Summary
ApoE- / - fareler aldosteron sürekli bir sürüm boyunca aterojenik bir diyet ile beslenen aort kökünde ateroskleroz ikna etmek için bir protokol açıklar. Plak kompozisyon karakterize yöntemleri de açıklanmaktadır.
Abstract
Ateroskleroz nedeniyle kronik inflamatuar yanıt vasküler endotel etkileyen ve hipertansiyon, dislipidemi ve diyabet gibi çeşitli faktörler tarafından yükseltilir. Bugüne kadar kardiyovasküler hastalık gelişimi için bir risk faktörü olarak aldosteron dolaşan bir rol destekleyecek kanıt vardır. Transgenik fare modelleri ateroskleroz için önde gelen hücresel ve moleküler süreçleri çalışmaya üretilmedi. Bu el yazması ApoE- / - farelerde aldosteron sürekli infüzyon yararlanır ve aterosklerotik plaklar aortik kökü tedavisi 4 hafta sonra oluşturur bir iletişim kuralını tanımlar. Biz, bu nedenle, miktar ve aortik kök düzeyinde aterosklerotik lezyonların karakterizasyonu için bir yöntem gösterilmektedir. Aldosteron infüzyon katma değeri aterosklerotik lezyonları lipid ve inflamatuar hücre zengin nesil tedavi 4 hafta sonra gösterilir. Plak lipid ve makrofaj içeriğinde ölçmek için boyama yordamlarda ayrıntılı olarak açıklanmaktadır. Özellikle, bu protokol için kalp kalp doku antigenicity korumak ve algılama antijenleri ilgi kolaylaştırmak amacıyla Ekim doku gömme gerçekleştiriyoruz. Plak fenotip analizini ateroskleroz gelişiminin patofizyolojisi çalışma ve anti-aterojenik uyuşturucu gelişimi için roman farmakolojik hedefleri belirlemek için geçerli bir yaklaşım temsil eder.
Introduction
Ateroskleroz mortalite ve morbidite dünya çapında1ana nedenlerinden biridir. Lipidler ve aterosklerotik plak oluşumunu belirleyen lökositler tarafından kan damarları nerede sızmış bir kronik inflamatuar durumu ile karakterizedir. Akut kalp olaylar çoğunluğu plak yırtılması nedeniyle trombotik olaylar ile ilişkilidir. Plak rüptürü eğilimli "hassas" tanımlanır ve pro-inflamatuar lökosit, nekrotik bir çekirdek ve ince lifli kap2artan infiltrasyonu ile karakterizedir. Son yıllarda, klinik ve deneysel çalışmalar hastalığın karmaşık patofizyolojisi açıklık var. Birkaç hayvan modeli moleküler mekanizmaları ateroskleroz3indüksiyon içinde yer alan araştırmak için kullanılır. Şu anda, fare ile karşılaştırıldığında insanlar onun patofizyolojisi mevcut species-specific bazı farklılıklara rağmen ateroskleroz eğitim için en sık kullanılan türdür. İnsanlarda kolesterol dolaşan ağırlıklı düşük yoğunluklu lipoproteinler (LDL), taşınır iken özellikle kolesterol dolaşan esas olarak yüksek yoğunluklu lipoproteinler (ile antiatherogenic özellikleri) tarafından fare modellerinde, muhtemelen oluşur Neden vahşi tipi fareler spontan ateroskleroz4geliştirmek mi ana nedeni temsil eden. Oysa insanlar yaklaşık % 50'sini diyet kolesterol4absorbe Ayrıca, farelerde vahşi tip kolesterol diyet, emici için genellikle dayanıklıdır. Bu sınırlamalarını aşmak için birkaç genetiği değiştirilmiş fare modelleri üretilmedi. Apolipoprotein E-eksik fare (ApoE−/−) ve LDL reseptör-eksik fare (LDLr−/−) yaygın olarak kullanılmaktadır. Yüksek yağ yüksek kolesterol diyet, hızla LDLr−/−farelere göre daha fazla plak ApoE−/− fareler geliştirmek ve bu nedenle, apolipoprotein−/− fareler kullanmaktır LDLr−/−fareler5,6bundan daha yaygın. ApoE−/− fare lezyonlar ateroskleroz herhangi bir aşamada geliştirmek ve her ne kadar fare plaklar bir kararsız fenotip7gösterme bu insanlarda gözlenen karşılaştırılabilir vardır. Genel olarak, apolipoprotein−/− fareler kendiliğinden ateroskleroz geliştirmek ve bu işlem ile Batı diyet3hızlandırılır. Ateroskleroz şiddeti karotis, akciğer, femur ve brachiocephalic arter ve aortik kök6düzeyinde değerlendirilebilir. Özellikle, aortik kökü bir anatomik site farelerde aterosklerotik lezyonları geliştirmek eğilimli temsil eder. Bu nedenle, bu bölgedeki aterosklerotik plak oluşumunu değerlendirmek için yaygın bir uygulama olduğunu.
Çeşitli çalışmalarda bu aldosteron ateroskleroz8,9,10gelişiminde karıştığı göstermiştir. Aldosteron infüzyon aterojenik bir diyet beslenen ApoE−/− farelerde aortik kök aterosklerotik lezyonlar iltihaplı ve lipid-zengin plak oluşumu10inducing gelişimini hızlandırır.
Özetle, aldosteron infüzyon, beslenme, kalp dokuları, miktar ve karakterizasyonu aterosklerotik lezyonların ApoE- / - farelerde katılmasını aterojenik diyet dahil olmak üzere bir protokolü açıklar. Bu yordam iltihaplı, lipid zengini aterosklerotik plaklar verimli bir oluşumu teşvik ve atherogenesis incelenmesi için değerli bir model temsil eder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Çalışma İtalyan Ulusal kurumları sağlık bakım ve kullanım komiteler, yetkilendirme sayı 493/2016-PR tarafından kabul edildi Tüm yordamları yönergeleri deneysel hayvan kullanımı için Avrupa Topluluğu'nun başı yapılmıştır (Avrupa Yönergesi, 2010/63/UE).
Not: Araç (etanol tuzlu çözümde) veya aldosteron içeren ozmotik minipump subkutan implantasyonu (240 µg kg-1 · · d-1) 8-10 hafta içinde-eski erkek fareler için ApoE gen eksik. Genel, 8-10 hafta içinde-eski erkek ApoE−/− fareler yaklaşık 25-26 g ağırlığında.
1. aldosteron eriterek
- Aldosteron toz mutlak etanol 1 ml 5 mg geçiyoruz.
- (Etanol içinde çözünmüş) aldosteron 56.7 µL 2,27 µg bir konsantrasyon elde etmek için tuzlu çözüm 68.3 µL için Ekle / µL. doldurun tamamen (her minipump 125 µL yoktur) bu çözümün 125 µL ile tüm ozmotik minipumps.
- Bir minipump debi 0,11 µL/h kullanın; Bu nedenle çözüm 2.64 µL serbest her 24 h vermek her fare çevrede 6 µg · aldosteron 28 gün d-1 .
2. ozmotik pompa doldurma ve implantasyon
Not: Pompalar iki ayrı bölümde sağlanır: ana gövdesi, pompa ve akım regülatörü.
- Doldurun ve cerrahi eldiven kullanarak minipumps kolu.
Not: Cilt yağlar ile minipumps performansını etkileyebilir. Aşağıdaki adımları bir steril laminar akış mahallede yapılmalıdır. - 1 mL şırınga (minipumps ile birlikte) Dolum tüpü takmak ve aldosteron çözüm veya araç kadar çizin.
Not: Şırınga içindeki hava pompa içine hava kabarcıklarının oluşumunu önlemek için tüp çözümlerinden alıyorum süre izin kaçının önemlidir. - Daha ileri gidebilirsiniz kadar dolum tüpü delikten minipump ekleyebilir (Şekil 1A-1B). Yavaş yavaş pompa aldosteron veya araç ile doldurun. Sıvı düzey gösteren pompa içinde karanlık gölge dikkat edin. Benzin pompası ile birlikte bu düzey yükselişini seyrediyorum.
- Ne zaman bir boncuk sıvı pompa vücut dışına yükselir pompa doldurma durdurmak.
- Dikkatli bir şekilde dolum tüpü çıkarması ve akış düzenleyici minipump (Şekil 1 c) vücut içine yerleştirin. Regülatör pompa gövdesi karşı sıkıca oturduğundan emin olun. En fazla 24 saat önce fare (priming yordam) implantasyon için 37 ° C'de steril serum fizyolojik solüsyon içeren bir ölçek dolgulu ozmotik pompalar bırakın.
- Ameliyat asepsis teşvik % 70 etanol ile dezenfekte bir alanda yapmak.
- 1-3 damla % 0.25 bupivacaine kesi yerinde uygulamak ve % 3 isoflurane hayvanla anestezi. Tedarik gazı ve akış ölçer 500-1000 mL/dk. yer hayvan indüksiyon odasında ayarla ve üst mühür. Buharlaştırıcı %5 isoflurane için açmak ve fareyi yaslanmış kadar izlemek.
- Nosecone için akış sisteme geçiş. Hayvan odası ve nosecone bulunduğu kaldırın. 2-3 dakika içinde fare uyandırmak başlar. Gaz akışı 100-200 mL/dk akış ölçer ve % 3 isoflurane, buharlaştırıcı yeniden başlatın.
- Yeterli pedal çekilmesi ve palpebral refleksleri test ederek yordamları gerçekleştirmeden önce anestezi derinliği sağlamak. Solunum ve stimülasyon işlemi sırasında yanıt izlemek ve buharlaştırıcı gerektiği gibi ayarlayın.
- Kornealar bir oftalmik merhem uygulayarak kurutma koruyun.
- Hayvan bir ustura (Şekil 1 d) kullanarak cerrahi sitesinden saç kaldırarak hazırlayın. Her zamanki pompalar subkutan implantasyonu için arkasında sitedir.
- % 70 izopropil alkol ile doymuş nonwoven ped malzeme ile cerrahi site hazırlamak.
- (% 70 etanol ile dezenfekte) temiz ve özel bir alanı kullanmak ve steril bir örtüsü ile kaplı. Aletleri ucu bir cam boncuk Sterilizatör yerleştirin. Cerrahi steril aletler ile başlar ve aletleri aseptik kolu.
- Cerrahi makas 0,8-1 yapmak, cm kesi (yaklaşık 2 cm kuyruk yakın), gösterildiği gibi rakamlar 1E-1F. Kısırlık steril eldiven veya ipuçları aletleri ile cerrahi ayrılmış alan dışında herhangi bir şeye dokunmadan tarafından değil korumak.
- Sadece cilt ama değil alttaki dokuları kesmek için kendine iyi bak. Bir yandan forseps kesi açık tutmak için kullanın. Öte yandan cilt pompa için bir cep arkadan yukarı doğru kürek kemiği (üzerinde fareyi sağ veya sol tarafında) için oluşturmak için yaymak için trokar tutmak için kullanın.
- Pompa belgili tanımlık kesme Ekle. Yavaşça pompa tamamen cebine (Şekil 1 H) itin. Yeterince cilt gerginlik yok yarayla kapatmak ücretsiz ya da gerekli cilt germe olmalıdır. Pompa eklendikten sonra ameliyat tel (polyglactin 910 dikiş boyutu 6-0 ile) ile belgili tanımlık kesme dikiş
Not: Regülatör Başkanı fare (Şekil 1G) ön doğru odaklı olması gerekir. - Temiz bir bez (Şekil 1I) ile topikal % 10 povidone/iyot merhem uygulamak ve hayvan ısınma bir sahne üzerinde tutun. Onlar sternal recumbency kurtarmak kadar fareler içinde sahipsiz bırakmayın. Hidrasyon durumu değerlendirmek ve gerekli, subkutan 0,5 mL % 0,9 tuz çözeltisi yönetmek. Hayvan onun rutin konut için dönmek.
- Belgeleri için kurumsal yönergeleri izleyin (örneğin, cerrahi form ile ameliyat ve ameliyat sonrası bilgi, yordam ve tarihi ile güncelleştirme kafes kartı doldurun) ve analjezikler (buprenorfin, 0,05 mg/kg) ameliyat sonrası ağrı azaltmak için sağlar ve antibiyotikler (enrofloksasin 85 mg/kg) ameliyat sonrası enfeksiyonu önlemek için.
- Günlük izleme devam ve ağrı belirtileri için inceleyin. Yara tamamen kapalı ve minipump subkutan cebine korunur dikkat. Yara açılabilir ve fare minipump kaybedebilirsiniz.
3. kalp diseksiyon
- Kurban, anestethize fareler 80-100 mg/kg intramüsküler yönetilen Zoletil anda. Zoletil derin anestezi neden olmaktadır. Not: fareler bir yeterli derinlikte anestezi pedal ve palpebral refleksleri test ederek yordamları gerçekleştirmeden önce olduğundan emin olun; Fareler derin anestezi iken derin. Makas ve forseps, yanal için göğüs kemiği başından doğru retrakte göğüs kemiği ile kaburgalar keserek kullanarak göğüs boşluğuna açın.
- Fare ile sol ventrikül yerçekimi perfüzyon sistemi 10-15 mL buz gibi Dulbecco'nın fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) ve daha sonra ile damarlara düzeltmek için tarafsız tampon formalin %10 40-50 mL sıvı. Ne zaman fare güçlü kas kasılmaları sergi ve katı hale fiksasyon belirtilir.
Not: Sabitleme işlemi 10-20 dk gerçekleşir. Sabit organ ve dokulara ayirt veya immünhistokimya analizleri gerçekleştirmek için kullanmak mümkündür. Önemlisi, bu tür sabit dokular gen ekspresyonu ve western Blot analizleri için kullanılamaz. - Kalp aort kalp forseps ile tutup makas ya da bir neşter bıçak ile (Şekil 2A) zarar vermeden kalp mümkün olduğunca yakın olarak aort eksenine dik kesim ayırın. Bir neşter bıçak kemiği sağ ve sol atrium (Şekil 2B) daha düşük puan katıldı düz bir çizgi kesmek için kullanın.
- Kesitli kalbinden (kalp boşluğuna) üst bölümü (OCT) en uygun kesme karışımla doldurun (Şekil 2B-2E). Cryosection plastik kalıp eksenli Dik OCT (Şekil 2F) ile kapak ve dikdörtgen kalıp tabanına yerleştirilmiş aort içinde doku koymak. Tuzak yok hava kabarcığı olmalıdır. Herhangi bir kabarcık varsa, kenarına yerinden deneyin.
- Metal bir plaka kuru buza koyun ve sonra dikkatlice kalıp (Şekil 2 güzerinde) koymak. OKT'yi beyaz olduğunda, kalıp gümüş folyo ile sarın ve –80 ° C'de depolayın
4. kesme bölümleri aortik kökü
- Cryostat makine –20 ° C'ye ayarla Kesme önce katıştırılmış doku yerleştirin ve orada bu sıcaklığa ayarlamak yaklaşık 15 dakika bırakın. Numune tutucu sıcaklık-17 ° C (Şekil 3A) için ayarlayın.
- Cryostat (Şekil 3B)'e blok sıcaklığını equilibrate ve kalıp (Şekil 3 c) dondurulmuş kalp bloğundan çıkar için cryostat makine içinde donmuş kalp bloğu yerleştirin. Donmuş blok blok boyutları numune sahibi (şekil 3D) için daha iyi adapte aşırı OKT kesti.
- Donmuş kalp bloğu ventriküler dışa bakan ile odaklı numune tutucu bağlama (Şekil 3E-3I) ve numune sahibi kafa (Şekil 3J) yönlendirme numune yerleştirin. Kesme blok aortik kökü blade (Şekil 3 K) dikey yapmak için izin vermek için numune tutucu yönünü ayarlayın.
- Blok kesme ve aortik kökü ulaşılana kadar dilimleri atmak (Şekil 3 L-3N). Seri bölümler toplamak ve cam slaytlar (Şekil 3O) koyun. Tüm 3 aort vanalar görününceye kadar aortik kök anatomik profil mikroskop altında izlemek (Şekil 3 P-3Ç).
- Bölüm 10 µm/yağ kırmızı O ve Picro Sirius kırmızı boyama bölümüne ve 6 toplamak için MAC3 µm/bölümüne (Şekil 3R) boyama. Etrafında toplamak üç valfler biri kadar (her kupa için) 6-8 slaytlar kaybolur veya artık sağlam değil.
5. immünhistokimya
Not: tüm boyama adımlar aşağıdaki protokolleri bildirdi Coplin boyama kavanozların içinde gerçekleştirilir.
-
Yağ kırmızı O leke tarafsız yağlar için
- 70 mL bölümlerde % 37 formaldehit musluk suyundaki de 5 dk. yıkama tamir ve aşırı sudan leke.
- 32 mL distile su yağ kırmızı O elde etmek için petrol kırmızı O (isopropanol %0,5) 48 mL seyreltik % 0,3.
- 10 dk. yıkama bölümlerde musluk suyu 10 dk için %0,3 70 mL bölümlerde yağ kırmızı o leke.
- İçin Mayer'ın hematoksilen 1 dk 70 ml leke. Musluk suyu 1 dk. için bölümlerde yıkayın.
- 70 ml bölümlerini % 0.5 Lityum Karbonat bırakın. Musluk suyu 1 dakika yıkayın.
- Işık mikroskobunun monte bir dijital kamera ile bir sulu montaj orta ve yakalama görüntüleri ile bölümleri bağlayın.
-
Picro Sirius kırmızı leke kollajen için
- 10 µm donmuş bölümleri kesme ve slaydın alt monte.
- 70 ml bölümlerini aseton 5 dk, hava kuru ve kısa bir süre içinde distile su durulama için düzelt.
- Bölüm 5 dk. durulama distile su içinde kısa bir süre için % 0,2 phosphomolybdic asitin 70 mL yerleştirin.
- Bölümler 70 mL %0,1 Picro Sirius çözeltisi 90 dk. durulama bir kez 70 mL 0,01 N HCl. atmak çözeltisi ile yerleştirin.
- Yerde 0,01 N HCl 2 dk. durulama yılında kısa bir süre için 70 mL distile su. Hava kuru.
- Yerde kısaca %70 etanol 70 mL.
- Tamamen kuru, yer 70 mL Ajan terpen kökenli açıklığın ve mount poli kullanma bölümlerine (butil metakrilat -co-Metil metakrilat) ışık mikroskobunun monte bir dijital kamera ile montaj orta ve yakalama görüntüleri baz alınarak.
Not: Bu tür ayırt etmek mümkündür Picro Sirius kırmızı boyama avantajlarından biri olduğunu ben (kalın elyaf, sarı-turuncu birefringence) ve tip III (ince lifler, yeşil birefringence) kollajen lif ağları polarize ışık mikroskobu11 tarafından .
-
Mac3 leke makrofaj boyama için
- 6 donmuş µm bölümleri kesme ve slaydın alt monte.
- 70 ml bölümlerini 5 dakika süreyle bırakın 70 ml PBS, 2 dk soğuk aseton düzeltmek.
- Bir pipet kullanarak, % 1 ile kapak bölümlerini Sodyum Lauryl Sülfat (SDS) çözüm ve antijen alımı için (RT) Oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya. PBS 70 mL 5 min için bırakın.
- Bir pipet kullanarak, dilimleri ile %0,3 hidrojen peroksit 5 min için PBS 3 kez 70 ml 20 dk. Yıkama için kapak.
- Avidin-Biotin kompleksleri (ABC) kullanın-HRP teçhizat için aşağıdaki adımları.
- Bir pipet kullanarak, bölümler, oda sıcaklığında 20 dakika Normal tavşan serumda engelleyin. Durulayın değil.
- Leke MAC3 ile (1:300) 90 dakika süreyle dik yıkama 70 ml PBS ile 5 min için 3 kez.
- Orta-biotinylated (1: 200) ile Anti-sıçan IgG RT. durulama, PBS 3 kez 5 min için 45 dk 70 mL ile leke.
- Tavşan IgG ABC bölümlerle RT. durulama, 5 min için PBS 3 kez 30 dakika 30 mL ile kapak.
- 3-amino-9-ethylcarbazole (AEC) bölümlerle 10 dk. için durulama ile 70 mL distile su için 10 kez kapak.
- İçin Mayer'ın hematoksilen 1 dk 70 ml leke. Musluk suyu 1 dk. için bölümlerde yıkayın.
- 70 mL bölümlerde % 0,5 bırakın Lityum Karbonat. Musluk suyu 1 dakika yıkayın.
- Işık mikroskobunun monte bir dijital kamera ile bir sulu montaj orta ve yakalama görüntüleri ile bölümleri bağlayın.
6. görüntü analizi aortik kök bölümlerde aterosklerotik lezyonların
Not: Aortik kök bölümler petrol kırmızı O veya MAC3 veya bir antikor ilgi ile lekeli uygun yazılımı ( Malzemeler tabloiçinde gösterilen) kullanılarak analiz edilebilir. Toplam piksel faiz bileşeni için olumlu boyama genel plaket alan için normalleştirilmiş. Görüntüleri toplanmış ve tedavi kör bir araştırmacı tarafından analiz.
-
Kalibrasyon
- Açık bilgisayar yazılımı ve çözümlenmesi için resimdeki (jpg) seçin.
- Ana sayfa Seç | Oluşturmak | Hızlı kalibrasyon.
- Resim kalibrasyon kadar görüntü ölçek çubuğu boyunca bir çizgi çizerek ayarlayın.
- Kalibrasyon ayarı kaydedin.
-
Görüntü Analizi
- Kaydedilmiş Kur ayarlama Seçenekler menüsünden seçin | Kayma kalibrasyon seçeneği.
- Kalibrasyon seçin | Uygulamak.
- Çokgen aracını seçin menüsünde seçin ve çevre boyunca tüm aterosklerotik lezyonları çizin.
- Sayısı/boyutu seçin | Türleri. Menüden, alanı ve Yüzde alanıekleyin.
- Sayısı/Size menüsünden, select manuel ve yeni bir pencere açılacaktır.
- Bu pencere üzerinde görüntü üzerinde renk seç aracını tıklatın ve HSI modunu seçin.
- Fare imlecini işaretçiyi bir renk aralığı oluşturmak ilgi olumlu piksel noktası.
- Say ' ı tıklatın ve değeri Ölçüm tablo, gözlenen Sumu, işaretçiyi (µm2' de ifade) alanının yüzdesi aterosklerotik lezyonların toplam alanı ile ilgili olarak gösterir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
8-10 hafta içinde Apo- / - fareler, minipumps araç veya aldosteron ile demlemek için implante edildi (Şekil 1E-1I) ve (ayarlanan kalori diyet yağ % 42) aterojenik bir diyet için 4 hafta beslenir. Tedavi sonunda fare euthanized ve PBS ve yukarıda açıklandığı gibi % 10 formalin ile derin. Aortik kök kalp apikal kısmından ayrıldı ve Ekim (Şekil 2) bulunuyordu. Kesit aort köklerin bir cryostat makinesi (Şekil 3) kullanarak farklı boyama için hazırlanmıştır.
Aterosklerotik plak kompozisyon plak geliştirme aşamasında tanımlayan belirli bileşenleri için boyama ile karakterize edilebilir. Kırmızı O petrol boyama lipid içeriğin aterosklerotik lezyonların 5.1 adımda anlatıldığı gibi belirlemek için kullanılır, Picro Sirius kırmızı boyama 5.2 adımda anlatıldığı gibi kolajen içeriği belirlemek için kullanılır ve Mac3 boyama makrofaj içeriği açıklanan ölçmek için istihdam 5.3. adımda. 4 hafta sonra aldosteron ile tedavi, lipid (Şekil 4A-4 C) ve makrofaj içerik (Şekil 4 d-4F) aterosklerotik plaklar aortik kök düzeyinde önemli bir artış fareler görüntülenir, ancak hiçbir farklılıklar vardı kollajen içeriğinde görülmektedir (Şekil 4 g-4i ') ile araç tedavi fareler karşılaştırıldığında. Nitekim, aldosteron atherogenesis bu modelde, damar iltihabı ama değil fibrozis (Şekil 4) inducing hız.
Şekil 1. Hazırlık ve ozmotik minipump araç veya aldosteron implantasyonu. A-B) araç veya aldosteron ozmotik minipumps doldurmak için adımları. C) pompa gövdesi ile akım regülatörü kapatmak için adımlar. D-F) Bir kesi implantasyon pompa için fareyi arkasında oluşturmak için adımları. G-ı) İmplantasyon ozmotik minipump ve kesi dikiş. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2. Kalp ve aortik kökü gömme ve kesit için hazırlanıyor. A-B) kalp kemiği sağ ve sol atrium daha düşük puan katıldı düz bir çizgi kesilir. Kalp apikal parçası aortik kökü aterosklerotik lezyonları kompozisyon ölçmek için işlenir. C) aort kalbin içindeki kökünden. D-E) Ekim ile kalp boşluğuna, doldurma F) bir kalıp disseke kalbinde yönünü önceden (ile kalıp alt yönünü kalp boşluğunda) OCT ile dolu G) OCT ile disseke kalp kalıp buz gibi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3. Aortik kök cryostat microtome kullanarak kesit. A) cryostat önceden serin ve makine ve chuck için doğru sıcaklık ayarlayın. B-D) Katı OCT blok kalıp ayrılır ve kalp çevresinde aşırı OKT bir bıçak kullanarak ortadan kalkar. E-ben) Sıvı Ekim destek kullanarak blok, Ekim sabittir. J-K) Destek chuck eklenen ve ventriküler dışa bakan ile odaklı. L-M) Bölüm disseke kalp tamamen maruz kadar blok. N-O) 10 ve/veya 6 µm kalınlık ayarlamak ve dilimleri cama toplamak. P-Q) Tüm üç vanalar mikroskop altında olmadığını denetleyin. R) sonraki dilimleri toplanır, bir veya daha fazla vanalar artık gözlenen değil kadar gösterildiği gibi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4. Aterosklerotik plak kompozisyon aldosteron - veya araç-tedavi ApoE- / -miktar. A-B) temsilcisi kırmızı petrol O lekeli kesitleri aort kökü 8-10 hafta içinde-eski ApoE- / - fare araç(a)veya aldosteron (B) ile tedavi ve aterojenik bir diyet için 4 hafta beslenir. C) lipid içeriğin miktar pozitif boyama/toplam plak alanının yüzdesi. D-E) Temsilcisi Mac3 kesitleri aort kökü lekeli. F) makrofaj içerik miktar pozitif boyama/toplam plak alanının yüzdesi. G-H) Temsilcisi Picro Sirius kırmızı kesitleri aort kökü lekeli. ben) kolajen içeriğinin miktar pozitif boyama/toplam plak alanının yüzdesi. Değerleri ifade demek gibi ± standart hata demek (SEM; n = 6 her grup için). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ateroskleroz, makrofajlar, T-lenfositleri, endotel hücreleri ve düz kas hücreleri1gibi birden çok hücre tipleri arasındaki etkileşimler içeren büyük ve orta damarları ile ilgili kronik bir enflamatuar hastalığıdır. Fare aterojenik modelleri sınırlamaları rağmen aterosklerotik süreç kanıtlara büyük gövdeli mevcuttur. Bu modeller hızla belirli yaş ve cinsiyet deneysel tabur üreten avantajı var. Fareler de tanımlanmış ve homojen bir genetik arka planı göster.
Aterosklerotik plaklar, gelişimi gözlenen fare modellerinde ateroskleroz için eğilimli kısmen kararsız plak oluşumu4hariç insan denekler gözlemlenen benzer. Plak rüptürü ve sonraki tromboz, miyokard infarktüsü insanlarda, ana nedeni değil fare aterojenik modellerinde görülmektedir. Bizim son gazetelerde aldosteron infüzyonu ikna etmek mümkün olduğunu gösterdi 4 hafta sonra bir kararsız plak fenotip ApoE- / -farelerde beslenen bir HFD10. Aslında, bu tedavi plaket alan, lipid içerik ve aortik kök düzeyinde kollajen içerik tedavi edilmezse fareler10' a göre anlamlı bir fark ile inflamatuar alanı artırmak yapabiliyor. Kan basıncı önemli ölçüde aldosteron tedavi10tarafından değişmiş değil göz önüne alındığında belirtmek gerekirse bu fareler hipertansiyon bağımsız ateroskleroz, artan geliştirme göstermek.
Mevcut makale, OCT kalp dokusunda yanı sıra sıralı adımları, Yani, aortik kök kesit ve plak Analizi katıştırmak için teknik yordam ayrıntılı olarak gösterilmektedir. Parafin için karşılaştırıldığında, OCT bir cryostat microtome ve minimal doku işleme bölümü hazırlık kalınlıkları (1-100 µm) yüksek bir dizi sağlar. Sınırlamalar buz kristalleri oluşumu ile potansiyel olarak etkilenen donmuş doku kalitesi dahil ve hücre altı ayrıntıları değiştirmek ve immunohistological boyama tarafından algılanabilir eserler üretmek. Nitekim, dondurma daha iyi antijen ve antigenicity korumak için düşünülmektedir. Aslında, donmuş doku antijenleri yapısını korumak. Ayrıca, donmuş doku immünhistokimya için işleme toksik ve kanserojen bileşiktir formalin kullanımı önlemek için izin verir.
Aortik kök histolojik işlenmek üzere tanımlamak için nispeten basit bir sitedir. Bu anatomik site farelerde ateroskleroz için eğilimli aterosklerotik lezyonu geliştirme eğitim için bir altın standarttır. Belirli yörenin analiz tarafından elde edilen veri aynı grup veya farklı deneysel grupları ait fareler arasındaki karşılaştırmaları izin. Aslında, aort kökü kesit sırasında bu tüm üç vanalar varlığı ile karakterize belirli bir bölgeye tanımak kolaydır. Belirli bir bölgeye elde etmek için bu kesinlikle özellikle birkaç önemli adımlar gömme ve kesit sırasında dikkat önerilir. Üst kısmındaki kesitli kalp boşluğuna hava kabarcıkları bölümleri bütünlüğünü olumsuz etkileyebilir doku oluşumunu önlemek için OCT ile doldurmak önemlidir. Ayrıca, kesme açısı kesit sırasında artan aort tam olarak dik olması için düzgün üst kesitli kalp doku kalıp alt yüzeyine dik orient gereklidir. Sağlam dilimleri elde etmek için cryostat sıcaklığı-20 ° C'de tam olarak olmalıdır Aslında, bir daha düşük sıcaklık bölümleri kalitesini uzlaşma olabilir (Yani, bıçak parçalamak onları kullanılamaz yapar bölümler).
Üç vanalar göründüğünde, Not, bu doku ile gerçekleştirilecek çözümleme türüne bağlı olarak farklı kalınlıklarda kesmek için önerilir. Kalan slaytlar için farklı stainings kullanılabilir, ancak aslında, bazı slaytlar plak ilerleme, belirlenmesi için kullanılır (i.e., Picro Sirius, Mac3, vs.).
Aterosklerotik lezyonları aldosteron ile tedavi farelerde lipid ve yağ kırmızı (için lipid boyama) O, Mac3 (makrofaj boyama için) (için kollajen boyama) Sirius kırmızı veya diğer belirli antikor kullanımı ile karakterize makrofajlar zengin görünür proteinler ilgi. OCT gömme, parafin katıştırma aksine, lezyonlar lipid içeriğini kaldırmak organik çözücüler kullanımını önler vurgulamak önemlidir. Bu nedenle, lipid yağ kırmızı O ile boyama OCT gömülü bölümlerde mümkün olduğunu ve lipid içeriğin aterosklerotik plaklar tam olarak sayılabilir.
Mevcut el yazması aldosteron infüzyon ateroskleroz ApoE- / - farelerde tanıtmak için değerli bir yöntem olduğunu gösterdi. İn fact, aldosteron infüzyon ApoE- / - farelerde mümkün: 1) molekülleri artan ifade tarafından adezyon ve monosit geçiş aterosklerotik plak erken aşamalarında katılan gösterildiği gibi endotel hücreleri, aktivasyonu artırmak oluşumu12,13; ve 2) lipid ve pro-inflamatuar makrofajlar içerik aortik kök düzeyi10,13artırmak. Bu efektleri aldosteron10hemodinamik etkileri nedeniyle değildir. Sonuç olarak, önerilen iletişim kuralı geçerli bir yöntem oluşturmak ve ateroskleroz farelerde karakterize temsil eder; Bu monitör hastalığın erken dönemlerinde ve terapötik müdahale ve rehabilitasyon Ateroskleroz sonuçları yardımcı olur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu eser İtalyan Sağlık Bakanlığı (Ricerca Corrente, GR-2009-1594563 ve PE-2011-02347070 M.C. için) gelen hibe tarafından desteklenmiştir
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adjusted calories diet (42 % from fat) | Envigo | TD.88137 | atherogenic diet |
| Osmotic minipump with filling tube | Alzet | model 1004 | for continous realase |
| Aldosterone | SIGMA | A9477 | hormone |
| Ethanol | SIGMA | 34852-M | solvent |
| Alchol Preps saturated with 70 % Isopropyl Alcohol | Kendal Webcol | 6818 | Disinfectant |
| Surgery wire (Vicryl 6.0) | Demas | 500004 | surgery |
| 10% Povidone/iodine ointment | Aplicare-Meriden | 52380-0026-1 | Antiseptic |
| Formalin 10% | SIGMA | HT5012 | to fix vascolature |
| Cryomold | Bio-Optica | 07-MP1515 | for embedding |
| O.C.T. Compound | Sakura Finetek | 4583 | for embedding |
| Cryostat | Leica | CM1900 | instrument for sectioning |
| Dulbecco's Phosphat Buffered Saline | Aurogene | AU-L0615-500 | buffer solution |
| Adhesion Slides Polysine | VWR | 631-0107 | microscope glasses |
| Cover Glasses | Bio-Optica | 72015 | cover glasses |
| Formaldehyde 37% | SIGMA | 252549 | solvent |
| Oil Red O solution (0.5 % in isopropanol) | SIGMA | O1391 | staining solution |
| Mayer’s Hematoxylin | SIGMA | MHS32 | staining solution |
| Lithium Carbonate | SIGMA | 62470 | washing buffer |
| Acqueous Mounting Medium | Thermo Scientific | TA-125-AM | mounting solution |
| Acetone | SIGMA | 179124 | solvent |
| Phosphomolybdic acid solution | SIGMA | HT153 | for hystology |
| Direct Red 80 (Picrosirius Red) | SIGMA | 365548 | staining solution |
| Bio Clear (clearing agent of terpene origin) | Bio-Optica | 06-1782D | product for the preparation of histological samples |
| Eukitt Quick Hardening mounting medium (Poly(butyl methacrylate-co-methyl methacrylate) | SIGMA | 3989 | mounting solution |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Fluka | 71725 | powder |
| Hydrogen Peroxide solution (30 %) | SIGMA | H1009 | solution |
| Vectorstain ABC KIT including: anti-rabbit IgG ABC, normal rabbit serum, Secondary-biotinylated Anti-Rat IgG , | Vector Laboratories | PK-6100 | staining solution |
| 3-amino-9-ethylcarbazole | Vector Laboratories | SK-4200 | staining solution |
| Mac3 antibody | BD Biosciences | 553322 | antibody |
| ImagePro Premier 9 | Media Cybernetics | 050910000-2534 | software to analyze images |
References
- Ross, R. Atherosclerosis--an inflammatory disease. New England Journal of Medicine. 340 (2), 115-126 (1999).
- Lafont, A. Basic aspects of plaque vulnerability. Heart. 89 (10), 1262-1267 (2003).
- Getz, G. S., Reardon, C. A. Animal models of atherosclerosis. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 32 (5), 1104-1115 (2012).
- Bentzon, J. F., Falk, E. Atherosclerotic lesions in mouse and man: is it the same disease? Current Opinion in Lipidology. 21 (5), 434-440 (2010).
- Getz, G. S., Reardon, C. A. Do the Apoe-/- and Ldlr-/- Mice Yield the Same Insight on Atherogenesis? Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 36 (9), 1734-1741 (2016).
- Emini Veseli, B., et al. Animal models of atherosclerosis. European Journal of Pharmacology. 816, 3-13 (2017).
- Schwartz, S. M., Galis, Z. S., Rosenfeld, M. E., Falk, E. Plaque rupture in humans and mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 27 (4), 705-713 (2007).
- de Rita, O., Hackam, D. G., Spence, J. D. Effects of aldosterone on human atherosclerosis: plasma aldosterone and progression of carotid plaque. Canadian Journal of Cardiology. 28 (6), 706-711 (2012).
- Ivanes, F., et al. Aldosterone, mortality, and acute ischaemic events in coronary artery disease patients outside the setting of acute myocardial infarction or heart failure. European Heart Journal. 33 (2), 191-202 (2012).
- McGraw, A. P., et al. Aldosterone increases early atherosclerosis and promotes plaque inflammation through a placental growth factor-dependent mechanism. Journal of the American Heart Association. 2 (1), e000018 (2013).
- Rittie, L. Method for Picrosirius Red-Polarization Detection of Collagen Fibers in Tissue Sections. Methods in Molecular Biology. 1627, 395-407 (2017).
- Caprio, M., et al. Functional mineralocorticoid receptors in human vascular endothelial cells regulate intercellular adhesion molecule-1 expression and promote leukocyte adhesion. Circulation Research. 102 (11), 1359-1367 (2008).
- Marzolla, V., et al. Essential role of ICAM-1 in aldosterone-induced atherosclerosis. International Journal of Cardiology. 232, 233-242 (2017).
