Primordial bakterie celler (PGCs) er vanlige forløpere for både sæd og egg. Menneskelige embryonale PGCs angis fra pluripotent epiblast celler gjennom interaksjoner av cytokiner. Her beskriver vi en 13 dagers protokoll for å indusere menneskelige celler transcriptomally ligner PGCs på overflaten av embryoid organer fra primet-pluripotency indusert pluripotent stamceller.
Primordial bakterie celler (PGCs) er vanlige forløpere for alle germline celler. I mouse embryoer, ~ 40 PGCs grunnleggelsen innbyggere er indusert fra pluripotent epiblast celler av orkestrert eksponeringer til cytokiner, inkludert bein Morfogenetiske proteinet 4 (Bmp4). I menneskelige embryoer, de tidligste PGCs identifisert på endodermal veggen av eggeplomme sac rundt slutten av det 3rd uke av svangerskapet, men lite er kjent om menneskelig PGC spesifikasjon og deres tidlig utvikling. For å omgå tekniske og etiske barrierer av studere menneskelige embryonale PGCs, har surrogat celle kultur modeller nylig generert fra pluripotent stamceller. Her beskriver vi en 13 dagers protokoll for robust produksjon av menneskelige PGC-Like celler (hPGCLCs). Menneskelige indusert pluripotent stamceller (hiPSCs) opprettholdes tilstanden primet pluripotency ruges i 4i naive omprogrammering medium i 48 timer, avstand til enkeltceller og pakket inn i microwells. Langvarig vedlikehold av hiPSCs i naiv pluripotency staten forårsaker betydelig chromosomal avvik og bør unngås. hiPSCs i microwells opprettholdes for en ekstra 24 timer i 4i medium til skjemaet embryoid organer (EBs), som deretter kultivert i lav-etterlevelse plasticware under en rocking tilstand i hPGCLC induksjon medium som inneholder en høy konsentrasjon av rekombinant menneskelige BMP4. EBs er mer kultivert for opp til 8 dager rock, ikke-tilhenger tilstanden å oppnå maksimal avkastning av hPGCLCs. Av immunhistokjemi oppdages hPGCLCs lett som celler uttrykke sterkt OCT4 i nesten alle LoF utelukkende på overflaten deres. Når EBs enzymatisk avstand og utsatt for FACS berikelse, hPGCLCs kan hentes som CD38 + celler med opp til 40-45% avkastning.
Primordial bakterie celler (PGCs) er vanlige forløpere for alle germline celler i begge kjønn. De fleste av vår kunnskap om utviklingen av PGCs i pattedyr embryoer er innhentet gjennom å studere laboratoriet mus1,2. For embryonale dag 6.0-6.5 med musen embryo, er 6 eller lignende lite antall PGC prekursorer plassert i epiblast og grunnla innbyggere ~ 40 PGCs er indusert av dem på en måte avhengig av bein Morfogenetiske proteiner Bmp2 og Bmp4 skilles ut fra tilstøtende celler. De tidligste menneskelige PGCs hittil identifisert i embryo var på endodermal veggen av eggeplomme sac på rundt slutten av tredje uke av svangerskapet3. Fordi dette er samme sted som overfører PGCs er observert i mouse embryoer, er det sannsynlig at de observerte menneskelige PGCs var i veien for overføring, men ikke grunnleggelsen befolkningen. Men studier spore tilbake tidligere stadier av PGCs eller PGC forløpere i menneskelige embryo har vært savnet.
Menneskelige embryonale PGCs er utfordrende på grunn av både tekniske og etiske hindringer. For å overvinne disse hindringene, har PGC-lignende celle kultur modeller nylig generert fra menneskelige pluripotent stamceller (PSCer). Pluripotency er mobilnettet evnen til å differensiere i germline og tre embryonale bakterie lag4. Mens menneskelige PSCer opprettholdt i mTeSR1 medium (en klar til bruk, kommersielt tilgjengelig mellom formulert for vedlikehold av menneskelig PSCer tilstanden primet pluripotency) retter belagt med ekstracellulær matrix protein har primet statuser pluripotency 4, i 2013 Jacob Hanna lab viste at primet pluripotency cellene kan konverteres til en naiv pluripotency tilstand ved å utsette til naiv menneskelige stamceller medium (NHSM) som inneholder kjemiske hemmere til protein kinaser ERK1/2, GSK3, JNK, ROCK, PKC, p38 MAPK samt vekstfaktorer LIF, TGF, bFGF5. Fra naiv-pluripotency menneskelige PSCer, i 2015 oppnådd en forskningsgruppe ledet av Hanna og Azim Surani den første robust produksjonen av menneskelige PGC-Like celler (hPGCLCs) fra PSCer6. Senere rapporterte flere andre laboratorier, inkludert vår, generasjon hPGCLCs fra PSCer bruker litt forskjellige protokoller7,8,9,10. Vår studie gitt bevis for at hPGCLCs generert ved hjelp av forskjellige protokoller (som er oppsummert i tabellen S1 våre tidligere publisert studie10) transcriptomally som ligner hverandre10. Tilgjengelige bevis støtter likheten med menneskelige PGCLCs til tidlig stadium menneskelige embryonale PGCs før den globale epigenetic sletting7 og/eller chemotactic overføring10.
Studier av mus embryonale PGCs mus PGCLCs og menneskelig PGCLCs (men med bare svært begrenset tilgang til menneskelig PGCs) har avdekket at molekylære mekanismer PGC-spesifikasjonen variere betydelig mellom musen og menneskelige1,6, 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16 ,17. For eksempel Prdm14 spiller viktige roller i PGC spesifikasjonen i mouse embryoer, men dens rolle i menneskets PGC spesifikasjon synes begrenset1,15. Derimot er induksjon av SOX17 av EOMESODERMIN viktig for PGC spesifikasjon6,11,14, mens disse transkripsjonsfaktorer synes unnværlig for musen PGC spesifikasjon15. Disse første resultatene av studier med hPGCLCs sterkt støtte betydningen av denne cellen kultur modellen som et surrogat av menneskelige embryonale PGCs.
Nylig publiserte studier, som involverer våre laboratoriets dyp sekvensering evaluering av genomisk DNA kopi nummer analyse, har vist at langvarig vedlikehold av PSCer i naiv pluripotency staten betydelig øker risikoen for chromosomal ustabilitet og strukturelle anomalier. Dette fenomenet ble observert med både mus18 og menneskelige19 PSCer. Den originale hPGCLC produksjon protokollen rapportert av Hanna/Surani ble utviklet for menneskelig PSCer vedlikeholdes i 4i naiv pluripotency medium for minst 2 ukers6. For å bevare den normale diploide karyotype av menneskelige PSCer og PGCLCs, utviklet vi en endret protokoll som menneskelige PSCer er utsatt for 4i mediet for bare 72 timer10, som presenteres i denne artikkelen. Menneskelig iPSCs (hiPSCs) vedlikeholdes under primet pluripotency staten. Umiddelbart før EB formasjon, er celler ruges i 4i naiv reprogramming medium (en modifisert NHSM medium) i 48 timer. Celler deretter avstand og pakket i microwells skjemaet EBs for ytterligere 24 timer i 4i medium. EBs vedlikeholdes i hPGCLC induksjon medium som inneholder en høy konsentrasjon av rekombinant menneskelige BMP4 under en rocking tilstand for ikke-vedlegg kultur for opp til 8 dager å få maksimalt utbytte av hPGCLCs. Etter 8-dagers EB kultur, kan hPGCLCs være isolert fra avstand EB celler av FACS som CD38 + celler med opp til ~ 40% avkastning i FACS-sorterbar enkeltcelle suspensjon. Mens andre publisert genererer metoder7,8,9, inkludert originale protokoll før våre modifikasjoner6, vanligvis hPGCLCs i spontant dannet celle aggregater uten spesifikk lokalisering, hPGCLC produsert av våre protokollen er observert på overflaten av embryoid organer (EBs).
Robust produksjon av hPGCLCs ved hjelp av protokollen beskrevet her ble bekreftet med tre uavhengige kloner av menneskelig iPSCs med normal diploide karyotype10. Disse iPSC kloner var avledet fra samme neonatal dermal huden fibroblast celle kultur10. De vil bli gitt av forfatterne av denne artikkelen for etterforskerne på forespørsel og under riktige materialer overføringsavtalen og frakt arrangement av frosne levende menneskelige celler. Det er for øyeblikket ukjent om hvorvidt normal karyotype er nødvendig for robust hPGCLC produksjon våre protokollen eller rapporteringsstatistikker andre laboratorier.
Nyere studier har vist at produksjonen av hPGCLCs fra hiPSCs11 eller ESCs14 bruker en protokoll beskrevet av Saitous gruppe Kyoto University8 er avhengig av uttrykk for EOMESODERMIN, kreves en T-box transkripsjon faktor for induksjon av SOX17. SOX17 synes å fungere som master slektslinje utslagsgivende transkripsjon faktor germline atskilling av menneskelig pluripotent stamceller6. EOMESODERMIN er kodet av EOMES genet, CRISPR/Cas9 knockout av EOMES forårsaket nesten fullstendig fravær av SOX17 induksjon i hPGCLC produsere tilstanden11og uttrykk for andre gener fulgte samme mønster av SOX17 null knockout celler. Overuttrykte EOMESODERMIN fra en induserbart vektor i EOMES-null knockout celler under hPGCLC induksjon kultur effektivt reddet den robuste hPGCLC produksjon i tillegg til induksjon av germline gener, inkludert SOX17. Derimot indusert overuttrykte SOX17 også reddet robust PGCLC produksjon, men uten å indusere EOMES. Dermed EOMESODERMIN er en kritisk oppstrøms induser av SOX17, og dette synes enkelt viktigste rollen EOMESODERMIN i hPGCLC induksjon fra menneskelige pluripotent stamceller. Våre protokollen induserer SOX17 i hiPSCs10, men sin avhengighet av EOMESODERMINE induksjon venter skal bestemmes.
Denne protokollen konverterer primet pluripotency menneskelige iPSCs opprettholdt i mTeSR1 medium til ERK uavhengig naiv pluripotency i 96 timer i 4i omprogrammering middels6, som er en modifisert naiv menneskelige stamceller medium (NHSM)5. Våre forsøk på å generere hPGCLCs starter med de samme menneskelige iPSC Klonene men opprettholdt andre tilsvarede menneskelige iPSC vekst medier før kultur i 4i omprogrammering medium resulterte i varierende grad av lavere hPGCLC avkastning. Selv om langsiktige tilpasning i andre medier forbedrer hPGCLC produksjon eller ikke forblir avgjøres i fremtidige studier, denne observasjonen tyder på at den eksakte delstaten primet pluripotency av menneskelig iPSCs før 4i omprogrammering betydelig påvirker EB formasjonen i 4i medium og EB differensiering i hPGCLC medium.
Produksjon av hPGCLCs fra hiPSCs etter våre Protokoll er robust og svært reproduserbare, delvis på grunn av bruk av microwell platene som muliggjør effektiv produksjon av en rekke EBs (~ 8000 EBs per satsvis) med en enhetlig størrelse (3000 hiPSCs per EB). Antall EBs lett produsert i en enkelt bunke ved å bruke våre protokollen kan være langt større enn ved hjelp av vanlige U bunn celle kultur brønnene. Produksjonen av et stort antall like store EBs jevnt besatt med hPGCLCs kan gir unike muligheter høy gjennomstrømming kjemiske screenings å identifisere små molekyl vekt Aktivator eller hemmere påvirker PGC spesifikasjonen eller deres biologisk egenskaper som epigenetic omprogrammering. Slike EBs kan også være nyttig for toksikologiske vurderinger av store mengder germline celle giftstoffer, inkludert ikke bare miljøgifter, men også klinisk foreskrevet medisiner som chemotherapeutic agenter.
De kritiske faktorene av robust og reproduserbar produksjonen av hPGCLCs ved hjelp av presentert protokollen omfatter (i) bruk av sunn hiPSCs opprettholdt i mTeSR1 på ekstracellulær matrix proteiner, (ii) å vaksinere nøyaktig antall celler som spesifisert og strengt Følg tidsberegningen av medium endring og subkultur, (iii) å velge gode mange menneskelige rekombinant BMP4, og (iv) å minimere fysiske skader av EBs under rock kulturen. Det er vår erfaring at den beste masse BMP4 reagens jobbet på 100 ng/mL konsentrasjonen mens andre masse BMP4 reagenser kreves 2 X eller større doser. På den annen siden, avkastningen av hPGCLCs produksjon bruker den beste masse BMP4 ganske redusert ved høyere doser på BMP4 (f.eks 200 ng/mL). Vi anbefaler å teste flere forskjellige partier av rekombinant menneskelige BMP4 reagenser fra flere leverandører for sine prestasjoner i støtte hPGCLC generasjon og å sikre en stor mengde beste partiet.
En unik funksjon i vårt hPGCLC-protokollen er at hPGCLCs er lokalisert på ytterste overflatelaget av EBs10 (Figur 8), mens andre protokoller kan generere hPGCLCs i celle aggregater6,8. Embryoid organer har en tendens til å danne flere forskjellige lag som overflaten, ytre skall, indre skall og kjernen, og regionene sentrale kjernen er ofte nekrotisk på grunn av begrenset tilførsel av næringsstoffer, oksygen, samt pro-overlevende vekstfaktorer gitt skjemaet kultur middels av diffusjon20. Lokalisering av hPGCLCs på overflaten av EBs uten mulige restriksjoner på grunn av begrenset diffusjon mot midten av EBs kan være fordelaktig for direkte, tid – og dose-kontrollerte eksponering av hPGCLCs til narkotika eller giftige stoffer for farmakologisk eller toksikologiske studier.
Mens musen PGCLCs Vis robust genomet hele DNA demethylation involverer preging kontrollerer regioner minst delvis synes7,19,20, graden av global gDNA demethylation i hPGCLCs svakere enn mus PGCLCS eller PGCs6,7. Transcriptomal profiler foreslår at hPGCLCs kan ligne på et tidligere tidspunkt under embryonale PGCs enn musen PGCLCs10. Det har blitt rapportert at langvarig kultur EBs under forutsetning av hPGCLC produksjon forårsaket en økt grad av gDNA demethylation7; imidlertid om lengre kulturen i hPGCLCs i EBs eller som isolert celler kan oppnå mer avanserte stadier av germline differensiering må bestemmes av fremtidige studier.
The authors have nothing to disclose.
Vi erkjenner Shiomi Yawata og Chie Owa for kundestøtte under innledende studier. Denne studien ble støttet ved NIEHS/NIH tilskudd R01 ES023316 og R21ES024861 til TS og flyvertinne Medical Research Institute (FAMRI) gi til JHH.
Primed pluripotency hiPSC culture | |||
Matrigel | Corning | 354277 | Aliquot Matrigel at the volume indicated by the manufacturer (about 200 μL). Use cold tubes. Store at -80 °C |
DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 21041-025 | Store at 4 °C. |
mTeSR1 | STEMCELL Technologies | 85850 | Reconstitute by adding 5X Supplement to Basal Medium. The reconstituted medium can be stored at 4 °C for up to 4 weeks without affecting cell culture performance. |
Y27632 | Axon | 1683 | Dilute 5 mg Y27632 (MW 320.26) with 312.2 μL water to prepare 50 mM Y27632 stock solution. Sterilize by filtration (0.22 μm). Aliquot 20 μL/tube x 15 tubes and store at -20 °C. |
CryoStor CS10 | STEMCELL Technologies | 07930 | Store at 4 °C. |
Accutase | Innovative cell technologies | AT104-500 | Cell dissociation enzyme; aliquot 40 mL/tube x 12 tubes and store at -20 °C. |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
4i hiPSC culture | |||
KnockOut DMEM | Thermo Fisher Scientific | A1286101 | |
KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | Aliquot 40 mL/tube x 12 tubes and store at -20 °C. |
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x) | Thermo Fisher Scientific | 10378016 | |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Thermo Fisher Scientific | 11140050 | |
Insulin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | I1882-100MG | Add 0.1 mL glacial acetic acid to 10 mL water. Sterilize by filtration (0.22 um). Dilute 100 mg insulin lyophilized powder with cold 10 mL the acidified water to make 10 mg/mL stock solution. Aliquot 650 μL/tube x 15 tubes and store at -80 °C. |
human LIF | PeproTech | 300-05 | Reconstitute 250 μg human LIF with 250 μL water. Add 750 μL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 250 μg/mL human LIF stock solution. Specific activity of this product is >10,000 units/μg. Aliquot 40 ul/tube x 25 tubes and store at -80 °C. |
human FGF2 | R&D Systems | 4114-TC | Reconstitute 1 mg human FGF2 with 5 mL PBS(-) to make 200 μg/mL human FGF2 stock solution. Aliquot 100 μL/tube x 50 tubes and store at -80 °C. |
human TGF-β1 | PeproTech | 100-21 | Reconstitite 50 μg with 50 μL of 10 mM Citric Acid (pH 3.0). Add 150 μL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 250 μg/mL human TGF-β1 stock solution. Aliquot 4 μL/tube x 50 tubes and store at -80 °C. |
4i basal medium | Mix the following reagents to make 4i basal medium. 500 mL of KnockOut DMEM 100 mL of KnockOut Serum Replacement 6 mL of Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x) 6 mL of MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) 650 µL of 10 mg/mL Insulin from bovine pancreas 40 µL of 250 µg/mL human LIF 20 µl of 200 µg/ml human FGF2 4 µl of 250 µg/ml human TGF-β1 Aliquots 40 ml/tube and store at -80 °C. |
||
CHIR99021 | Axon | 1386 | Reconstitute 25 mg CHIR99021 (MW 465.34) with 1791 μL DMSO to make 30 mM CHIR99021 stock solution. Aliquot 50 μL/tube x 35 tubes and store at -20 °C. |
PD0325901 | Axon | 1408 | Reconstitute 5 mg PD0325901 (MW 482.19) with 1037 μL DMSO to make 10 mM PD0325901 stock solution. Aliquot 50 μL/tube x 20 tubes and store at -20 °C. |
BIRB796 | Axon | 1358 | Reconstitute 10 mg BIRB796 (MW 527.66) with 948 μL DMSO to make 20 mM BIRB796 stock solution. Aliquot 50 μL/tube x 18 tubes and store at -20 °C. |
SP600125 | Tocris | 1496 | Reconstitute 10 mg SP600125 (MW220.23) with 908 μL DMSO to make 50 mM SP600125 stock solution. Aliquot 50 μL/tube x 18 tubes and store at -20 °C. |
AggreWell400 | STEMCELL Technologies | 27845 | Microwell plate |
Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | Reconstitute 5 g Pluronic F-127 in 100 mL water to make 5%(w/v) Pluronic F127 stock solution. Sterilize by filtration (0.22 um). Aliqout 50 mL/tube x 2 tubes and store at r.t. |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
hPGCLC culture | |||
Glasgow’s MEM | Thermo Fisher Scientific | 11710035 | |
Sodium pyruvate (100 mM) | Thermo Fisher Scientific | 11360070 | |
Penicillin-Streptomycin (100x) | Corning | 30-002-CI | |
hPGCLC basal medium | Mix the following reagents to make hPGCLC basal medium. 500 mL of Glasgow’s MEM 75 mL of KnockOut Serum Replacement 6 mL of MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) 6 mL of 100 mM Sodium pyruvate 6 mL of Penicillin-Streptomycin (x100) Aliquots 40 mL/tube and store at -20 °C. |
||
2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | Dilute 350 μL 2-Mercaptoethanol (14.3 M) in 9.65 mL PBS(-) to make 500 mM 2-Mercaptoethanol stock solution . Store at 4 °C. |
L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | Reconstitute 400 mg L-Ascorbic acid with 20 mL water to make 20 mg/mL L-Ascorbic acid stock solution. Sterilize by filtration (0.22 um). Aliquot 500 μL/tube x 40 tubes and store at -20 °C. |
Recombinant human BMP4 | R&D Systems | 314-BP | Reconstitute 1 mg recombinant human BMP4 with 10 mL of 4mM HCl aq. to make 100 μg/mL recombinant human BMP4 stock solution. Aliquot 250 μL/tube x 40 tubes and store at -80 °C. |
Human SCF | PeproTech | 300-07 | Reconstitute 250 μg human SCF with 500 μL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 500 μg/mL human SCF stock solution. Aliquot 35 μL/tube x 14 tubes and store at -80 °C. |
Human EGF | PeproTech | AF-100-15 | Reconstitute 1 mg human EGF with 1 mL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 1 mg/mL human EGF stock solution. Aliqot 100 μL/tube x 10 tubes. Dilute 100 μL of 1 mg/ml human EGF stock solution with 300 μL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 250 μg/mL humanEGF stock solution. Aliquot 20 μL/tube x 20 tubes. Store at -80 °C. |
Cell strainer | Corning | 352340 | Pore size = 40 μm. |
50 ml polypropylene conical tube | Corning | 352070 | |
Low attachment plate | Corning | 3471 | |
Vari-Mix Platform Rocker | Thermofisher | M79735Q | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Immunohistochemical staining | |||
BLOXALL Blocking Solution | VECTOR | SP-6000 | |
Normal Horse serum ImmPRESS Reagent Anti-Goat IgG |
VECTOR | MP-7405 | |
OCT-3/4 Antibody | Santa Cruz | SC-8629 | |
ImmPACT DAB | VECTOR | SK-4105 | |
Permount | Thermofisher | SP15-100 | Mounting medium |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Isolating hPGCLC | |||
Embryoid Body Dissociation Kit | Miltenyi Biotec | 130-096-348 | |
Anti-CD38 antibody conjugated to APC | abcam | ab134399 |