Primordiala könsceller (PGCs) är gemensamma prekursorer av både spermier och ägg. Mänskliga embryonala PGCs specificeras från pluripotenta epiblast celler genom växelverkan av cytokiner. Här beskriver vi ett 13-dagars protokoll inducera humana celler transcriptomally som liknar PGCs på ytan av embryoid kroppar från primas-pluripotency inducerade pluripotenta stamceller.
Primordiala könsceller (PGCs) är gemensamma prekursorer av alla könsceller celler. I musembryon induceras en grundande befolkning på ~ 40 PGCs från pluripotenta epiblast celler av iscensatt exponeringar mot cytokiner, däribland benmorfogent protein 4 (Bmp4). I mänskliga embryon, de tidigaste PGCs har identifierats på endodermal väggen i gulesäcken runt slutet av 3rd veckan av dräktigheten, men lite är känt om processen för mänskliga PGC specifikation och sin tidiga utveckling. För att kringgå de tekniska och etiska hinder för att studera mänskliga embryonala PGCs, har surrogat cell kultur modeller genererats nyligen från pluripotenta stamceller. Här beskriver vi ett 13-dagars protokoll för robust produktion av mänskliga PGC-Like celler (hPGCLCs). Mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs) underhålls i tillståndet primade pluripotency inkuberas i 4i naiva omprogrammering medium för 48 timmar, dissocierade att enstaka celler, och packas in i mikrobrunnarna. Långvarig underhåll av hiPSCs i tillståndet naiva pluripotency orsakar betydande kromosomavvikelser och bör undvikas. hiPSCs i mikrobrunnarna bibehålls för ytterligare 24 timmar på 4i medellång till formuläret embryoid organ (EBs), som sedan odlade i låg-följsamhet plasticware under ett gungande tillstånd hPGCLC induktion medium som innehåller en hög koncentration av rekombinant humant BMP4. EBs odlas vidare upp till 8 dagar i den gungande, icke-anhängare skick för att få maximal avkastning av hPGCLCs. Av immunohistokemi upptäcks lätt hPGCLCs som celler som uttrycker starkt OCT4 i nästan alla EBs uteslutande på deras yta. När EBs är enzymatiskt skiljas och utsätts för FACS anrikning, hPGCLCs kan samlas som CD38 + celler med upp till 40-45% avkastning.
Primordiala könsceller (PGCs) är gemensamma prekursorer av alla könsceller celler hos båda könen. De flesta av våra kunskaper om utveckling av PGCs i däggdjur embryon har erhållits genom att studera laboratorium möss1,2. På embryonala dag 6,0-6,5 musembryon, är 6 eller liknande litet numrerar av PGC prekursorer belägna i epiblast, och en grundande population ~ 40 PGCs induceras från dem på ett sätt som är beroende av bone morphogenetic proteiner Bmp2 och Bmp4 utsöndras från angränsande celler. De tidigaste mänskliga PGCs hittills identifierat i embryon var på endodermal väggen i gulesäcken på runt slutet av den tredje veckan av dräktigheten3. Eftersom detta är samma ställe som migrerar PGCs observeras i musembryon, är det troligt att de observerade mänskliga PGCs var i vägen för migration men inte den ursprungliga befolkningen. Dock studier spåra tillbaka tidigare stadier av PGCs eller PGC prekursorer i mänskliga embryon har saknats.
Tillgång till mänskliga embryonala PGCs är utmanande på grund av både tekniska och etiska hinder. För att övervinna dessa hinder, har PGC-liknande cell kultur modeller genererats nyligen från mänskliga pluripotenta stamceller (PSC). Pluripotency är cellulära förmåga att differentieras till könsceller och tre embryonala könsceller lager4. Medan mänskliga PSC underhålls i mTeSR1 medium (en ready-to-use, kommersiellt tillgängliga medium som framtagen för underhåll av människors gemensamma kontaktpunkter i tillståndet primade pluripotency) på rätter överdragna med extracellulära matrix protein har primas-state pluripotens 4, 2013 Jacob Hanna’s lab visade att de grundmålade pluripotenta cellerna kan omvandlas till en naiv pluripotency stat genom att utsätta för den naiva mänskliga stamceller medium (NHSM) som innehåller kemiska hämmare till proteinkinaser GSK3, ROCK, JNK, ERK1/2, PKC, och p38 MAPK samt tillväxtfaktorer LIF, TGF, bFGF5. Från naiva-pluripotenta mänskliga kontaktpunkterna, i 2015 fulländade en forskargrupp ledd av Hanna och Azim Surani den första robusta produktionen av mänskliga PGC-Like celler (hPGCLCs) från PSC6. Flera andra laboratorier, inklusive vår, rapporterade senare, generation av hPGCLCs från PSC använder något olika protokoll7,8,9,10. Vår studie som bevis för att hPGCLCs genereras med hjälp av olika protokoll (som sammanfattas i tabell S1 av vår tidigare publicerade studien10) är transcriptomally liknar varandra10. Tillgängliga bevis stöder likheten av mänskliga PGCLCs till nystartade mänskliga embryonala PGCs före den globala epigenetiska erasure7 eller kemotaktisk migration10.
Studier av mus embryonala PGCs, mus PGCLCs och mänskliga PGCLCs (men med endast mycket begränsad tillgång till mänskliga PGCs) har avslöjat att molekylära mekanismer av PGC specifikationen skiljer sig avsevärt mellan mus och människa1,6, 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16 ,17. Exempelvis Prdm14 spelar avgörande roller i PGC specifikation i musembryon, men dess roll i mänsklig PGC specifikation verkar begränsad1,15. Däremot är induktion av SOX17 av EOMESODERMIN avgörande för PGC specifikation6,11,14, medan dessa transkriptionsfaktorer verkar dispensable för mus PGC specifikation15. Dessa inledande framgångar av studier med hPGCLCs starkt stödja vikten av denna cell kultur modell som ett surrogat för mänskliga embryonala PGCs.
Nyligen publicerade studier, vårt lab’s djupsekvensering utvärdering av genomisk DNA-kopia nummer analys, har visat att långvarig underhåll av PSC i tillståndet naiva pluripotency avsevärt ökar risken för kromosominstabilitet och strukturella anomalier. Fenomenet observerades med både mus18 och mänskliga19 PSC. Den ursprungliga hPGCLC produktion protokollet rapporteras av Hanna/Surani utvecklades för mänskliga PSC underhålls i 4i naiva pluripotency medium för minst 2 veckor6. För att bevara den normala diploida karyotyp av mänskliga PSC och PGCLCs, utvecklade vi ett modifierat protokoll där mänskliga PSC är utsatta till 4i medium för bara 72 timmar10, som presenteras i denna artikel. Mänskliga iPSCs (hiPSCs) bibehålls under den primade pluripotency staten. Omedelbart före bildandet av EB inkuberas celler i 4i naiva omplanering medium (en modifierad NHSM medium) i 48 timmar. Celler är sedan skiljas och packas in i mikrobrunnarna att bilda EBs för ytterligare 24 timmar i 4i medium. EBs underhålls i hPGCLC induktion medium som innehåller en hög koncentration av rekombinant human BMP4 under ett gungande villkor för no-attachment kultur för upp till 8 dagar att få den högsta avkastningen av hPGCLCs. Efter 8 dagars EB kultur, kan hPGCLCs vara isolerade från dissocierade EB celler med FACS CD38 + celler med upp till ~ 40% direktavkastning FACS-sorterbara enda cellsuspension. Medan andra publicerade genererar metoder7,8,9, inklusive den ursprungliga protokollet före våra ändringar6, vanligtvis hPGCLCs i spontant bildade cell aggregat utan specifika lokalisering, hPGCLC producerad av våra protokoll observeras på ytan av embryoid organ (EBs).
Robust tillverkning av hPGCLCs med hjälp av protokollet som beskrivs här bekräftades med tre oberoende kloner av mänskliga iPSCs med normala diploida karyotyp10. Dessa iPSC kloner härleddes från samma mänskliga neonatal dermal huden fibroblast cell kultur10. De kommer att tillhandahållas av författarna till denna artikel till utredare på begäran och enligt avtal om lämpliga material och frakt arrangemang av fryst levande mänskliga celler. Det är för närvarande okänt huruvida normal karyotyp är krävs för robust hPGCLC produktionen använda våra protokoll eller de rapporterats av andra laboratorier.
Nyligen genomförda studier har visat att produktionen av hPGCLCs från hiPSCs11 eller ESCs14 använder ett protokoll som beskrivs av Saitous grupp Kyoto University8 är beroende av uttryck av EOMESODERMIN, krävs en T-box transkriptionsfaktor för induktion av SOX17. SOX17 verkar fungera som master släktlinje fastställande transkriptionsfaktor i könsceller differentiering av mänskliga pluripotenta stamceller6. EOMESODERMIN kodas av genen EOMES , CRISPR/Cas9 knockout av EOMES orsakade nästan total avsaknad av SOX17 induktion i den hPGCLC som producerar skick11och uttryck för andra gener följt samma mönster av den SOX17 är null knockout celler. Överuttryck av EOMESODERMIN från en inducerbara vektor i den EOMES-null knockout celler under hPGCLC induktion kultur effektivt räddade den robusta hPGCLC produktion samt induktion av könsceller gener, inklusive SOX17. Däremot inducerad överuttryck SOX17 också räddade robust PGCLC produktion men utan förmå EOMES. Således, EOMESODERMIN är en kritisk uppströms inducerare av SOX17, och detta verkar vara den enda viktigaste rollen av EOMESODERMIN i hPGCLC induktion från mänskliga pluripotenta stamceller. Våra protokoll inducerar SOX17 i hiPSCs10, men beroendet EOMESODERMINE induktion väntar skall fastställas.
Detta protokoll konverterar primas-pluripotenta mänskliga iPSCs underhålls i mTeSR1 medellång till ERK-oberoende naiva pluripotency i 96 timmar i 4i omprogrammering medium6, som är en modifierad naiva mänskliga stamceller medium (NHSM)5. Våra försök att generera hPGCLCs börjar med samma mänskliga iPSC klonerna men underhålls i andra kommersiellt tillgängliga mänskliga iPSC tillväxt medier innan kultur i 4i omprogrammering medium resulterade i varierande grad av lägre hPGCLC avkastning. Även om huruvida långsiktiga anpassning i andra medier förbättrar hPGCLC produktion eller inte är fortfarande fastställas i framtida studier, denna observation tyder på att den exakta delstaten den primade pluripotency av mänskliga iPSCs innan 4i omprogrammering betydligt effekter EB bildandet i 4i medium och EB differentiering i hPGCLC medium.
Produktion av hPGCLCs från hiPSCs följande våra protokoll är robust och mycket reproducerbara, delvis på grund av användning av mikrobrunn plattorna som möjliggör effektiv produktion av ett stort antal EBs (~ 8000 EBs per sats) med en enhetlig storlek (3 000 hiPSCs per EB). Antalet EBs lätt produceras i ett parti av experiment med hjälp av våra protokoll kan vara långt större än metoder med regelbundna U-botten cell kultur brunnarna. Produktion av ett stort antal lika stora EBs enhetligt översållad med hPGCLCs kan ge unika möjligheter hög genomströmning kemiska filmvisningar att identifiera små molekylvikt aktivatorer eller hämmare påverkar PGC specifikation eller deras biologiska egenskaper såsom epigenetiska omprogrammering. Sådan EBs kan också vara användbara för toxikologiska bedömningar av stora mängder könsceller cell gifter, inklusive inte bara miljömässiga föroreningar utan också kliniskt föreskrivna mediciner såsom kemoterapeutika.
De kritiska faktorerna av robusta och reproducerbara produktion av hPGCLCs använda protokollet presenteras inkluderar (i) användning av friska hiPSCs underhålls i mTeSR1 på extracellulära matrix protein, (ii) att Inokulera exakta antalet celler som anges och strikt Följ tidpunkterna för medelstora förändring och subkultur, (iii) för att välja en bra massa humant rekombinant BMP4 och (iv) för att minimera fysiska skador av EBs under den gungande kulturen. Det är vår erfarenhet att den bästa massa BMP4 reagens arbetade på 100 ng/mL koncentration medan andra massa BMP4 reagenser krävs 2 X eller större doser. Å andra sidan, avkastningen av hPGCLCs produktion använder den bästa massa BMP4 snarare minskade vid högre doser av BMP4 (t.ex. 200 ng/mL). Vi rekommenderar att testa flera olika massor av rekombinant human BMP4 reagenser erhållits från flera leverantörer för deras prestanda stödja hPGCLC generation och att säkra en stor mängd bästa partiet.
En unik funktion i vårt hPGCLC protokoll är att hPGCLCs är lokaliserade på yttersta ytskiktet av EBs10 (figur 8), medan andra protokoll kan generera hPGCLCs i mitten av cellen aggregat6,8. Embryoid organ tenderar att bilda flera distinkta lager såsom yta, yttre skal, inre skal och kärna, och Regionkommittén central kärna är ofta nekrotisk på grund av begränsad tillförsel av näringsämnen, syre, samt pro-överlevande tillväxt faktorer anges form kulturen medium genom diffusion20. Lokalisering av hPGCLCs på ytan av EBs utan möjliga restriktioner på grund av begränsad spridning mot centrum av EBs kan vara fördelaktigt för direkt, tid – och dos-kontrollerad exponering av hPGCLCs för läkemedel eller giftiga ämnen för farmakologisk eller toxikologiska studier.
Medan musen PGCLCs Visa robust genome-wide DNA demetylering som involverar imprinting kontrollerar regioner åtminstone delvis verkar7,19,20, graden av globala gDNA demetylering i hPGCLCs svagare än mus PGCLCS eller PGCs6,7. Transcriptomal profiler tyder på att hPGCLCs kan likna ett tidigare skede av embryonala PGCs än mus PGCLCs10. Det har rapporterats att långvarig kultur av EBs under förutsättning att hPGCLC produktionen orsakade en ökad grad av gDNA demetylering7; om en längre period av kultur av hPGCLCs i EBs eller som isolerade celler kan uppnå mer avancerade stadier av könsceller differentiering måste dock fastställas genom framtida studier.
The authors have nothing to disclose.
Vi erkänner Shiomi Yawata och Chie Owa för tekniskt bistånd under inledande studier. Denna studie stöddes genom NIEHS/NIH grants R01 ES023316 och R21ES024861 till TS och flygvärdinna Medical Research Institute (FAMRI) bidrag till datorer.
Primed pluripotency hiPSC culture | |||
Matrigel | Corning | 354277 | Aliquot Matrigel at the volume indicated by the manufacturer (about 200 μL). Use cold tubes. Store at -80 °C |
DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 21041-025 | Store at 4 °C. |
mTeSR1 | STEMCELL Technologies | 85850 | Reconstitute by adding 5X Supplement to Basal Medium. The reconstituted medium can be stored at 4 °C for up to 4 weeks without affecting cell culture performance. |
Y27632 | Axon | 1683 | Dilute 5 mg Y27632 (MW 320.26) with 312.2 μL water to prepare 50 mM Y27632 stock solution. Sterilize by filtration (0.22 μm). Aliquot 20 μL/tube x 15 tubes and store at -20 °C. |
CryoStor CS10 | STEMCELL Technologies | 07930 | Store at 4 °C. |
Accutase | Innovative cell technologies | AT104-500 | Cell dissociation enzyme; aliquot 40 mL/tube x 12 tubes and store at -20 °C. |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
4i hiPSC culture | |||
KnockOut DMEM | Thermo Fisher Scientific | A1286101 | |
KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | Aliquot 40 mL/tube x 12 tubes and store at -20 °C. |
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x) | Thermo Fisher Scientific | 10378016 | |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Thermo Fisher Scientific | 11140050 | |
Insulin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | I1882-100MG | Add 0.1 mL glacial acetic acid to 10 mL water. Sterilize by filtration (0.22 um). Dilute 100 mg insulin lyophilized powder with cold 10 mL the acidified water to make 10 mg/mL stock solution. Aliquot 650 μL/tube x 15 tubes and store at -80 °C. |
human LIF | PeproTech | 300-05 | Reconstitute 250 μg human LIF with 250 μL water. Add 750 μL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 250 μg/mL human LIF stock solution. Specific activity of this product is >10,000 units/μg. Aliquot 40 ul/tube x 25 tubes and store at -80 °C. |
human FGF2 | R&D Systems | 4114-TC | Reconstitute 1 mg human FGF2 with 5 mL PBS(-) to make 200 μg/mL human FGF2 stock solution. Aliquot 100 μL/tube x 50 tubes and store at -80 °C. |
human TGF-β1 | PeproTech | 100-21 | Reconstitite 50 μg with 50 μL of 10 mM Citric Acid (pH 3.0). Add 150 μL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 250 μg/mL human TGF-β1 stock solution. Aliquot 4 μL/tube x 50 tubes and store at -80 °C. |
4i basal medium | Mix the following reagents to make 4i basal medium. 500 mL of KnockOut DMEM 100 mL of KnockOut Serum Replacement 6 mL of Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x) 6 mL of MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) 650 µL of 10 mg/mL Insulin from bovine pancreas 40 µL of 250 µg/mL human LIF 20 µl of 200 µg/ml human FGF2 4 µl of 250 µg/ml human TGF-β1 Aliquots 40 ml/tube and store at -80 °C. |
||
CHIR99021 | Axon | 1386 | Reconstitute 25 mg CHIR99021 (MW 465.34) with 1791 μL DMSO to make 30 mM CHIR99021 stock solution. Aliquot 50 μL/tube x 35 tubes and store at -20 °C. |
PD0325901 | Axon | 1408 | Reconstitute 5 mg PD0325901 (MW 482.19) with 1037 μL DMSO to make 10 mM PD0325901 stock solution. Aliquot 50 μL/tube x 20 tubes and store at -20 °C. |
BIRB796 | Axon | 1358 | Reconstitute 10 mg BIRB796 (MW 527.66) with 948 μL DMSO to make 20 mM BIRB796 stock solution. Aliquot 50 μL/tube x 18 tubes and store at -20 °C. |
SP600125 | Tocris | 1496 | Reconstitute 10 mg SP600125 (MW220.23) with 908 μL DMSO to make 50 mM SP600125 stock solution. Aliquot 50 μL/tube x 18 tubes and store at -20 °C. |
AggreWell400 | STEMCELL Technologies | 27845 | Microwell plate |
Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | Reconstitute 5 g Pluronic F-127 in 100 mL water to make 5%(w/v) Pluronic F127 stock solution. Sterilize by filtration (0.22 um). Aliqout 50 mL/tube x 2 tubes and store at r.t. |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
hPGCLC culture | |||
Glasgow’s MEM | Thermo Fisher Scientific | 11710035 | |
Sodium pyruvate (100 mM) | Thermo Fisher Scientific | 11360070 | |
Penicillin-Streptomycin (100x) | Corning | 30-002-CI | |
hPGCLC basal medium | Mix the following reagents to make hPGCLC basal medium. 500 mL of Glasgow’s MEM 75 mL of KnockOut Serum Replacement 6 mL of MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) 6 mL of 100 mM Sodium pyruvate 6 mL of Penicillin-Streptomycin (x100) Aliquots 40 mL/tube and store at -20 °C. |
||
2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | Dilute 350 μL 2-Mercaptoethanol (14.3 M) in 9.65 mL PBS(-) to make 500 mM 2-Mercaptoethanol stock solution . Store at 4 °C. |
L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | Reconstitute 400 mg L-Ascorbic acid with 20 mL water to make 20 mg/mL L-Ascorbic acid stock solution. Sterilize by filtration (0.22 um). Aliquot 500 μL/tube x 40 tubes and store at -20 °C. |
Recombinant human BMP4 | R&D Systems | 314-BP | Reconstitute 1 mg recombinant human BMP4 with 10 mL of 4mM HCl aq. to make 100 μg/mL recombinant human BMP4 stock solution. Aliquot 250 μL/tube x 40 tubes and store at -80 °C. |
Human SCF | PeproTech | 300-07 | Reconstitute 250 μg human SCF with 500 μL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 500 μg/mL human SCF stock solution. Aliquot 35 μL/tube x 14 tubes and store at -80 °C. |
Human EGF | PeproTech | AF-100-15 | Reconstitute 1 mg human EGF with 1 mL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 1 mg/mL human EGF stock solution. Aliqot 100 μL/tube x 10 tubes. Dilute 100 μL of 1 mg/ml human EGF stock solution with 300 μL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 250 μg/mL humanEGF stock solution. Aliquot 20 μL/tube x 20 tubes. Store at -80 °C. |
Cell strainer | Corning | 352340 | Pore size = 40 μm. |
50 ml polypropylene conical tube | Corning | 352070 | |
Low attachment plate | Corning | 3471 | |
Vari-Mix Platform Rocker | Thermofisher | M79735Q | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Immunohistochemical staining | |||
BLOXALL Blocking Solution | VECTOR | SP-6000 | |
Normal Horse serum ImmPRESS Reagent Anti-Goat IgG |
VECTOR | MP-7405 | |
OCT-3/4 Antibody | Santa Cruz | SC-8629 | |
ImmPACT DAB | VECTOR | SK-4105 | |
Permount | Thermofisher | SP15-100 | Mounting medium |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Isolating hPGCLC | |||
Embryoid Body Dissociation Kit | Miltenyi Biotec | 130-096-348 | |
Anti-CD38 antibody conjugated to APC | abcam | ab134399 |