Generatie van menselijke primordiale geslachtscellen-achtige cellen aan de oppervlakte van Embryoid instanties van primer-pluripotent geïnduceerde pluripotente stamcellen

Summary

Primordiale kiemcellen (PGCs) zijn gemeenschappelijk voorlopers van zowel de zaadcellen als de eicellen. Menselijke embryonale PGCs zijn opgegeven uit pluripotente cellen van de epiblast door middel van interacties van cytokinen. Hier beschrijven we een 13-daagse protocol van het inducerende menselijke cellen transcriptomally gelijkend op PGCs aan het oppervlak van embryoid instanties van primer-pluripotent geïnduceerde pluripotente stamcellen.

Abstract

Primordiale kiemcellen (PGCs) zijn gemeenschappelijke precursoren van alle kiemcellen-cellen. In muis embryo's, een stichtende bevolking van ~ 40 PGCs veroorzaakt uit pluripotente epiblast cellen georkestreerde blootstelling aan cytokines, met inbegrip van bot morfogenetische eiwit 4 (Bmp4). In menselijke embryo's, de vroegste PGCs geconstateerd op de endodermal muur van de dooierzak rond het einde van de 3^rd -week van de zwangerschap, maar er is weinig bekend over het proces van menselijke PGC specificatie en hun vroege ontwikkeling. Om te omzeilen van de technische en ethische grenzen van menselijke embryonale PGCs studeren, hebben surrogaat cel cultuur modellen onlangs verkregen uit pluripotente stamcellen. Hier beschrijven we een 13-daagse protocol voor robuuste productie van menselijke cellen van de PGC-Like (hPGCLCs). Menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs) in de primer pluripotent staat gehandhaafd worden geïncubeerd in de 4i naïef herprogrammering medium voor 48 uur losgekoppeld aan afzonderlijke cellen en verpakt in microwells. Langdurig behoud van hiPSCs in de naïeve pluripotent Braziliaanse veroorzaakt aanzienlijke chromosoomafwijkingen en moet worden vermeden. hiPSCs in de microwells worden gehandhaafd voor een aanvullende 24 uur in de 4i middellange tot formulier embryoid organen (EBs), die vervolgens gekweekt in lage-adherentie plasticware onder een rockende voorwaarde in de hPGCLC inductie opslagmedium met een hoge concentratie van recombinante menselijke BMP4. EBs worden verder gekweekt voor maximaal 8 dagen in de rockende, niet-aanhanger voorwaarde te verkrijgen van de maximumgehaltes van hPGCLCs. HPGCLCs worden door immunohistochemistry, gemakkelijk gedetecteerd als cellen sterk uiting te geven aan OCT4 in bijna alle EBs uitsluitend op hun oppervlak. Wanneer EBs enzymatisch losgekoppeld en onderworpen aan FACS verrijking, hPGCLCs kunnen worden verzameld als CD38 + cellen met korting tot 40-45% opleveren.

Introduction

Primordiale kiemcellen (PGCs) zijn gemeenschappelijke precursoren van alle germline cellen in beide geslachten. De meeste van onze kennis over de ontwikkeling van PGCs in zoogdieren embryo's is verkregen door het bestuderen van laboratorium muizen^1,2. Ten embryonale dage 6.0-6.5 van muis embryo's, bevinden 6 of soortgelijke kleine aantallen PGC precursoren zich in de epiblast, en een oprichtende bevolking van ~ 40 die pgcs worden veroorzaakt van hen op een wijze afhankelijk van bot morfogenetische eiwitten Bmp2 en uitgescheiden door aangrenzende Bmp4 cellen. De vroegste menselijke PGCs tot nu toe geïdentificeerd in embryo's werden op de endodermal muur van de dooierzak op rond het einde van de derde week van de dracht³. Omdat dit dezelfde plaats zoals migreren PGCs worden waargenomen in muis embryo's, is het waarschijnlijk dat de waargenomen menselijke PGCs in het pad van migratie, maar niet de oorspronkelijke bevolking waren. Echter bestudeert traceren terug eerdere fasen van PGCs of PGC precursoren in menselijke embryo's hebben gemist.

Toegang tot menselijke embryonale PGCs is uitdagend als gevolg van zowel ethische als technische obstakels. Om te overwinnen van deze hindernissen, zijn PGC-achtige cel cultuur modellen onlangs gegenereerd van menselijke pluripotente stamcellen (PSC's). Pluripotent is de cellulaire mogelijkheid om te differentiëren in de kiemcellen en drie embryonale kiem lagen⁴. Overwegende dat de menselijke PSC's bijgehouden in het mTeSR1 medium (een kant-en-klare commercieel verkrijgbare medium geformuleerd voor onderhoud van menselijke PSC's in de primer pluripotent) op gerechten bekleed met de extracellulaire matrix eiwitten hebben primer statuswaarden pluripotent ⁴, in 2013 Jacob Hanna's lab bleek dat de primer pluripotent cellen kunnen worden omgezet in een naïef pluripotent staat door bloot aan het naïef menselijke stamcellen medium (NHSM) met chemische inhibitoren aan eiwit kinases ERK1/2, GSK3, JNK, ROCK, PKC, p38 MAPK alsmede groeifactoren LIF, TGF, bFGF⁵. Van de naïeve-pluripotent menselijke PSC, in 2015 bereikt een onderzoeksgroep onder leiding van Hanna en Azim Surani de eerste robuuste productie van menselijke PGC-Like cellen (hPGCLCs) van PSC's⁶. Later gemeld verschillende andere laboratoria, met inbegrip van onze generatie van hPGCLCs van de PSC's met behulp van enigszins verschillende protocollen^7,,^8,,^9,10. Onze studie aangetoond dat hPGCLCs gegenereerd met behulp van verschillende protocollen (die zijn samengevat in tabel S1 van onze eerder gepubliceerde studie¹⁰) transcriptomally vergelijkbaar met elkaar^{10 zijn}. Beschikbare bewijs ondersteunt de gelijkenis van menselijke PGCLCs te vroeg stadium menselijke embryonale PGCs voorafgaand aan de wereldwijde epigenetische uitwissing⁷ en/of Chemotactische migratie¹⁰.

Studies van muis embryonale PGCs, muis PGCLCs en menselijke PGCLCs (maar met enige zeer beperkte toegang tot menselijke PGCs) is gebleken dat de moleculaire mechanismen van PGC specificatie aanzienlijk tussen muis en menselijke^{1,6verschillen, 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16 ,17}. Bijvoorbeeld, Prdm14 speelt belangrijke rol in de specificatie van de PGC te plaatsen in muis embryo's, maar zijn rol in menselijke PGC specificatie lijkt beperkt^1,15. In tegenstelling, is inductie van SOX17 door EOMESODERMIN essentieel voor PGC specificatie^6,11,14, overwegende dat deze transcriptiefactoren overbodig voor muis PGC specificatie^{15 lijken}. Deze initiële resultaten van studies met hPGCLCs sterk ondersteunen het belang van deze cel cultuur model als een surrogaat voor menselijke embryonale PGCs.

Onlangs gepubliceerde studies, waarbij onze lab diepe sequencing evaluatie van genomic DNA kopie nummer analyse, hebben aangetoond dat langdurig onderhoud van PSC's in de naïeve pluripotent Braziliaanse aanzienlijk het risico van chromosomale instabiliteit verhoogt en structurele afwijkingen. Dit verschijnsel werd waargenomen met zowel muis¹⁸ en menselijke¹⁹ PSC's. Het oorspronkelijke hPGCLC productie protocol gerapporteerd door Hanna/Surani werd ontwikkeld voor menselijke PSC's gehandhaafd in het 4i naïef pluripotent medium voor ten minste 2 weken,⁶. Voor het behoud van het normale diploïde karyotype van menselijke PSC's en PGCLCs, ontwikkelden we een gewijzigde protocol waarin menselijke PSC's worden blootgesteld aan het medium 4i voor slechts 72 uur¹⁰, die in dit artikel wordt gepresenteerd. Menselijke iPSCs (hiPSCs) worden gehandhaafd onder de primer pluripotent staat. Onmiddellijk voorafgaand aan de vorming van de EB, cellen worden ge¨ uncubeerd in het 4i naïef herprogrammering medium (een gemodificeerde NHSM medium) 48 uur. Cellen worden dan losgekoppeld en verpakt in microwells aan vorm EBs voor een aanvullende 24 uur in het 4i medium. EBs worden bijgehouden in hPGCLC inductie opslagmedium met een hoge concentratie van recombinante menselijke BMP4 onder een rockende voorwaarde voor neen-gehechtheid cultuur voor tot 8 dagen voor de maximale opbrengst van hPGCLCs. Na 8-daagse EB cultuur, kunnen hPGCLCs worden geïsoleerd van gedissocieerde EB cellen door FACS zoals CD38 + cellen met korting tot ~ 40% in FACS-sorteerbare eencellige suspensie rendement. Overwegende dat andere gepubliceerd methoden^7,8,9, met inbegrip van het oorspronkelijke protocol vóór onze wijzigingen⁶, genereren meestal hPGCLCs in spontaan opgemaakte cel aggregaten zonder specifieke lokalisatie, hPGCLC geproduceerd door ons protocol worden waargenomen bij het oppervlak van embryoid instanties (EBs).

Protocol

1. de celcultuur van hiPSCs in de Primed pluripotent Braziliaanse

1. Extracellulaire matrix eiwitten-bedekt gerechten bereiden
   1. Matrigel (extracellulaire matrix eiwit) op ijs in een ijskast of een koude kamer 's nachts ontdooien (niet ontdooien bij kamertemperatuur of met behulp van een warm waterbad). Aliquot matrix eiwitten (~ 200 μl; het volume van een aliquoot deel wordt bepaald door de fabrikant voor elke partij en aangegeven op het etiket van flesje) in een steriel laag-bind centrifuge buizen of cel cryopreservatie buizen op ijs. Het is belangrijk om te houden van extracellulaire matrix eiwitten ijskoude tijdens toedieningseenheden Voorkom stollen. Opslaan van de aliquots bij-80 ° C.
   2. Om de jas cel cultuur kunststof gerechten met eiwitten van de extracellulaire matrix, Verdun een aliquoot gedeelte met 25 mL ijskoud DMEM/F12 en verspreiding tot drie 10-cm schotels (~ 8 mL/schotel). Incubeer gerechten bij kamertemperatuur gedurende ten minste 1 uur. Na coating, kunnen gerechten worden verzegeld met behulp van Parafilm en bewaard bij kamertemperatuur voor tot een week.
   3. Medium uit gerechten onmiddellijk vóór inoculatie van primer pluripotent hiPSCs gecombineerd. Het is niet nodig om de gecoate afwas met middellange of calcium/magnesium-gratis-fosfaatgebufferde zoutoplossing [PBS(-)].
2. Inleiding van hiPSC cultuur in de primer pluripotent Braziliaanse
   1. Voeg 2 µL van 50 mM Y27632 [remmer van Rho-geassocieerde proteïne kinase (rots)] tot 10 mL van mTeSR1 medium in een centrifugebuis van 15 mL. Twee buizen van ROCK Inhibitor van de omwenteling-aangevuld 10 mL medium in te leiden van de cultuur van de cel in een 10-cm schotel van 1 mL bevroren cel voorraad voor te bereiden. Gebruik medium Y27632-aangevuld op dezelfde dag. Prewarm Y27632-aangevuld medium in een waterbad 37 ° C gedurende 5 minuten.
      Opmerking: Dit protocol werkt goed met hiPSCs in mTeSR1 gehandhaafd. Wanneer hiPSCs worden bijgehouden in andere media ondersteuning van menselijke groei van de PSC met variërende graden van primer of naïef pluripotent, rendement van hPGCLCs kan aanzienlijk variëren.
      Opmerking: De houdbaarheid van de volledige mTeSR1 is 2 weken bij 4 ° C en 6 maanden bij-20 ° C, maar opnieuw bevriezen oorzaken slechte prestaties. We bevriezen 40 mL aliquots van mTeSR1 bij-20 ° C tot gebruik.
   2. Ontdooi een flesje van primer pluripotent hiPSC bevroren voorraad (1.0-3.0 x 10⁶ cellen in 1 mL cryopreservatie medium) met behulp van een waterbad 37 ° C. Onmiddellijk na voltooiing van het ontdooien, breng de gehele inhoud van een flacon in één buis (10 mL) van voorverwarmde Y27632-aangevuld medium.
   3. Centrifuge celsuspensie bij kamertemperatuur, 300 x g voorverwarmde voor 8 min. Verwijder supernatant en resuspendeer de pellet cel met 10 mL Y27632-aangevuld uit de andere buis.
   4. Gelijkmatig celsuspensie in een extracellulaire matrix eiwitten-bedekt 10-cm schotel. Plaats de schotel in een tri-gas CO₂ incubator (37 ° C, 6,5% O₂, 5% CO₂). HiPSC cultuur onder de druk van een lage zuurstof te handhaven.
   5. Verandering medium (mTeSR1 zonder Y27632) elke dag. De ROCK-remmer (Y27632) is essentieel voor hiPSC voortbestaan onmiddellijk na de dissociatie aan afzonderlijke cellen. Zodra hiPSCs aan de extracellulaire matrix eiwitten-bedekt oppervlakte als gelijkmatig verdeelde kleine aggregaten met voldoen > 10% confluentie (die meestal binnen 16 uur na inoculatie is voltooid), Y27632 is overbodig. Te vroeg middellange wijziging na inoculatie van gedissocieerde hiPSCs zonder Y27632 kan veroorzaken bijna volledige celdood.
3. Passaging primer pluripotent hiPSCs
   Opmerking: Passage primer pluripotent hiPSCs wanneer kolonies ~ 80% van de oppervlakte van de effectieve groei bezetten. Juiste passaging procedures en de dichtheid is belangrijk voor experimentele reproduceerbaarheid. We hebben gezien dat efficiëntie van hPGCLC-inductie niet significant verschillend tussen hiPSC culturen 6 dagen na de inleiding van een bevroren voorraad is (waarbij één of twee passages) of een maand (met > 10 passages). Inductie van hPGCLC werd met succes uitgevoerd van hiPSCs onderhouden voor meer dan twee maanden, hoewel de efficiëntie werd niet kwantitatief onderzocht.
   1. Neem 4 mL van cel dissociatie enzym mengsel in een centrifugebuis van 15 mL en equilibreer tot kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
   2. Prewarm 10 mL PBS(-) in een centrifuge 15 mL tube voor > 5 minuten bij 37 ° C in een waterbad.
   3. Voeg 2 µL van 50 mM Y27632 (ROCK-remmer) tot 10 mL mTeSR1 medium in een centrifugebuis van 15 mL. Bereiden van twee buizen van het medium van de Inhibitor van de omwenteling-aangevuld 10 mL ROCK en gebruik in dezelfde dag. Neem 5 mL mTeSR1 zonder Y27632 toe te voegen in een ander 15 mL centrifugebuis. Prewarm medium +/-Y27632 in een waterbad 37 ° C gedurende 5 minuten.
      Opmerking: Alle middelgrote aliquots bereid in stap 1.3.3 kunnen bevatten Y27632.
   4. Oud medium uit een 10-cm schotel en spoel de cellen eenmaal met voorverwarmde 10 mL PBS(-) gecombineerd. PBS(-) negeren en voeg 4 mL dissociatie enzym tot de schotel. Zet de schotel in een CO₂ incubator (couveuse tri-gas werkt, maar niet noodzakelijk) voor ~ 4 min tot cellen los van de bodem. Zachtjes Pipetteer cellen op en neer om eencellige schorsing.
   5. Spoel hiPSC eencellige suspensie op de prewarmed buis met 5 mL medium zonder Y27632 (totale volume in een buis 15 mL is ongeveer 9 mL). Centrifuge celsuspensie bij kamertemperatuur, 300 x g gedurende 8 minuten.
   6. Verwijder supernatant en resuspendeer de pellet van de cel met 10 mL van de prewarmed middellange medium met Y27632.
   7. Verwijder cel aggregaten met behulp van een 40-µm cel zeef en bepalen van de celdichtheid met behulp van een Coulter counter.
   8. Verdun celsuspensie met voorverwarmde Y27632-aangevuld medium om 3.0 x 10⁶ cellen in 10 mL om te enten een extracellulaire matrix eiwitten-bedekt 10-cm schotel. Plaats de geënte schotel in een tri-gas CO₂ incubator (37 ° C, 6,5% O₂, 5% CO₂).
   9. Verandering medium (mTeSR1 zonder Y27632) elke dag.

2. productie van hPGCLCs

Opmerking: Starten de volgende stappen uit wanneer hiPSC cellen in een 10 cm schotel (mTeSR1 medium, extracellulaire matrix eiwitten-bedekt) reikt tot ~ 80% confluentie (ongeveer 10⁷ cellen).

1. Voorbereiding van de extracellulaire matrix eiwitten-bedekt gerechten (dag 1)
   1. Ontdooi een aliquoot gedeelte van het extracellulaire matrix eiwitten op ijs en Verdun in 25 mL ijskoud DMEM/F12.
   2. Afzien van verdunde extracellulaire matrix eiwitten aan 6-Wells-platen (1 mL/putje). Één aliquot is voldoende om de jas 24 wells (4 platen). Incubeer de platen bij kamertemperatuur gedurende ten minste 1 uur. Ongebruikte gecoate platen kunnen worden verzegeld en opgeslagen bij kamertemperatuur gedurende maximaal één week.
   3. Medium uit platen onmiddellijk vóór inoculatie van primer pluripotent hiPSCs gecombineerd. Het is niet nodig om de gecoate afwas met medium of PBS(-).
2. Inoculatie van primer pluripotent hiPSCs in extracellulaire matrix eiwitten beklede platen (dag 1)
   1. Neem 4 mL van cel dissociatie enzym in een centrifugebuis van 15 mL en equilibreer tot kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
   2. Prewarm 10 mL PBS(-) in een centrifuge 15 mL tube voor > 5 minuten bij 37 ° C in een waterbad.
   3. Voeg 7 µL van 50 mM Y27632 (ROCK-remmer) op 35 mL mTeSR1 gemiddeld in een centrifugebuis van 50 mL. Gebruik medium Y27632-aangevuld in dezelfde dag. Maak twee buizen voor totale 70 mL medium Y27632-aangevuld en prewarm van het medium in een waterbad 37 ° C gedurende 15 minuten.
   4. Oud medium uit een 10-cm schotel en spoel de cellen eenmaal met voorverwarmde 10 mL PBS(-) gecombineerd. PBS(-) negeren en voeg 4 mL cel dissociatie enzym tot de schotel. Zet de schotel in een CO₂ incubator (couveuse tri-gas werkt, maar niet noodzakelijk) voor ~ 4 min tot cellen los van de bodem. Zachtjes Pipetteer cellen op en neer om eencellige schorsing.
   5. Spoel hiPSC eencellige suspensie op de prewarmed buis met 10 mL Y27632-aangevuld medium. Centrifuge celsuspensie bij kamertemperatuur, 300 x g gedurende 8 minuten.
   6. Verwijder supernatant en resuspendeer de pellet van de cel met 10 mL voorverwarmde Y27632-aangevuld medium.
   7. Filtreer celsuspensie door een zeef (40 µm poriegrootte) van de cel verwijderen cel aggregaten en cellen met behulp van een teller Coulter tellen.
   8. Verdun hiPSC één celsuspensie naar 5.0 x 10⁶ cellen in 50 mL voorverwarmde Y27632-aangevuld medium.
   9. Inoculeer 2 mL celsuspensie (2.0 x 10⁵ cellen) in elk putje van de gecoate 6-Wells-platen (4 platen, 24 wells). Zorg ervoor dat de cellen in elk putje gelijkmatig zijn verdeeld. Cel cultuur platen in een tri-gas CO₂ incubator (37 ° C, 6,5% O₂, 5% CO₂) plaatsen.
      Opmerking: Het entmateriaal celdichtheid en gelijkmatige verdeling in elk goed is cruciaal. Omdat inoculatie van hiPSCs tot 10-cm gerechten leiden aanzienlijk hogere celdichtheid dan andere gebieden tot kan. Zelfs de celdichtheid van eencellige hiPSCs kan gemakkelijker worden bereikt met de 6-Wells-platen.
   10. Medium met 2 mL/putje mTeSR1 (zonder Y27632) op de 24 uren na inoculatie wijzigen.
3. Conversie van de primer pluripotent staat hiPSCs naar de 4i-naïef (ERK-onafhankelijk) pluripotente cellen (dag 3 en dag 4)
   1. 4i volledige naïef pluripotent medium in een 50 mL centrifugebuis als volgt (dag 3 en dag 4) bereiden: 4i Basaal medium 50 mL, 5 µL van 30 mM CHIR99021, 5 µL van 10 mM PD0325901, 5 µL van 20 mM BIRB796, 5 µL van 50 mM SP600125 , en 5 µL van 50 mM Y27632.
      Opmerking: Bewaar 4i Basaal medium bij-80 ° C en dooi 's nachts in een koelkast. Bereiden van verse 4i compleet medium onmiddellijk vóór gebruik. Vermijd blootstelling van de 4i chemicaliën (CHIR, PD BIRB en SP) aan fel licht. Bewaar niet 4i volledige middellange bij 4 ° C of bevroren 's nachts of langer.
   2. Warme 50 mL 4i compleet medium in een batch 37 ° C water voor 15 min. wijziging medium met voorverwarmde 4i compleet medium (2 mL/putje) 48 en 72 uur na inoculatie. Exacte timing van middellange verandering is belangrijk om de opbrengst van de hoge hPGCLC en experimentele reproduceerbaarheid.
      Opmerking: Dichtheid van de cultuur van de hiPSC 4i is hoog onder deze voorwaarde en worden confluente 48-72 uur na inoculatie, maar dit is normaal.
4. EB vorming met behulp van microwell platen (dag 5)
   1. Bereiden van 50 mL 4i volledige voedingsbodem in een centrifugebuis van 50 mL en het prewarm in een waterbad 37 ° C gedurende ~ 15 minuten vóór gebruik.
   2. Prewarm 35 mL DMEM/F12 in een centrifugebuis van 50 mL in een waterbad 37 ° C gedurende ~ 15 minuten vóór gebruik.
   3. Voorbereiden van een microwell plaat
      1. Toevoegen van 5% (m/v) filter-gesteriliseerde Pluronic F-127 wasmiddel in 8 actieve putjes van de plaat van een microwell (Zie Tabel of Materials; 0,5 mL per putje).
      2. Centrifugeer de microwell plaat bij kamertemperatuur, 1.000 x g, voor 5 min. inspecteren microwells met een omgekeerde Microscoop om ervoor te zorgen het ontbreken van luchtbellen. Laat de plaat van de microwell gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur jas microwells met wasmiddel.
      3. Negeren van schoonmaakmiddel van putjes van de plaat microwell door pipetteren en spoel putjes met voorverwarmde DMEM/F12 (2 mL/putje).
      4. Centrifugeer de microwell plaat bij kamertemperatuur, 1.000 x g voor 5 min. inspecteren microwells met een omgekeerde Microscoop om ervoor te zorgen het ontbreken van luchtbellen.
         Opmerking: Wanneer luchtbellen nog steeds in microwells waargenomen worden, onderzoeken als het blad van de microwell nog steeds stevig op de bodem van de put is gelijmd.
      5. DMEM/F12 van putjes van de plaat microwell door pipetteren en spoel wells met voorverwarmde DMEM/F12 negeren (2 mL/putje).
      6. Herhaal stap 2.4.3.3 - 2.4.3.4.
      7. Voeg 4i compleet medium in de gespoeld putjes van de plaat van de microwell (1 mL/putje). Dient u de resterende 4i compleet medium in een waterbad 37 ° C.
      8. Centrifugeer de microwell plaat bij kamertemperatuur, 1.000 x g voor 5 min. inspecteren microwells met een omgekeerde Microscoop om ervoor te zorgen het ontbreken van luchtbellen.
      9. Plaats de plaat van de microwell in een tri-gas incubator (37 ° C, 6,5% O₂, 5% CO₂) tot inoculatie van 4i hiPSCs.
   4. Inoculatie van 4i iPSCs in een microwell plaat
      1. Neem 13 mL van cel dissociatie enzym in een centrifugebuis van 15 mL en equilibreer tot kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
      2. Prewarm 50 mL PBS(-) in een 50 mL-centrifuge buis voor > 5 minuten bij 37 ° C in een waterbad.
      3. Gecombineerd oud medium uit 24 putten van naïeve hiPSC cel cultuur en spoel cellen eenmaal met voorverwarmde 2 mL/goed PBS(-). Verwijderen van PBS(-) en toevoegen van 0,5 mL/putje dissociatie enzym. Plaats cel cultuur platen in een CO₂ incubator (37 ° C) voor ~ 4 min tot cellen los van de bodem. Zachtjes Pipetteer cellen op en neer om eencellige schorsing.
      4. Spoel hiPSC eencellige suspensie op voorverwarmde 20 mL 4i volledig normaal. Centrifuge celsuspensie bij kamertemperatuur, 300 x g gedurende 8 minuten.
      5. Verwijder supernatant en resuspendeer cel pellet met 5 mL voorverwarmde 4i compleet medium.
      6. Filtreer celsuspensie door een zeef (40 µm poriegrootte) van de cel te verwijderen cel aggregaten. Wassen cel zeef 3 keer met 1 mL voorverwarmde 4i compleet medium. Cellen tellen met behulp van een Coulter counter.
      7. Verdun één celsuspensie van 4i naïeve hiPSCs aan 27,0-32,4 x 10⁶ cellen in 9 mL voorverwarmde 4i compleet medium. Merk op dat 4i compleet medium bevat al Y27632.
      8. Neem de microwell plaat met 1 mL van de volledige medium 4i in 8 goed van een tri-gas incubator (2.4.3.9). Inoculeer 1 mL 4i naïeve hiPSC schorsing (3.0-3.6 x 10⁶ cellen/well) in elk putje. De celdichtheid van deze is van cruciaal belang. Zorg ervoor dat cellen gelijkmatig verdeeld zijn in elk putje door zachtjes pipetteren.
      9. Centrifugeer de microwell plaat bij kamertemperatuur, 100 x g gedurende 3 minuten.
      10. Plaats de plaat van de microwell in een tri-gas CO₂ incubator (37 ° C, 6,5% O₂, 5% CO₂). Niet storen cellen Ingehuld in microwells. Incubeer de cellen gedurende 24-30 uren. Een overnachting (~ 16 uur)-incubatie is meestal onvoldoende is voor de vorming van tight EBs.
5. Overdracht van EBs aan lage bijlage platen voor het schommelen van de cultuur (dag 6)
   1. HPGCLC volledige medium in een centrifugebuis 50 mL bereiden als volgt (dag 6 - dag 13):
      20 mL hPGCLC Basaal medium, 4 μL van 500 mM 2-Mercaptoethanol, 50 μl van 20 mg/mL L-ascorbinezuur, 4 μL van 50 mM Y27632, 50 μl van 100 μg/mL recombinante menselijke BMP4, 4 μL van 500 μg/mL menselijke SCF, 4 μL van 250 μg/mL menselijke EFG , en 8 μL van 250 μg/mL menselijke LIF.
      Opmerking: Bereiden van verse hPGCLC compleet medium onmiddellijk vóór gebruik en Vermijd blootstelling aan licht. Bewaar niet hPGCLC volledige middellange bij 4 ° C of bevroren 's nachts of langer.
      Opmerking: De concentratie van BMP4 is zeer hoog. De optimale concentratie van BMP4 kan verschillen tussen partijen BMP4. De veel-op-veel verschil van BMP4 zijn sterk van invloed op productie van hPGCLC. Bij gebrek aan BMP4 in het medium van de volledige hPGCLC is opbrengst van hPGCLCs zeer lage⁶. Het belang van andere cytokine in het medium van de volledige hPGCLC werd beschreven door Hanna/Surani⁶.
      Opmerking: In dit protocol is de uiteindelijke concentratie van menselijke LIF in het volledige hPGCLC medium 100 ng/mL^6,10. De eindconcentratie van LIF gebruikt in eerder gepubliceerde studies, met inbegrip van ons, was 1 μg/mL. Wanneer de specifieke activiteit van menselijke LIF reagens is > 10.000 eenheden/μg (ED₅₀ < 0.1 ng/mL), 100 ng/mL LIF is voldoende om de hPGCLC generatie van EBs te ondersteunen.
   2. Overdracht van EBs
      1. Prewarm 5 mL hPGCLC Basaal medium en 20 mL hPGCLC compleet medium voor > 5 minuten bij 37 ° C in een waterbad.
      2. Zorgvuldig plaatst een cel zeef ondersteboven bovenop een polypropyleen conische tube van 50 mL.
      3. Pipetteer elk putje van de microwell plaat zeer voorzichtig plaat losmaken van EBs van microwells. Alle inhoud van elk putje wordt gefiltreerd door de zeef van de cel voor het verwijderen van cellen niet opgenomen in de EBs.
      4. Wassen EBs behouden op de zeef van de cel met 1 mL van voorverwarmde hPGCLC Basaal medium. Voorzichtig wassen 5 malen herhalen.
      5. Gewassen EBs worden nu bewaard op het membraan van een zeef, die op een conische buis van 50 mL-ondersteboven. Plaats een verse 50 mL conische buis op de zeef van de cel, zodat de cel zeef zich normaal gesproken in de nieuwe buis bevindt. Vervolgens snel omkeren de zeef van de cel met de nieuwe buis. De cel zeef en de buis zijn nu in de normale posities, en EBs zijn onder het membraan van de cel zeef.
      6. Het verzamelen van EBs in de conische buis door het toevoegen van 18 mL voorverwarmde hPGCLC compleet medium above het membraan van cel zeef. Medium zal dus gaan door het membraan en verzamelen van EBs gekoppeld aan de lagere kant van het membraan neer aan de bodem van de centrifugebuis.
      7. De opschorting van de plaat van EBs in putjes van een lage-bijlage 6-well plaat (3 mL/putje).
      8. Plaats de plaat van de lage-gehechtheid op een wip-move rocker in een tri-gas incubator (37 ° C, 6,5% O₂, 5% CO₂). De snelheid van de rockende instellen op ~ 20 omwentelingen per min.
         Opmerking: Niet van toepassing wervelende beweging omdat EBs aggregaat in het centrum van putten en zekering. Zorgvuldig rockende snelheid zodanig aanpassen dat EBs doen niet samenvoegen. Te krachtige schommelen beschadigt fysiek EBs.
         Opmerking: Lage zuurstof druk wordt sterk aanbevolen voor EB cultuur.
6. Generatie van hPGCLCs op het oppervlak van EBs (dag 7 - dag 13)
7. Vers bereiden 20 mL hPGCLC compleet medium elke dag. Zonder schommelen, EBs zullen zinken op de bodem van putten in ~ 1 min. verwijderen oude medium zonder drogen EBs (~0.2 mL/putje oud medium kan blijven) en voeg verse hPGCLC compleet medium dagelijks (3 mL/putje).

3. immunohistochemische kleuring van EBs (dag 10-dag 13)

1. EBs te Embedding in extracellulaire matrix eiwitten blokken voor immunokleuring van formaldehyde-vaste, paraffine-ingebedde (FFPE)
   1. Identificeren van hPGCLCs als OCT4⁺ cellen, oogst EBs in een tube van de lage-bind microcentrifuge 1,5 mL. Laat EBs zinken naar de bodem of kort centrifugeren (2 seconden) bij kamertemperatuur en negeren van medium. Spoel de EBs met ijskoude PBS(-).
   2. Verwijderen van PBS(-) en EBs in 1 mL ijskoud 1%(w/v) natriumazide in PBS(-) voor 5 min op ijs uit te broeden. Laat EBs zinken naar de bodem of kort centrifugeren (2 seconden) bij kamertemperatuur. Vloeistof wordt weggeworpen en spoel EBs met ijskoude PBS(-).
      Opmerking: Toevoeging van natriumazide vertraagt afbraak van intracellulaire eiwitten en RNA transcripties.
   3. Ontdooi 200 µL van extracellulaire matrix eiwitten op ijs en voeg aan de microcentrifuge buis met EBs. Laat de buis bij kamertemperatuur gedurende ~ 10 minuten totdat de gel is gestold.
   4. Voeg 1 mL 4% formaldehyde in PBS(-) en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten met zachte rockende.
      Opmerking: Beide EBs en extracellulaire matrix eiwitten worden opgelost tijdens deze stap. Zonder fixatie, kunnen de gel blokken ontleden tijdens het proces van uitdroging. Als vooraf vaste EBs zijn ingesloten in de gel blok, EBs worden opnieuw bevestigd met de gel blok en kan te veel vast.
   5. Negeren van formaldehyde, en spoel EBs eenmaal met ijskoude PBS(-). Voeg vervolgens 1 mL van 70% ethanol. Gel-embedded EBs kan worden opgeslagen in 70% ethanol bij 4 ° C gedurende één week.
   6. De gel-embedded EBs met een standaardprotocol van FFPE te verwerken. Bereiden 5-μm dikte FFPE dia's. Laat dia's 's nachts droog en bewaar ze bij kamertemperatuur tot immunokleuring.
      Opmerking: Onze routine FFPE-protocol is als volgt: 70% ethanol, twee wijzigingen, 1 uur elke; 80% ethanol, een verandering, 1 uur; 95% ethanol, een verandering, 1 uur; 100% ethanol, drie wijzigingen, 1,5 uur elk; xyleen, drie wijzigingen, 1,5 uur elk; paraffine (58-60 ° C), twee wijzigingen, elke 2 uur. De gedehydrateerde weefsels zijn ingebed in de paraffineblokken en gesneden op 3-10 μm (meestal 5 μm).
   7. Voor vlekken, volledig droog van dia's in de oven 56 ° C gedurende ten minste 30 minuten Deparaffinize en hydrateren van dia's met xylenen en gesorteerde alcohol serie. Daarna wassen dia's in leidingwater voor 5 min.
   8. Om de inactivering van endogene Peroxidasen, incubeer gerehydrateerd dia's met BLOXALL blokkeren oplossing bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Daarna wassen dia's met PBS voor 5 min.
   9. Blok dia's met normaal paard Serum (of normale sera van andere soorten gegenereerd secundaire antilichamen) bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten.
   10. Incubeer dia's met een anti-OCT-3/4 geit primair antilichaam verdund met 0,1% BSA in PBS(-) bij 4 ° C's nachts (optimaliseren verdunnings- en incubatie voorwaarden voor elke primair antilichaam). Daarna wassen dia's met PBS(-) driemaal op kamertemperatuur, iedere 5 min.
   11. Incubeer dia's met de anti-geit IgG (horseradish peroxidase-geconjugeerd secundair antilichaam gegenereerd door paard; Zie Tabel van materialen) bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Daarna wassen dia's met PBS(-) driemaal op kamertemperatuur, iedere 5 min.
   12. Meng noodzakelijk bedragen de DAB kleuring van substraten (Zie Tabel van materialen) onmiddellijk vóór gebruik en incubeer dia's in de volledige DAB kleurstofoplossing bij kamertemperatuur voor 5 min. Monitor schar kleuring met behulp van een omgekeerde Microscoop en stop de reactie Wanneer OCT4⁺ cellen worden gevisualiseerd door dia's snel te spoelen in stromend leidingwater.
   13. Uitdrogen van de dia's met gesorteerde alcohol en xylenen serie. De dia's zijn klaar voor laser-vangst microdissection. Bereiden van permanente FFPE dia's met behulp van montage medium (Zie Tabel of Materials) voor hoge resolutie microscopische waarnemingen.

4. FACS verrijking van hPGCLCs van EBs (dag 10-dag 13)

1. Voorbereiding van enzym mix van Embryoid Body dissociatie Kit
   1. Voorbereiden enzym Mix 1 door toevoeging van 50 µL enzym P 1.900 µL van Buffer X en vortex. Prewarm enzym Mix 1 in een waterbad 37 ° C gedurende 15 minuten.
   2. Bereiden enzym Mix 2 door 10 µL enzym A aan 20 µL Buffer Y toe te voegen.
   3. Mix enzym mixen 1 en 2 te bereiden van Complete EB dissociatie enzym Mix.
2. Distantiëren van EBs
   1. Oogst EBs van lage bijlage platen en centrifugeer bij kamertemperatuur in een centrifugebuis van 15 mL, 300 x g gedurende 2 min. Verwijder supernatant en resuspendeer EBs met 10 mL PBS(-). Centrifuge opnieuw.
   2. Verwijder supernatant en resuspendeer EBs met volledige EB dissociatie-enzym Mix (4.1.3). Incubeer EB suspensie in een waterbad 37 ° C gedurende 15-20 minuten totdat EBs worden losgekoppeld. Tijdens de incubatie, zachtjes Pipetteer EBs op elke 3-5 min om dissociatie. Gebruik als alternatief een geautomatiseerde dissociator met Embryoid Body dissociatie programma.
   3. Ijskoude 8 mL PBS(-) aan gedissocieerde EB celsuspensie toevoegen. Filtreer de celsuspensie door een 40-µm cel zeef. Wassen cel zeef met 1 mL ijskoud PBS(-) drie keer.
   4. Cellen tellen in gefilterde celsuspensie, met behulp van een Coulter counter.
   5. Centrifugeer celsuspensie op bij 4 ° C, 300 x g gedurende 8 minuten en weggeworpen. Resuspendeer de pellet cel met ijskoude 10 mL PBS(-).
   6. Verdeel celsuspensie in twee buizen, één voor neen-kleuring controle (~ 10⁵ cellen) en de andere voor anti-CD38 (alle resterende cellen) kleuring.
   7. Centrifugeer de twee buizen bij 4 ° C, 300 x g gedurende 8 minuten.
3. Anti-CD38 kleuring en FACS verrijking van hPGCLCs
   1. Resuspendeer de pellet van de cel voor neen-kleuring controle met 200 µL ijskoude 3% (m/v) BSA en natriumazide 1% (m/v) in PBS(-). Plaats op het ijs tot stroom cytometry.
      Opmerking: Toevoeging van natriumazide vertraagt internalisering van CD38 van celoppervlak.
   2. Resuspendeer de pellet cel voor anti-CD38 kleuring met ijskoude 3% (m/v) BSA en 1% (m/v)-natriumazide in PBS(-) naar 1 x 10⁶ cellen per 100 µL.
   3. Voeg 10 µL per 1 x 10⁶ cellen van een FACS-rang, anti-CD38 APC-geconjugeerd antilichaam. Betrekking hebben op de buis met aluminiumfolie om te voorkomen dat blootstelling aan licht. Incubeer bij 4 ° C voor 45 min met zachte rockende.
   4. Voeg 5 mL ijskoud PBS(-) en centrifuge bij 4 ° C, 300 x g voor 8 min. Discard supernatant en resuspendeer cel met 5 mL pellet ijskoude PBS(-). Wassen met PBS(-) in totaal driemaal herhalen.
   5. Resuspendeer cel pellet met 500 μL ijskoude 3% (m/v) BSA en 1% (m/v) natriumazide in PBS(-) om een voldoende voor FACS celdichtheid.
   6. Verrijken van hPGCLCs als CD38⁺ cellen, die meestal duidelijk te onderscheiden-celpopulatie vormen. Gebruik van de neen-kleuring controle om identificatie van CD38⁺ cellen. Typische rendement van hPGCLCs zijn 1-5% van alle afzonderlijke cellen FACS-onderzocht op dag 10 EBs en 20-40% op dag 13 EBs.

Representative Results

De plaat van de microwell die hier gebruikt is in de notatie 24-well en heeft 8 putten houden de microwell bladen, elk waarvan vorming van maximaal 1.200 ondersteunt EBs. Van ongeveer 24 miljoen 4i naïef pluripotent cellen, genereert deze microwell plaat meestal ~ 8000 EBs bestaande uit ~ 3.000 cellen per EB. Tijdens niet-aanhanger cultuur van EBs met constante rockende, het aantal intact EBs geleidelijk afneemt als gevolg van spontane zelf ontmanteling en ~ 3.000 EBs overleven tot dag 13 van het protocol. De meeste van deze EBs te overleven hebben 50-200 hPGCLCs op hun oppervlakte (geschat door immunohistochemische detectie van OCT4 + cellen in seriële secties van EBs; Zie Figuur 8), opbrengst van 100.000 ~ OCT4 + hPGCLCs in totaal. Enzymatische vertering van EBs in afzonderlijke cellen is een relatief inefficiënt proces, vermindering van de opbrengst van FACS verrijkte CD38 + hPGCLCs tot 9.000-47,000 cellen. In onze handen was een gemiddelde van zes onafhankelijke, maar opeenvolgende batches van experimenten 14,038 ± 5,731 (bedoel ± SEM). Omdat CD38-negatieve EB cellen cellen express OCT4 mRNA (qPCR) of eiwit (immunohistochemie) slechts zeer zwak, zo niet helemaal afwezig, alle EB cellen sterk uiting van OCT4 eiwit zijn vrijwel gelijk aan de gehele bevolking van de CD38 + hPGCLCs.

De kritische parameter van dit protocol bestaat uit celdichtheid. Wanneer 2.0 x 10⁵ menselijke iPSCs zijn geënt in een extracellulaire matrix eiwitten-bedekt goed van 6-well cel cultuur plaat (9.60 cm² groeigebied per putje) met 2 mL Y27632-aangevuld medium (2.2.9), cellen zal bereiken tot ongeveer 20-30% op 24 confluency uren na inoculatie (Figuur 1). Na een aanvullende 24-uurs cultuur in het medium van de mTeSR1 in de afwezigheid van Y7632, cellen statistische en formulier kolonies, bezetten ~ 30% van de oppervlakte van de groei (Figuur 2). Cellen worden vervolgens gekweekt in het 4i herprogrammering medium (2.3.2). Na 24 uur van de cultuur in de 4i middellange, cellen worden heuvels (Figuur 3). Een aanvullende 24-uurs cultuur in het medium 4i maakt cellen dichtbevolkte verpakt (Figuur 4). Het exacte tijdstip van middellange verandering (elke 24 uur +/-4 uur) en cel dichtheid zijn van cruciaal belang voor succesvolle vorming van EBs en hPGCLCs.

Na 48 uur cultuur in het medium 4i, zijn cellen losgekoppeld en geënt op de microwell plaat, die wells 400 µm in grootte (2.4 heeft). Hoewel deze verkrijgbare microwell plaat is gecoat voor wordt lage wrijvingscoëfficiënt door de fabrikant, verse opnieuw coating met wasmiddel (2.4.3) aangeraden om het risico van ongewenste cel adhesie. 800 µm microwells resulteerde in een lagere opbrengst van hPGCLCs, hetgeen wijst op het belang van EB grootte voor goed gerichte differentiatie. Cellen geënt op de middellange 4i zal EBs vormen in microwells op 24-30 uur, die kan worden waargenomen met behulp van een standaard, omgekeerde fasecontrastmicroscoop (Figuur 5). De ronde contouren van EBs worden duidelijk zichtbaar bij en na 24 uur incubatie. EBs oogsten in een eerder stadium (bijvoorbeeld 16 uren na inoculatie) voordat hun circulaire contour duidelijk zichtbaar is wordt niet aanbevolen omdat dergelijke EBs zijn zeer kwetsbaar voor mechanistische schade en gemakkelijk ontmantelen. Merk op dat er grote hoeveelheden naïeve hiPSCs niet zijn opgenomen in EBs, dat is normaal. Deze designated cellen zal vóór de inleiding van het schommelen van de cultuur van EBs op lage-aanhanger oppervlak (2.5.2) weggewassen worden. Merk ook op dat, in ons protocol, EBs worden gevormd in het 4i naïef pluripotent medium - niet in het hPGCLC medium. Pre vorming van solide EBs in het medium 4i vóór de blootstelling aan het hPGCLC medium is belangrijk voor de verdeling van de hPGCLCs op het oppervlak van EBs.

EBs gehandhaafd in het medium van de hPGCLC onder een schommelen, niet-aanhanger cultuur voorwaarde blijft hun bolvorm zonder aggregatie of fusion (Figuur 6 en Figuur 7). Te zwakke schommelen voorwaarde zal veroorzaken EB aggregatie en fusion, maar ook harde voorwaarde zal EBs ontmantelen. Menselijke PGCLCs ontstaan als uiting van OCT4 cellen op het oppervlak van EBs na zo spoedig de 5-daagse cultuur in het hPGCLC medium, en hun aantal toeneemt tot de 8-daagse cultuur (Figuur 8). Verdere incubatie van EBs kan leiden tot ontmanteling van EBs en verlies van hPGCLCs. Menselijke PGCLCs kunnen worden verrijkt uit enzymatisch gedissocieerde EB cellen na 5-8 dagen van de cultuur in het hPGCLC medium door FACS als CD38 + cellen (Figuur 9).

Figuur 1: de cultuur van de cel van menselijke iPSC in Y27632-aangevuld medium 24 uren na inoculatie. Celdichtheid is ongeveer 20-30% confluent. In aanwezigheid van de ROCK-remmer Y27632, cellen de neiging te verspreiden goed met lange, spike-achtige rek. Schaal bar = 100 μm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 2: menselijke iPSC celkweek 48 uren na inoculatie. Cellen samenvoegen toe aan het formulier kolonies, ~ 30 procent van de groeigebied bezet houdt. Schaal bar = 100 μm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 3: menselijke iPSC celcultuur in het 4i herprogrammering medium gedurende 24 uur geïncubeerd. Cellen bereiken confluentie. Schaal bar = 100 μm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 4: menselijke iPSC celcultuur in het 4i herprogrammering medium gedurende 48 uur geïncubeerd. Confluente cellen worden dichtbevolkte verpakt. Schaal bar = 100 μm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 5: menselijke iPSC EBs gevormd in microwells na een incubatieperiode van de 24 uur per dag in de 4i herprogrammering middellange. De ronde contouren van EBs op 24-30 uren na inoculatie zichtbaar worden. Wanneer de contour wordt bevestigd onder een fasecontrastmicroscoop, EBs zijn klaar voor overdracht aan een rockende cultuur voorwaarde. Schaal bar = 500 μm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 6: menselijke iPSC EBs gedurende 24 uur in het hPGCLC medium geïncubeerd. EBs grotendeels behouden hun bolvorm. Schaal bar = 500 μm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 7: menselijke iPSC EBs ge¨ uncubeerd 192 uren in het medium hPGCLC. EBs worden vergroot ten opzichte van hun verschijning op de 24-uurs cultuur, maar ze houden nog steeds grotendeels bolvormige vormen met geen samenvoeging of fusion. Schaal bar = 500 μm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 8: menselijke PGCLCs uiten van OCT4 zijn gelokaliseerd op het oppervlak van EBs ge¨ uncubeerd 192 uren in het hPGCLC medium hiPSC. EBs waren ingesloten in extracellulaire matrix eiwitten en verwerkt voor FFPE dia immunohistochemische kleuring van OCT4 (DAB substraat). Schaal bar = 1 mm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 9: Menselijke PGCLCs zijn verrijkt uit enzymatisch gedissocieerde EB cellen door FACS als CD38⁺ cellen. Na incubatie in het hPGCLC medium gedurende 5-8 dagen, kan EBs worden losgekoppeld door enzymatische spijsvertering te bereiden enkele celsuspensie. hPGCLCs kan worden verrijkt als CD38⁺ cellen door FACS (rode stippen). EB-cellen die niet CD38 uitdrukken doen (blauwe stippen) moeten ook worden verzameld als negatieve controle. FACS poorten van CD38-positieve en negatieve-CD38 cellen moeten worden gescheiden met een ruime marge (groene stippen) om te voorkomen dat besmetting van elke soort cellen. De bovenste en onderste panelen Toon FACS profielen zonder of met anti-CD38 antilichaam kleuring, respectievelijk. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Discussion

Robuuste productie van hPGCLCs met behulp van het protocol beschreven hier werd bevestigd met drie onafhankelijke klonen van menselijke iPSCs met de normale diploïde karyotype¹⁰. Deze iPSC-klonen waren afgeleid van de dezelfde menselijke neonatale dermale huid fibroblast cel cultuur¹⁰. Zij zal worden verstrekt door de auteurs van dit artikel aan onderzoekers op verzoek en onder de juiste materialen overdracht akkoord en verzending van de regeling van bevroren levende menselijke cellen. Het is momenteel onbekend weten of normale karyotype vereist is voor robuuste hPGCLC productie via onze protocol of die gemeld door andere laboratoria.

Recente studies hebben aangetoond dat de productie van hPGCLCs van hiPSCs¹¹ of SER's¹⁴ met behulp van een protocol beschreven door Saitou de groep van Kyoto University⁸ afhankelijk van de expressie van EOMESODERMIN is, vereist een T-box transcriptiefactor voor inductie van SOX17. SOX17 lijkt te functioneren als de master bloedlijn transcriptiefactor bij germline differentiatie van menselijke pluripotente stamcellen⁶bepalen. EOMESODERMIN is gecodeerd door de EOMES gen, CRISPR/Cas9 knockout van EOMES veroorzaakt bijna totale afwezigheid van SOX17 inductie in de productie van voorwaarde¹¹hPGCLC en expressie van andere genen gevolgd hetzelfde patroon van de SOX17-null knock-out cellen. Overexpressie van EOMESODERMIN uit een afleidbare vector in de EOMES-null knock-out cellen tijdens hPGCLC inductie cultuur gered efficiënt de robuuste hPGCLC productie, alsmede de inductie van germline genen, met inbegrip van SOX17. Daarentegen geïnduceerde overexpressie SOX17 ook de robuuste PGCLC productie gered maar zonder EOMES. EOMESODERMIN is een kritische upstream inductor van SOX17 dus, en dit schijnt de enkele belangrijkste rol van EOMESODERMIN in hPGCLC-inductie van menselijke pluripotente stamcellen. Ons protocol induceert SOX17 in hiPSCs-¹⁰, maar haar afhankelijkheid van EOMESODERMINE inductie wacht op nader te bepalen.

Dit protocol converteert menselijke iPSCs primer-pluripotent gehandhaafd op de middellange mTeSR1 tot ERK-onafhankelijke naïef pluripotent voor 96 uur in de 4i herprogrammering middellange⁶, dat is een gemodificeerde naïef menselijke stamcellen medium (NHSM)⁵. Onze pogingen om het genereren van hPGCLCs beginnen met de dezelfde menselijke iPSC klonen, maar onderhouden in andere commercieel beschikbare menselijke iPSC groei media voordat cultuur in de 4i herprogrammering medium in verschillende gradaties van lagere rendementen van de hPGCLC resulteerde. Hoewel langerlopende aanpassing in andere media hPGCLC productie verbetert of niet blijft vastgesteld in toekomstige studies, deze constatering suggereert dat de exacte status van de primer pluripotent van menselijke iPSCs voordat de 4i herprogrammering aanzienlijk invloed EB vorming in het medium 4i en EB differentiatie in hPGCLC medium.

Productie van hPGCLCs van hiPSCs na ons protocol is robuust en zeer reproduceerbaar is, deels als gevolg van het gebruik van de microwell platen waarmee de efficiënte productie van een groot aantal EBs (~ 8000 EBs per batch) met een uniforme grootte (3000 hiPSCs per EB). Het aantal EBs gemakkelijk geproduceerd in één enkele batch van experiment met behulp van onze protocol mogelijk veel groter is dan de methoden met behulp van de gewone U-onderste cel cultuur putten. Productie van een groot aantal even formaat EBs uniform bezaaid met hPGCLCs kan bieden unieke mogelijkheden voor high-throughput chemical screenings om kleine-moleculair-gewicht activators of remmers PGC specificatie beïnvloeden te identificeren of hun biologische kenmerken zoals epigenetische herprogrammering. Dergelijke EBs kan ook nuttig zijn voor toxicologische beoordeling van grote aantallen germline cel toxische stoffen, met inbegrip van niet alleen milieuverontreinigende stoffen maar ook klinisch voorgeschreven medicatie zoals chemotherapeutische agenten.

De kritische factoren van de robuuste en reproduceerbare productie van hPGCLCs met het gepresenteerde protocol omvatten (i) het gebruik van gezonde hiPSCs in mTeSR1 op eiwit van de extracellulaire matrix, (ii) om te enten exacte aantal cellen zoals beschreven en strikt gehandhaafd Volg de tijdsinstellingen van middellange verandering en subcultuur, (iii) om te selecteren goed alot van menselijke recombinante BMP4, en (iv) tot een minimum beperken van fysieke schade van EBs tijdens de rockende cultuur. Het is onze ervaring dat de beste partij van BMP4 reagens bij 100 ng/mL concentratie, gewerkt terwijl andere veel BMP4 reagentia 2 X of meer doses vereist. Aan de andere kant, de opbrengst van de hPGCLCs productie met behulp van de beste partij van BMP4 eerder bij hogere doseringen van de BMP4 daalde (bijvoorbeeld 200 ng/mL). Het is raadzaam om te testen verschillende percelen van recombinante menselijke BMP4 reagentia verkregen van meerdere leveranciers voor hun prestaties in de ondersteuning van hPGCLC generatie en teneinde een grote hoeveelheid van de beste partij.

Een uniek kenmerk van ons hPGCLC-protocol is dat hPGCLCs zijn gelokaliseerd op de buitenste oppervlakte laag van EBs¹⁰ (Figuur 8), terwijl andere protocollen hPGCLCs in het midden van de cel aggregaten^{6,8 genereren kunnen}. Embryoid organen de neiging om meerdere verschillende lagen zoals oppervlak, buitenste schil, binnentent en kern vormen, en de centrale kern regio's zijn vaak necrotische vanwege het beperkte aanbod van voedingsstoffen, zuurstof, evenals pro-overlevende groeifactoren bedoelde formulier de cultuur medium door diffusie²⁰. Lokalisatie van hPGCLCs op het oppervlak van EBs zonder mogelijke beperkingen als gevolg van de beperkte diffusie naar het centrum van EBs kan gunstig zijn voor directe, tijd - en dosis-gecontroleerde blootstelling van hPGCLCs aan drugs of giftige stoffen voor farmacologische of toxicologisch onderzoek.

Overwegende dat de muis PGCLCs Toon robuuste genoom-brede DNA demethylatie waarbij de inprenting regio's ten minste deels controle lijkt^7,19,20, de mate van wereldwijde gDNA demethylatie in hPGCLCs zwakker dan muis PGCLCS of PGCs^6,7. Transcriptomal profielen suggereren dat hPGCLCs kan lijken op een eerder stadium van de embryonale PGCs dan muis PGCLCs¹⁰. Er werd gemeld dat langdurige cultuur van EBs onder de voorwaarde van hPGCLC productie een verhoogde mate van gDNA demethylatie^{7 veroorzaakt}; of een langere periode van cultuur van de hPGCLCs in EBs of als geïsoleerde cellen meer gevorderde stadia van germline differentiatie kan bereiken moeten echter worden bepaald door toekomstige studies.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Primed pluripotency hiPSC culture
Matrigel	Corning	354277	Aliquot Matrigel at the volume indicated by the manufacturer (about 200 μL). Use cold tubes. Store at -80 °C
DMEM/F-12	Thermo Fisher Scientific	21041-025	Store at 4 °C.
mTeSR1	STEMCELL Technologies	85850	Reconstitute by adding 5X Supplement to Basal Medium. The reconstituted medium can be stored at 4 °C for up to 4 weeks without affecting cell culture performance.
Y27632	Axon	1683	Dilute 5 mg Y27632 (MW 320.26) with 312.2 μL water to prepare 50 mM Y27632 stock solution. Sterilize by filtration (0.22 μm). Aliquot 20 μL/tube x 15 tubes and store at -20 °C.
CryoStor CS10	STEMCELL Technologies	07930	Store at 4 °C.
Accutase	Innovative cell technologies	AT104-500	Cell dissociation enzyme; aliquot 40 mL/tube x 12 tubes and store at -20 °C.
Name	Company	Catalog Number	Comments
4i hiPSC culture
KnockOut DMEM	Thermo Fisher Scientific	A1286101
KnockOut Serum Replacement	Thermo Fisher Scientific	10828028	Aliquot 40 mL/tube x 12 tubes and store at -20 °C.
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x)	Thermo Fisher Scientific	10378016
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)	Thermo Fisher Scientific	11140050
Insulin from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	I1882-100MG	Add 0.1 mL glacial acetic acid to 10 mL water. Sterilize by filtration (0.22 um). Dilute 100 mg insulin lyophilized powder with cold 10 mL the acidified water to make 10 mg/mL stock solution. Aliquot 650 μL/tube x 15 tubes and store at -80 °C.
human LIF	PeproTech	300-05	Reconstitute 250 μg human LIF with 250 μL water. Add 750 μL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 250 μg/mL human LIF stock solution. Specific activity of this product is >10,000 units/μg. Aliquot 40 ul/tube x 25 tubes and store at -80 °C.
human FGF2	R&D Systems	4114-TC	Reconstitute 1 mg human FGF2 with 5 mL PBS(-) to make 200 μg/mL human FGF2 stock solution. Aliquot 100 μL/tube x 50 tubes and store at -80 °C.
human TGF-β1	PeproTech	100-21	Reconstitite 50 μg with 50 μL of 10 mM Citric Acid (pH 3.0). Add 150 μL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 250 μg/mL human TGF-β1 stock solution. Aliquot 4 μL/tube x 50 tubes and store at -80 °C.
4i basal medium			Mix the following reagents to make 4i basal medium. 500 mL of KnockOut DMEM 100 mL of KnockOut Serum Replacement 6 mL of Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x) 6 mL of MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) 650 µL of 10 mg/mL Insulin from bovine pancreas 40 µL of 250 µg/mL human LIF 20 µl of 200 µg/ml human FGF2 4 µl of 250 µg/ml human TGF-β1 Aliquots 40 ml/tube and store at -80 °C.
CHIR99021	Axon	1386	Reconstitute 25 mg CHIR99021 (MW 465.34) with 1791 μL DMSO to make 30 mM CHIR99021 stock solution. Aliquot 50 μL/tube x 35 tubes and store at -20 °C.
PD0325901	Axon	1408	Reconstitute 5 mg PD0325901 (MW 482.19) with 1037 μL DMSO to make 10 mM PD0325901 stock solution. Aliquot 50 μL/tube x 20 tubes and store at -20 °C.
BIRB796	Axon	1358	Reconstitute 10 mg BIRB796 (MW 527.66) with 948 μL DMSO to make 20 mM BIRB796 stock solution. Aliquot 50 μL/tube x 18 tubes and store at -20 °C.
SP600125	Tocris	1496	Reconstitute 10 mg SP600125 (MW220.23) with 908 μL DMSO to make 50 mM SP600125 stock solution. Aliquot 50 μL/tube x 18 tubes and store at -20 °C.
AggreWell400	STEMCELL Technologies	27845	Microwell plate
Pluronic F-127	Sigma-Aldrich	P2443	Reconstitute 5 g Pluronic F-127 in 100 mL water to make 5%(w/v) Pluronic F127 stock solution. Sterilize by filtration (0.22 um). Aliqout 50 mL/tube x 2 tubes and store at r.t.
Name	Company	Catalog Number	Comments
hPGCLC culture
Glasgow’s MEM	Thermo Fisher Scientific	11710035
Sodium pyruvate (100 mM)	Thermo Fisher Scientific	11360070
Penicillin-Streptomycin (100x)	Corning	30-002-CI
hPGCLC basal medium			Mix the following reagents to make hPGCLC basal medium. 500 mL of Glasgow’s MEM 75 mL of KnockOut Serum Replacement 6 mL of MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) 6 mL of 100 mM Sodium pyruvate 6 mL of Penicillin-Streptomycin (x100) Aliquots 40 mL/tube and store at -20 °C.
2-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148	Dilute 350 μL 2-Mercaptoethanol (14.3 M) in 9.65 mL PBS(-) to make 500 mM 2-Mercaptoethanol stock solution . Store at 4 °C.
L-Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A4544	Reconstitute 400 mg L-Ascorbic acid with 20 mL water to make 20 mg/mL L-Ascorbic acid stock solution. Sterilize by filtration (0.22 um). Aliquot 500 μL/tube x 40 tubes and store at -20 °C.
Recombinant human BMP4	R&D Systems	314-BP	Reconstitute 1 mg recombinant human BMP4 with 10 mL of 4mM HCl aq. to make 100 μg/mL recombinant human BMP4 stock solution. Aliquot 250 μL/tube x 40 tubes and store at -80 °C.
Human SCF	PeproTech	300-07	Reconstitute 250 μg human SCF with 500 μL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 500 μg/mL human SCF stock solution. Aliquot 35 μL/tube x 14 tubes and store at -80 °C.
Human EGF	PeproTech	AF-100-15	Reconstitute 1 mg human EGF with 1 mL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 1 mg/mL human EGF stock solution. Aliqot 100 μL/tube x 10 tubes. Dilute 100 μL of 1 mg/ml human EGF stock solution with 300 μL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 250 μg/mL humanEGF stock solution. Aliquot 20 μL/tube x 20 tubes. Store at -80 °C.
Cell strainer	Corning	352340	Pore size = 40 μm.
50 ml polypropylene conical tube	Corning	352070
Low attachment plate	Corning	3471
Vari-Mix Platform Rocker	Thermofisher	M79735Q
Name	Company	Catalog Number	Comments
Immunohistochemical staining
BLOXALL Blocking Solution	VECTOR	SP-6000
Normal Horse serum ImmPRESS Reagent Anti-Goat IgG	VECTOR	MP-7405
OCT-3/4 Antibody	Santa Cruz	SC-8629
ImmPACT DAB	VECTOR	SK-4105
Permount	Thermofisher	SP15-100	Mounting medium
Name	Company	Catalog Number	Comments
Isolating hPGCLC
Embryoid Body Dissociation Kit	Miltenyi Biotec	130-096-348
Anti-CD38 antibody conjugated to APC	abcam	ab134399