羊初级抗体隔夜孵育幻灯片 (优化每个初级抗体的稀释和培养条件)。然后用 pbs (-) 在室温下洗三次幻灯片, 每次5分钟。
    11. 在室温下用抗山羊 igg (马产生的辣根过氧化物-共轭二级抗体; 见材料表) 进行幻灯片培养30分钟。然后用 pbs (-) 在室温下洗三次幻灯片, 每次5分钟。
    12. 在使用前立即混合必要的 dab 染色基板 (见材料表), 并在室温下将幻灯片孵育在完整的 dab 染色溶液中 5分钟. 使用倒置显微镜监测 dab 染色, 停止反应当 oct4+细胞通过快速冲洗流动自来水中的幻灯片来显示时。
    13. 用分级酒精和二甲苯系列脱水幻灯片。幻灯片已准备好进行激光捕捉微解剖。使用安装介质 (参见材料表) 准备永久 ffpe 滑块, 用于高分辨率微观观察。

4. 来自 eb 的低收入企业富营养化技术丰富的 hPGCLCs (第10天–第13天)

  1. 胚胎体分离试剂盒酶混合物的制备
    1. 将50μl 酶 p 添加到 1, 900μl 的缓冲区 x 和涡旋中, 制备酶混合物1。在37°c 的水浴中混合 1 15分钟。
    2. 加入10μl 酶 a 至20μl 缓冲 y, 制备酶混合物2。
    3. 混合酶混合1和 2, 准备完整的 eb 分离酶混合。
  2. 分离的 eb
    1. 在室温下, 在一个15毫升的离心管中从低连接板和离心机中收集 eb, 300 x g 为 2分钟. 使用 10 ml pbs (-) 丢弃上清液并重新悬浮 eb。再次离心。
    2. 用完全 eb 分离酶混合 (4.1.3) 丢弃上清液并重新悬浮 eb。在37°c 的水浴中培养 eb 悬浮液 15-20分钟, 直到 eb 分离。在孵育过程中, 每3-5分钟轻轻移液 eb, 以促进离解。或者, 使用与胚胎体分离计划的自动解锁。
    3. 加入冰凉8毫升 pbs (-) 分离的 eb 细胞悬浮液。通过40微米的细胞过滤器过滤细胞悬浮液。用1毫升冰凉 pbs (-) 清洗细胞过滤器3次。
    4. 使用库尔特计数器对过滤后的细胞悬浮液中的细胞进行计数。
    5. 在4°c、300 x g 下离心细胞悬浮液 8分钟, 并丢弃上清液。用冰凉 10 ml pbs (-) 重新扫描细胞颗粒。
    6. 将细胞悬浮液分成两个管, 一个用于无染色控制 (~ 10个5个细胞), 另一个用于抗 cd38 染色 (所有剩余细胞)。
    7. 在 4°c, 300 x g 的温度下离心两管8分钟。
  3. 抗 cd38 染色和高细胞化细胞仪的富集体富集
    1. 在 pbs (-) 中使用200μl 冰冷 3% (w/v) bsa 和 1% (w/v) 氮化钠进行无染色控制的再置细胞颗粒。放置在冰上, 直到流式细胞术。
      注: 添加氮化钠会减缓 cd38 从细胞表面的内化。
    2. 用冷冻 3% (w/v) bsa 和 1% (w/v) 的氮化钠 (-) 将抗 cd38 染色的抗 cd38 细胞颗粒在 pbs (-) 到 1x10 6 细胞每100μl。
    3. 加入10μl 每 1 x 10 6 细胞的 fas 级, apc 共轭抗 cd38 抗体。用铝箔覆盖管, 避免暴露在光线下。在4°c 下孵化 45分钟, 轻轻摇晃。
    4. 加入5毫升冰凉 pbs (-) 和离心机在 4°c, 300 x g 8分钟. 丢弃上清液, 并重新悬浮细胞颗粒与5毫升冰凉 pbs (-)。用 pbs (-) 重复清洗共三次。
    5. 在 pbs (-) 中, 用500μl 冷 3% (w/v) bsa 和 1% (w/v) 将氮化钠重新弹性细胞颗粒, 使其细胞密度适合流式细胞仪。
    6. 丰富 hPGCLCs 作为 cd38+细胞, 通常形成明显的细胞群。使用无染色控制, 以确保 cd38+ 细胞的识别。hPGCLCs 的典型产率为从第10天 eb 开始检查的所有 fas 单细胞的1-5 和第13天 eb 的20-40。

Representative Results

这里使用的微井板采用24井格式, 有8口井, 容纳微井板, 每口都支持形成多达 1, 200个 eb。从大约2400万的4i 幼稚多能细胞, 这个微井板通常产生 ~ 8, 000个 eb, 包括 ~ 3, 000个细胞每个 eb。在不断摇晃的 eb 非粘附培养过程中, 由于自发的自溶解, 完整的 eb 数量逐渐减少, ~ 3, 000个 eb 存活到协议第13天。这些幸存的 eb 大多表面有 50-200 hPGCLCs (通过对 eb 连续切片中 oct4 + 细胞的免疫组织化学检测估计; 见图 8), 总共产生约 100, 000个 oct4 + hPGCLCs。将 eb 酶消化成单个细胞是一个相对低效的过程, 将富 fs 富集 cd38+ hPGCLCs 的产量降低到 9, 000-47, 000 细胞。在我们手中, 平均6批独立但连续的实验为 14 038±5, 731 (平均±sem)。因为 cd38 阴性 eb 细胞表达 oct4 mrna (qpcr) 或蛋白质 (免疫组织化学) 只有非常微弱的, 如果不是完全不存在, 所有 eb 细胞强烈表达 oct4 蛋白实际上是等效的整个种群的 cd38 + hPGCLCs。

此协议的关键参数包括细胞密度。当 2.0 x105人 ipsc 接种6井细胞培养板 (每口培养面积9.60 厘米 2) 的细胞外基质蛋白涂层井, 培养基为2毫升 y27632 补充介质 (2.2.9) 时, 细胞在24时将达到约20-30 的融合度接种数小时后 (图 1)。在没有 y7632 的情况下, 在 mtesr1 培养基中进行额外的24小时培养后, 细胞聚集并形成菌落, 占生长面积的约 30% (图 2)。然后在4i 重编程培养基 (2.3.2) 中培养细胞。在4i 培养基中培养24小时后, 细胞就会融合 (图 3)。在4i 培养基中增加24小时培养, 使细胞密集包装 (图 4)。介质变化的确切时间 (每 24小时 +/4小时) 和细胞密度对于成功形成 eb 和 hPGCLCs 至关重要。

在4i 培养基中48小时培养后, 细胞被分离并接种到微井板上, 微井板的大小为 400μm (2.4)。尽管该商用微井板由制造商涂覆用于低附着力表面, 但建议使用洗涤剂 (2.4.3) 进行新鲜的再涂层, 以降低不必要的电池粘附风险。800μm 微束降低了 hPGCLCs 的收率, 表明 eb 尺寸对于适当定向分化的重要性。在4i 介质中接种的细胞将在24-30小时在微细胞中形成 eb, 使用标准的倒置相对比显微镜可以观察到这一点 (图 5)。在孵育24小时后, e b 的圆形轮廓变得清晰可见。不建议在其圆形轮廓清晰之前的较早时间 (例如接种后 16小时) 收获 e b, 因为这种 e b 很容易受到机械损害, 容易被拆除。请注意, 大量天真的 hpsc 不包含在 eb 中, 这是正常的。这些未合并的细胞将在低粘附表面 (2.5.2) 上启动 eb 的摇化培养之前被冲走。另请注意, 在我们的协议中, eb 是在4i 天真多能介质中形成的, 而不是在 hpgclc 介质中形成的。在接触 hpgclc 介质之前, 在4i 介质中预形成固体 eb 对于在 eb 表面的 hpgclc 分布具有重要意义。

在摇摆不定的非粘附培养条件下保持在 hpgclc 介质中的 eb 将保持其球形形状, 而不会聚集或融合 (图 6 和图 7)。太弱的摇摆条件会导致 eb 聚集和融合, 但太苛刻的条件会拆除 eb。人类 pgclc 在 hpgclc 培养基中早在5天培养后就会在 eb 表面作为 oct4 表达细胞出现, 其数量增加到8天培养 (图 8)。进一步培育能源----可能会导致 eb 被拆除和 hPGCLCs 的损失。人 pgclc 在 hpgclc 培养基中培养5-8 后, 可作为 cd38+ 细胞从酶解离的 eb 细胞中富集 (图 9)。

Figure 1
图 1: 接种24小时后 y27632 补充培养基中的人 ipsc 细胞培养.细胞密度约为20-30 的融合。在 rock 抑制剂 y27632 的存在下, 细胞往往以长长的尖峰伸长率很好地扩散。刻度杆 = 100μm。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2: 接种48小时后的人 ipsc 细胞培养.细胞聚集形成菌落, 占生长面积的约30%。刻度杆 = 100μm。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3: 人类 ipsc 细胞培养在4i 重编程介质中孵育 24小时.细胞达到融合。刻度杆 = 100μm。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 4
图 4: 人类 ipsc 细胞培养在4i 重编程介质中孵育 48小时.密闭细胞密集地被包装。刻度杆 = 100μm。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 5
图 5: 在4i 重编程介质中24小时孵育后, 人类 ipsc eb 在微细胞中形成.在接种后24-30小时内, eb 的圆形轮廓就会显现出来。当轮廓在相衬显微镜下确认时, e b 就可以转移到摇摆不定的培养条件下。刻度杆 = 500μm。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 6
图 6: 人类 ipsc eb 在 hpgclc 介质中孵育 24小时.eb 在很大程度上保持了其球形形状。刻度杆 = 500μm。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 7
图 7: 人类 ipsc eb 在 hpgclc 介质中孵育 192小时.与24小时培养时的外观相比, eb 被放大, 但它们在很大程度上仍然保持球形形状, 没有聚集或融合。刻度杆 = 500μm。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 8
图 8: 表示 oct4 的人 pgclc 在 hpgclc 介质中孵育192小时的 hepsc eb 表面进行定位.将 eb 嵌入细胞外基质蛋白中, 并对 oct4 (dab 基板) 的 ffpe 滑块免疫组化染色进行处理。刻度栏 = 1 毫米. 请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 9
图 9: 利用流式细胞仪作为 cd38+细胞从酶解离解的 eb 细胞中富集人 pgclc.在 hpgclc 培养基中孵育5-8 后, 通过酶消化分离 eb 制备单细胞悬浮液。hPGCLCs 可以通过流式细胞仪 (红点) 作为 cd38+细胞进行富集。不表示 cd38 (蓝点) 的 eb 细胞也应作为负对照收集。cd38 阳性细胞和 cd38 阴性细胞的流式细胞仪门应以较大的边缘 (绿点) 分离, 以避免每种类型的细胞受到污染。上面板和下板分别显示没有或有抗 cd38 抗体染色的 facs 特征。请点击这里查看此图的较大版本.

Discussion

使用这里描述的协议的 hPGCLCs 的稳健生产得到了三个具有正常二倍体核型10的人 ipsc 独立克隆的证实。这些 ipsc 克隆体来源于同一人类新生儿真皮皮肤成纤维细胞培养10。本文作者将根据请求并根据适当的材料转让协议和冷冻活人牢房的运输安排, 向调查人员提供这些资料。目前尚不清楚是否需要正常的核型才能使用我们的协议或其他实验室报告的协议进行稳健的 hpgclc 生产。

最近的研究表明, 使用 saitou 的京都大学8组描述的协议从 hpsc 11 或 esc14中生产 hPGCLCs 取决于 eomesosermin 的表达, eomes功耗 min 是sox17 的诱导。sox17 似乎是决定转录因子的主系, 在人多能干细胞的种系分化中发挥着重要作用.eomesodemin 是由eomes基因编码的, 在 hpgclc 生产条件11中, eomes的 crispric/cas9 敲除导致几乎完全没有 sox17 诱导, 其他基因的表达遵循了相同的模式。sox17 空敲除细胞。在 hpgclc 诱导培养过程中, eomesodemin 在eomes-空敲除细胞中的诱导载体过度表达, 有效地挽救了 hpgclc 的强效产生以及对包括 sox17 在内的种系基因的诱导。相反, 诱导过度表达 sox17 也挽救了强大的 pgclc 生产, 但没有诱导 eomes。因此, eomesodemin 是 sox17 的关键上游诱导剂, 这似乎是 eomesodemin 在人类多能干细胞 hpgclc 诱导中最重要的作用。我们的协议在 hpsc10 中诱导 sox17, 但它对 eomesodemmine 诱导的依赖有待确定。

该协议将在 mtesr1 介质中维护96小时的初级多能人 ipsc 转换为与 erk 无关的天真多能, 在4i 重编程介质6中, 这是一种经过修饰的天真的人干细胞培养基 (nhsm)5。我们试图从相同的人类 ipsc 克隆开始生成 hPGCLCs, 但在4i 重新编程介质中的培养之前, 我们在其他商业上可获得的人类 ipsc 生长介质中进行了维护, 从而导致 hPGCLCs 的产量降低。尽管其他媒体的长期适应是否能提高 hpgclc 的生产仍有待在未来的研究中确定, 但这一观察表明, 在4i 重新编程之前, 人类 ipsc 的引贴多能性的确切状态仍有待确定影响4i 培养基的 eb 形成和 hpgclc 培养基中的 eb 分化。

按照我们的协议从高保安防中生产 hPGCLCs 是稳健和高度可重复的, 部分原因是使用了微井板, 能够高效生产大量尺寸均匀 (每片电子供应链 3, 000个 hpsc) 的 eb (每批约 8, 000个 eb)。使用我们的协议在单批实验中容易产生的 eb 数量可能远远大于使用常规 u 底细胞培养井的方法。生产大量同等大小的与 hPGCLCs 一致的 eb, 可以提供高通量化学筛选的独特机会, 以识别影响 pgc 规格或其规格的小分子量激活剂或抑制剂。生物特征, 如表观遗传重编程。这类 e b s 也可用于大量胚系细胞毒物的毒理评估, 不仅包括环境污染物, 还包括临床规定的药物, 如化疗药物。

使用所提交的协议可靠和可重复地生产 hPGCLCs 的关键因素包括: (一) 使用 mtesr1 中关于细胞外基质蛋白的健康高 psc, (ii) 按照规定和严格的方式接种确切数量的细胞遵循介质变化和亚培养的时间, (iii) 选择大量的人重组 bmp4, (iv) 在摇摇培养过程中最大限度地减少 eb 的物理损伤。我们的经验是, 最好的 bmp4 试剂工作在 100 ngml 浓度, 而其他很多 bmp4 试剂需要2倍或更大的剂量。另一方面, 在 bmp4 的较高剂量 (例如, 200 ng/ml) 下, 使用最佳 bmp4 量的 hPGCLCs 生产的产量则有所下降。我们建议测试从多个供应商获得的几种不同数量的重组人 bmp4 试剂, 以确保它们在支持 hpgclc 生成方面的性能, 并确保大量最佳批次。

我们的 hpgclc 协议的一个独特之处在于, hpgclc 在eb10最外层进行本地化 (图 8), 而其他协议可以在单元聚合6,8的中间生成 hpgclc。胚胎体往往形成多个不同的层, 如表面、外壳、内壳和核心, 而中央核心区域往往因营养物质、氧气供应有限以及培养中提供的促进存活的因素而坏死中通过扩散20。由于向 eb 中心扩散有限而在 eb 表面定位 hPGCLCs 而不受任何限制, 可能有利于 hPGCLCs 直接、时间和剂量控制接触药物或有毒物质的药理作用或毒理学研究。

小鼠 pgclc 显示出强大的全基因组 dna 脱甲基化, 至少部分涉及印迹控制区域,但 ppclc 中的全球 gdna 脱甲基化程度似乎弱于小鼠pgclcs 或 pgc6、7。转录谱表明, 与小鼠 pgclc 10 相比, hPGCLCs 可能类似于胚胎 pgc的早期阶段。据报道, 在 hpgclc 生产条件下, 长期培养 eb 导致 gdna 脱甲基化程度提高;然而, 在 eb 中长期培养 hPGCLCs 或作为孤立细胞是否能够达到更高级的种系分化阶段, 需要由未来的研究来确定。

Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

我们感谢 shiomi yawata 和 chie owa 在初步研究期间提供的技术援助。这项研究得到了 niehssee nih 向 jhh 提供 re0023316 和 r21es024861 向 ts 的资助, 并得到了飞行辅助医学研究所 (famri) 的资助。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Primed pluripotency hiPSC culture
Matrigel Corning 354277 Aliquot Matrigel at the volume indicated by the manufacturer (about 200 μL). Use cold tubes. Store at -80 °C
DMEM/F-12 Thermo Fisher Scientific 21041-025 Store at 4 °C.
mTeSR1 STEMCELL Technologies 85850 Reconstitute by adding 5X Supplement to Basal Medium. The reconstituted medium can be stored at 4 °C for up to
4 weeks without affecting cell culture performance.
Y27632 Axon 1683 Dilute 5 mg Y27632 (MW 320.26) with 312.2 μL water to prepare 50 mM Y27632 stock solution. Sterilize by filtration (0.22 μm). Aliquot 20 μL/tube x 15 tubes and store at -20 °C.
CryoStor CS10 STEMCELL Technologies 07930 Store at 4 °C.
Accutase Innovative cell technologies AT104-500 Cell dissociation enzyme; aliquot 40 mL/tube x 12 tubes and store at -20 °C.
Name Company Catalog Number Comments
4i hiPSC culture
KnockOut DMEM Thermo Fisher Scientific A1286101
KnockOut Serum Replacement Thermo Fisher Scientific 10828028 Aliquot 40 mL/tube x 12 tubes and store at -20 °C.
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x) Thermo Fisher Scientific 10378016
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) Thermo Fisher Scientific 11140050
Insulin from bovine pancreas Sigma-Aldrich I1882-100MG Add 0.1 mL glacial acetic acid to 10 mL water. Sterilize by filtration (0.22 um). Dilute 100 mg insulin lyophilized powder with cold 10 mL the acidified water to make 10 mg/mL stock solution. Aliquot 650 μL/tube x 15 tubes and store at -80 °C.
human LIF PeproTech 300-05 Reconstitute 250 μg human LIF with 250 μL water. Add 750 μL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 250 μg/mL human LIF stock solution. Specific activity of this product is >10,000 units/μg. Aliquot 40 ul/tube x 25 tubes and store at -80 °C.
human FGF2 R&D Systems 4114-TC Reconstitute 1 mg human FGF2 with 5 mL PBS(-) to make 200 μg/mL human FGF2 stock solution. Aliquot 100 μL/tube x 50 tubes and store at -80 °C.
human TGF-β1 PeproTech 100-21 Reconstitite 50 μg with 50 μL of 10 mM Citric Acid (pH 3.0). Add 150 μL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 250 μg/mL human TGF-β1 stock solution. Aliquot 4 μL/tube x 50 tubes and store at -80 °C.
4i basal medium Mix the following reagents to make 4i basal medium.
500 mL of KnockOut DMEM
100 mL of KnockOut Serum Replacement
6 mL of Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x)
6 mL of MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)
650 µL of 10 mg/mL Insulin from bovine pancreas
40 µL of 250 µg/mL human LIF
20 µl of 200 µg/ml human FGF2
4 µl of 250 µg/ml human TGF-β1
Aliquots 40 ml/tube and store at -80 °C.
CHIR99021 Axon 1386 Reconstitute 25 mg CHIR99021 (MW 465.34) with 1791 μL DMSO to make 30 mM CHIR99021 stock solution. Aliquot 50 μL/tube x 35 tubes and store at -20 °C.
PD0325901 Axon 1408 Reconstitute 5 mg PD0325901 (MW 482.19) with 1037 μL DMSO to make 10 mM PD0325901 stock solution. Aliquot 50 μL/tube x 20 tubes and store at -20 °C.
BIRB796 Axon 1358 Reconstitute 10 mg BIRB796 (MW 527.66) with 948 μL DMSO to make 20 mM BIRB796 stock solution. Aliquot 50 μL/tube x 18 tubes and store at -20 °C.
SP600125 Tocris 1496 Reconstitute 10 mg SP600125 (MW220.23) with 908 μL DMSO to make 50 mM SP600125 stock solution. Aliquot 50 μL/tube x 18 tubes and store at -20 °C.
AggreWell400 STEMCELL Technologies 27845 Microwell plate
Pluronic F-127 Sigma-Aldrich P2443 Reconstitute 5 g Pluronic F-127 in 100 mL water to make 5%(w/v) Pluronic F127 stock solution. Sterilize by filtration (0.22 um). Aliqout 50 mL/tube x 2 tubes and store at r.t.
Name Company Catalog Number Comments
hPGCLC culture
Glasgow’s MEM Thermo Fisher Scientific 11710035
Sodium pyruvate (100 mM) Thermo Fisher Scientific 11360070
Penicillin-Streptomycin (100x) Corning 30-002-CI
hPGCLC basal medium Mix the following reagents to make hPGCLC basal medium.
500 mL of Glasgow’s MEM
75 mL of KnockOut Serum Replacement
6 mL of MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)
6 mL of 100 mM Sodium pyruvate
6 mL of Penicillin-Streptomycin (x100)
Aliquots 40 mL/tube and store at -20 °C.
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148 Dilute 350 μL 2-Mercaptoethanol (14.3 M) in 9.65 mL PBS(-) to make 500 mM 2-Mercaptoethanol stock solution . Store at 4 °C.
L-Ascorbic acid Sigma-Aldrich A4544 Reconstitute 400 mg L-Ascorbic acid with 20 mL water to make 20 mg/mL L-Ascorbic acid stock solution. Sterilize by filtration (0.22 um). Aliquot 500 μL/tube x 40 tubes and store at -20 °C.
Recombinant human BMP4 R&D Systems 314-BP Reconstitute 1 mg recombinant human BMP4 with 10 mL of 4mM HCl aq. to make 100 μg/mL recombinant human BMP4 stock solution. Aliquot 250 μL/tube x 40 tubes and store at -80 °C.
Human SCF PeproTech 300-07 Reconstitute 250 μg human SCF with 500 μL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 500 μg/mL human SCF stock solution. Aliquot 35 μL/tube x 14 tubes and store at -80 °C.
Human EGF PeproTech AF-100-15 Reconstitute 1 mg human EGF with 1 mL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 1 mg/mL human EGF stock solution. Aliqot 100 μL/tube x 10 tubes. Dilute 100 μL of 1 mg/ml human EGF stock solution with 300 μL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 250 μg/mL humanEGF stock solution. Aliquot 20 μL/tube x 20 tubes. Store at -80 °C.
Cell strainer Corning 352340 Pore size = 40 μm.
50 ml polypropylene conical tube Corning 352070
Low attachment plate Corning 3471
Vari-Mix Platform Rocker Thermofisher M79735Q
Name Company Catalog Number Comments
Immunohistochemical staining
BLOXALL Blocking Solution VECTOR SP-6000
Normal Horse serum
ImmPRESS Reagent Anti-Goat IgG		 VECTOR MP-7405
OCT-3/4 Antibody Santa Cruz SC-8629
ImmPACT DAB VECTOR SK-4105
Permount Thermofisher SP15-100 Mounting medium
Name Company Catalog Number Comments
Isolating hPGCLC
Embryoid Body Dissociation Kit Miltenyi Biotec 130-096-348
Anti-CD38 antibody conjugated to APC abcam ab134399

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References

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发育生物学 第143期 原生生殖细胞 原始生殖细胞样细胞 (pgclc) 诱导多能干细胞 引元多能性 天真多能性 胚胎体
从原生多能诱导干细胞中生成胚胎体表面的人原始生殖细胞样细胞
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Mitsunaga, S., Shioda, K.,… More

Mitsunaga, S., Shioda, K., Isselbacher, K. J., Hanna, J. H., Shioda, T. Generation of Human Primordial Germ Cell-like Cells at the Surface of Embryoid Bodies from Primed-pluripotency Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (143), e58297, doi:10.3791/58297 (2019).

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