Summary
우리는 호르몬의 지속적인 출시를 통해 atherogenic 다이어트 먹이 ApoE-/- 쥐의 대동맥 루트에서 동맥 경화를 유발 하는 프로토콜을 설명 합니다. 또한 플 라크 구성 하는 방법은 설명 합니다.
Abstract
동맥 경화 혈관 내 피에 영향을 미치는 만성 염증 반응 때문 이며 고혈압, dyslipidemia, 당뇨병 등 여러 가지 요인에 의해 추진 된다. 날짜 하려면, 심혈 관 질환의 개발에 대 한 위험 요인으로 호르몬 순환에 대 한 역할을 지 원하는 증거를 있다. 유전자 변형 마우스 모델 생성 동맥 경화로 이어지는 세포질과 분자 과정 연구. 이 원고에서 우리 ApoE-/- 생쥐에서 호르몬의 지속적인 주입의 활용 및 치료 4 주 후 대동맥 루트에서 동맥 경 화성 플 라크를 생성 하는 프로토콜을 설명 합니다. 우리는, 따라서, 정량화 및 대동맥 루트 수준에서 동맥 경 화성 병 변의 특성화 하는 방법을 보여 줍니다. 부가 가치 호르몬 주입의 치료 4 주 후 동맥 경 화성 병 변 풍부한 지질과 염증 세포의 생성으로 표시 됩니다. 우리 플 라크 안에서 지질 및 macrophage 콘텐츠 계량 얼룩 절차 자세히 설명. 특히,이 프로토콜에 우리 심장 심장 조직의 antigenicity을 보존 하 고 관심의 항 원의 검출을 용이 하 게 하기 위해 10 월에 조직 포함을 수행 합니다. 플 라크의 표현 형의 분석 동맥 경화 증 개발의 이상 공부 하 고 반대로 atherogenic 약물의 개발에 대 한 새로운 약리 목표를 식별 하는 유효한 접근 방식을 나타냅니다.
Introduction
동맥 경화는 사망률과 질병 률 세계1의 주요 원인 중 하나입니다. 그것은 혈관 혈액 지질과 동맥 경 화성 플 라크의 형성을 결정 하는 백혈구에 의해 침투는 만성 염증 성 상태에 의해 특징입니다. 대부분의 급성 심장 이벤트 패 파열 때문 thrombotic 이벤트와 연결 됩니다. 플 라크 파열 하는 경향이 "취약" 정의 그리고 프로-염증 성 백혈구, 괴 사 성 코어 얇은 섬유 뚜껑2증가 침투에 의해 특징입니다. 마지막 십 년간에서 임상과 실험적인 연구는 질병의 복잡 한 이상 명백 하 게. 여러 동물 모델 롬3의 유도에 관련 된 분자 메커니즘을 조사 하는 데 사용 됩니다. 현재, 마우스는 종의 차이가 인 간에 비해 그 이상에도 불구 하 고 동맥 경화 연구에 가장 자주 사용 되 종. 특히, 콜레스테롤을 순환 주로 구성 되어 고밀도 지 단백질 (antiatherogenic 속성)을 사용 하 여 마우스 모델에서 인간에서 회람 콜레스테롤은 주로 수송 저밀도 지 단백질 (LDL)로 하는 동안 아마 왜 야생-타입 마우스 자연 경화4를 개발 하지 않습니다 주된 이유를 나타내는. 또한, 야생 타입 마우스 인간 규정식 콜레스테롤4의 50% 정도 흡수 하는 반면 일반적으로 저항 다이어트에서 콜레스테롤을 흡수 하는. 이러한 한계를 극복 하기 위해 몇 가지 유전자 변형된 마우스 모델 생성. Apolipoprotein E-결핍 마우스 (ApoE−/−)와 LDL 수용 체-결핍 마우스 (LDLr−/−) 널리 이용 된다. 높은 콜레스테롤 수치, 높은 지방 다이어트, ApoE−/− 마우스 빠르게 LDLr−/−마우스에 비해 더 많은 플 라크를 개발 하 고 이런 이유로, ApoE−/− 마우스의 사용은 LDLr−/−마우스5,6의 보다 더 광범위 한 ApoE−/− 마우스 동맥 경화 증의 어떤 단계에서 장애를 개발 하 고 마우스 패 불안정 형7을 표시 하지 않습니다 있지만 인간에서 관찰을 비교할 수 있습니다. 일반적으로, ApoE−/− 마우스 저절로 아 테 롬을 개발 하 고이 과정 서 부 다이어트3가속. 동맥 경화 증의 심각도의 경 동맥, 폐, 대 퇴 및 brachiocephalic 동맥 및 대동맥 루트6수준에서 평가할 수 있습니다. 특히, 대동맥 루트는 해 부 사이트를 생쥐에서 동맥 경 화성 병 변을 개발 하는 경향이 나타냅니다. 이러한 이유로, 그것은이 지역에서 동맥 경 화성 플 라크의 형성 평가 하 관행 이다.
몇몇 연구는 호르몬 아 테 롬8,,910의 개발에 연루 나타났습니다. ApoE−/− 쥐 먹이 atherogenic 다이어트 호르몬 주입 대동맥 루트 동맥 경 화성 병 변 염증 및 지질 부유한 패 형성10유도의 개발을 가속 화 합니다.
요약, 우리는 호르몬 주입, atherogenic 다이어트 먹이, ApoE-/- 생쥐에서 심장 조직, 정량화 및 동맥 경 화성 병 변의 특성의 포함을 포함 하는 프로토콜을 설명 합니다. 이 절차는 염증, 지질이 풍부한 동맥 경 화성 플 라크의 효율적인 형성을 촉진 하 고 atherogenesis의 연구에 대 한 귀중 한 모델을 나타냅니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
연구는 건강 관리의 이탈리아 국가 학회 및 사용 위원회, 인증 번호 493/2016-홍보에 의해 승인 되었다 모든 절차는 실험 동물의 사용에 대 한 유럽 공동체 지침 당 실시 했다 (유럽 지침 2010/63/UE).
참고: 차량 (염 분 해결책에 에탄올) 또는 호르몬을 포함 하는 삼 투 minipump의 피하 주입 (240 µ g · 킬로그램-1 · d-1) 8-10 주에-오래 된 남성 쥐 ApoE 유전자에 대 한 결핍. 일반, 8-10 주에-오래 된 남성 ApoE−/− 마우스 무게 약 25-26 g.
1. 호르몬을 분해
- 절대 에타 놀의 1 mL에 호르몬 가루 5 mg을 디졸브.
- 2.27 µ g의 농도 얻기 위해 56.7 µ L (에탄올에 용 해) 호르몬의 생리 식 염 수의 68.3 µ L을 추가 / µ L.이 솔루션 (각 minipump는 최대 125 µ L)의 125 µ L로 전체 삼 투 minipumps 채우기.
- 0.11 µ L/h;의 minipump 흐름 속도 사용 하 여 따라서 2.64 µ L 솔루션의 출시는 모든 24 헤 주고 각 마우스 주위 6 µ g · 28 일 동안 호르몬의 d-1 .
2. 삼 투 펌프 충전 및 주입
참고: 펌프는 두 개의 별도 부분에 제공 됩니다: 펌프 및 흐름 레 귤 레이 터의 본체.
- Minipumps 수술 장갑을 사용 하 여 처리를.
참고: 피부 오일 minipumps의 성능을 방해할 수 있습니다. 다음 단계는 살 균 층 흐름 후드에서 수행 되어야 합니다. - 1 mL 주사기에 충전 튜브 (는 minipumps 함께 제공)를 연결 하 고 호르몬 솔루션 또는 차량을 그립니다.
참고: 주사기 내 공기 펌프에 기포의 형성을 방지 튜브에서 솔루션을 발음 하는 동안 시키는 피하기 위해 중요 하다. - 때까지 더 이상 갈 수 있는 구멍을 통해 충전 튜브는 minipump의 상단에 삽입 (그림 1A-1B). 천천히 채워 펌프 호르몬 또는 차량. 펌프 내부에 액체 레벨 나타내는 어두운 그림자를 확인 합니다. 충전 펌프와 함께이 레벨 증가 시계.
- 액체의 구슬 펌프 몸에서 상승 때 펌프를 작성 중지 합니다.
- 조심 스럽게 충전 튜브를 제거 하 고 minipump (그림 1C)의 몸으로 흐름 레 귤 레이 터를 삽입 합니다. 레 귤 레이 터 펌프 본문에 단단히 장착 되어 있는지 확인 하십시오. 마우스 (못쓰게 절차)에 주입 하기 전에 최대 24 h에 대 한 37 ° C에서 살 균 염 분 해결책을 포함 하는 비 커에 가득된 삼 투 펌프를 둡니다.
- 무 균 상태를 촉진 하는 70% 에탄올으로 소독된 지역에서 수술을 실시 합니다.
- 1-3 방울 0.25 %bupivacaine 절 개 사이트에 적용 하 고 3 %isoflurane 동물을 anesthetize. 공급 가스 및 설정 유량 계는 500-1000 mL/분 장소 동물 유도 챔버에 켜고 상단 인감. 5 %isoflurane 기화 기를 켜고 휴식 때까지 마우스를 모니터링.
- 스위치는 nosecone 흐름 시스템입니다. 실과 nosecone에서 위치에서 동물을 제거 합니다. 2-3 분, 마우스 각 성 하기 시작 합니다. 100-200 mL/min에서 유량 계 및 3 %isoflurane 기화 가스 흐름을 다시 시작 합니다.
- 페달 철수와 종을 반사를 테스트 하 여 절차를 수행 하기 전에 마 취의 적절 한 깊이 확인 합니다. 호흡 및 절차 동안 자극에 응답을 모니터링 하 고 필요에 따라 기화 기 조정.
- 각 안과 연 고를 적용 하 여 밖으로 건조 로부터 보호 합니다.
- 면도기 (그림 1D)를 사용 하 여 외과 사이트에서 머리를 제거 하 여 동물을 준비 합니다. 뒷면에 펌프의 피하 주입에 대 한 일반적인 사이트가입니다.
- 부 직 포 패드 소재 70% 이소프로필 알코올로 포화 외과 사이트를 준비 합니다.
- 깨끗 하 고 전용 공간 (70% 에탄올으로 소독)를 사용 하 고 무 균 드 레이프 덮여. 유리 구슬 소독 기에 계기의 끝을 놓습니다. 멸 균된 장비와 수술을 시작 하 고 aseptically 악기를 처리 합니다.
- 수술가 위를 사용 하 여 만들는 0.8-1 cm 절 개 (약 2 cm 꼬리에 가까운), 같이 숫자 1E 1F. 없는 메 마른 장갑 또는 악기의 팁 수술 전용된 공간 밖에 있는 것을 만져 불 임을 유지 합니다.
- 피부만 하지만 기본 조직 하지를 절단 하는 것을 주의. 한 손으로 사용 하 여 절 개 하 여 집게를. 뒤에서 위쪽으로 (마우스의 오른쪽 또는 왼쪽 측면)에 견 갑 골을 펌프에 대 한 주머니를 만들기 위해 피부를 확산 trocar를 다른 손을 사용 합니다.
- 절 개에 펌프를 삽입 합니다. 부드럽게 펌프를 완전히 밀어 (그림 1 H) 주머니에. 충분 한 피부 가까운 아무 긴장 상처를 무료 또는 필요한 피부의 스트레칭 해야 합니다. 펌프를 삽입 하는 일단 봉합 수술 와이어 (polyglactin 910 봉합 크기 6-0)와 절 개
참고:는 레 귤 레이 터의 머리 마우스 (그림 1G)의 앞쪽으로 향하게 해야 합니다. - (그림 1I) 깨끗 한 면봉으로 국 소 10 %povidone-요오드 연 고를 적용 하 고 지구 온난화 무대에 동물 유지. 그들은 sternal recumbency를 복구할 때까지 무인에 쥐를 떠나 지 마. 수 화 상태를 평가 하 고 필요한 경우 0.9% 식 염 수 솔루션의 0.5 mL을 피하 관리. 그것의 일상적인 주거에 동물을 반환 합니다.
- 설명서에 대 한 제도적 지침 (예를 들어, 수술 및 수술 정보, 절차 및 날짜 업데이트 케이지 카드 수술 양식을 작성) 진통제 (buprenorphine, 0.05 mg/kg) 수술 후 통증을 줄이기 위해 제공 하 고 항생제 (enrofloxacin 85 mg/kg) 수술 후 감염을 피하기 위해.
- 매일 모니터링을 계속 하 고 통증의 흔적에 대 한 검사. 상처 주의 완전히 닫히고 minipump 피하 포켓에 유지 됩니다. 상처 수 있습니다 열고 마우스는 minipump 손실 될 수 있습니다.
3입니다. 심장의 해 부
- 희생, 80-100 mg/kg 피하 투여 하는 Zoletil와 anestethize 쥐의 때. Zoletil 깊은 마 취를 유도합니다. 참고: 마우스 페달과 종을 반사; 테스트 하 여 절차를 수행 하기 전에 마 취의 적절 한 깊이에서 되는지 확인 쥐 취 깊이 동안 끼얹는다 될 것입니다. 흉 강가 위, 집게, 머리 쪽으로 철회 되 고 흉 골과 흉 골을 옆으로 갈비뼈를 절단 하 여 사용 하 여 엽니다.
- 중력 관류 시스템 10-15 mL의 얼음 Dulbecco의 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)와 함께 다음는 맥 관 구조를 해결 하기 위해 중립 버퍼링 된 말린의 10%의 40-50 mL에 의해 좌 심 실을 통해 마우스를 perfuse. 고정 때 쥐 활발 한 근육 수축이 전시 경직 된 되 고 표시 됩니다.
참고: 고정 과정에서에서 일어난 10-20 분. 사용 하는 고정된 장기 및 조직 면역 형광 또는 immunohistochemistry 분석 가능 하다. 중요 한 것은, 이러한 고정된 조직 유전자 발현 및 서쪽 더 럽 히 분석에 사용할 수 없습니다. - 집게와 마음을 대동맥 손상 (그림 2A)을 유발 하지 않고 마음에 최대한 가까이의 축에 수직가 위 또는 메스 블레이드 절단으로 대동맥에서 마음을 구분 합니다. 메스 블레이드를 사용 하 여 왼쪽과 오른쪽 아 트리 움 (그림 2B)의 낮은 포인트를 조인 하는 직선을 따라 transversely 자릅니다.
- 최적의 절단 화합물 (10 월) (심장의 구멍)을 통해 sectioned 심장의 위쪽 부분을 채워 (그림 2D-2E). 넣어 수직 직사각형 형과 oct (그림 2F) 커버의 기지에 배치 하는 대동맥 축 cryosection 플라스틱 금형 내의 조직. 덫을 놓은 아무 공기 거품 이어야 한다. 어떤 거품 있으면 가장자리에 그것을 제거 하려고 합니다.
- 드라이 아이스에 금속 접시를 놓고 신중 하 게 (그림 2G)에 금형을 넣어. OCT 될 때 흰색, 실버 호 일 형을 포장 하 고 –80 ° c.에 저장
4. 절단 부분의 대동맥 루트
- – 20 ° c cryostat 기계 설정 절단 하기 전에 포함 된 조직 놓고 거기 두고 약 15 분이 온도를 조정 합니다. -17 ° c (그림 3A) 견본 홀더 온도 설정 합니다.
- Equilibrate (그림 3B) cryostat의 블록의 온도와 얼어붙은 심장 블록 몰드 (그림 3C)에서 꺼내 cryostat 컴퓨터 내부 얼어붙은 심장 블록을 배치 합니다. 더 나은 견본 홀더 (그림 3D)를 블록 크기에 맞게 고정된 블록에서 초과 10 월을 잘라.
- 심 실 직면 바깥쪽으로 지향 견본 홀더에 얼어붙은 심장 블록 탑재 (그림 3E-3I) 방향을 머리 (그림 3J) 견본에 견본 홀더를 삽입. 대동맥 루트 블레이드 (그림 3 K)에 수직인 수 있도록 블록의 절단을 허용 하도록 견본 홀더의 방향을 조정 합니다.
- 블록을 자르고 대동맥 루트에 도달할 때까지 조각을 삭제 (그림 3 L-3N). 직렬 섹션을 수집 하 고 유리 슬라이드 (그림 3O)에 그들을 배치. 모든 3 대동맥 밸브 나타날 때까지 현미경 대동맥 루트 해 부 프로 파일 모니터링 (그림 3 P-3Q).
- 6에서 10 µ m/Picro 시리우스 레드 얼룩, 기름 빨간 O를 섹션에서 섹션을 수집 µ m/섹션 MAC3 (그림 3R) 얼룩. 주위 수집 3 개의 밸브 중 하나까지 (각 심장)에 대 한 6-8 슬라이드 사라집니다 또는 더 이상 그대로 하지 않습니다.
5입니다. Immunohistochemistry
참고: 모든 착 단계는 다음 프로토콜에 보고 유리 Coplin 얼룩 항아리에 수행 됩니다.
-
중성 지방에 대 한 기름 빨간 O 얼룩
- 수도 물에 잘 씻어 5 분에 대 한 37% 포름알데히드의 70 mL에 섹션을 수정 하 고 과잉의 물 떨어져 되 리.
- 기름 빨간 O를 증류수의 32 ml에서 기름 빨간 O (소 프로 파 놀에 0.5%)의 48 mL를 희석 0.3%.
- 10 분 워시 섹션에서 10 분 동안 수돗물에 대 한 섹션 70 ml에서 기름 빨간 O의 0.3%를 얼룩.
- 메이어의 되며의 70 mL에 1 분 동안 얼룩. 섹션 1 분 동안 수돗물에 씻어.
- 70 mL에 0.5% 리튬 탄산염의 섹션을 젖어. 1 분 동안 수돗물에 씻어.
- 가벼운 현미경에 장착 된 디지털 카메라를 사용 하 여 수성 장착 매체 및 캡처 이미지 섹션을 탑재 합니다.
-
콜라겐에 대 한 Picro 시리우스 레드 얼룩
- 10 µ m 냉동 섹션을 잘라내어 슬라이드의 하단에 탑재.
- 5 분, 건조 공기를 증류수에 짧게 씻어 아세톤의 70 mL에 섹션을 수정 합니다.
- 5 분 증류수에 짧게 씻어 위해 0.2 %phosphomolybdic 산의 70 mL에 섹션을 배치 합니다.
- 0.01 N HCl. 폐기 솔루션의 70 mL와 함께 90 분 린스 한 번에 대 한 0.1 %Picro 시리우스 솔루션의 70 mL에 섹션을 배치 합니다.
- 0.01 N HCl 2 분 린스 짧게에 대 한의 70 mL에서 증류수. 건조 공기.
- 70% 에탄올 70 mL에 간단히 장소.
- 때 완전히 건조 terpene 근원의 비운의 70 mL에 놓고 폴 리를 사용 하 여 섹션을 탑재 (부 틸 메타 크 릴 산-co-메타 크 릴 산 메 틸) 가벼운 현미경에 장착 된 디지털 카메라를 사용 하 여 장착 매체 및 캡처 이미지를 기반으로.
참고: Picro 시리우스 레드 얼룩의 장점 중 하나는 종류를 구별할 수 있다는 (두꺼운 섬유, 노란색 birefringence) 및 편광된 빛 현미경11 여 유형 III (얇은 섬유, 녹색 복굴절) 콜라겐 섬유 네트워크 .
-
Mac3 대 식 세포 얼룩 얼룩
- 6 µ m 냉동 섹션을 잘라내어 슬라이드의 하단에 탑재.
- 5 분 담가 70 ml에서 PBS 2 분에 대 한 차가운 아세톤의 70 mL에 섹션을 수정 합니다.
- 피 펫을 사용 하 여, 커버 섹션 1% 나트륨 라우릴의 황산 (SDS) 솔루션 하 고 실내 온도 (RT) 항 원 검색에 5 분 동안 품 어. 5 분에 대 한 PBS의 70 mL에 담가.
- 피 펫을 사용 하 여, PBS 3 시간 5 분의 70 ml에서 20 분 세척에 0.3%의 과산화 수소와 함께 조각 커버.
- Avidin 비타민 b 복합체 복합물 (ABC)를 사용 하 여-HRP 키트에 대 한 다음 단계.
- 피 펫을 사용 하 여, 20 분 동안 실 온에서 정상 토끼 혈 청에서 차단 합니다. 씻어 하지 마십시오.
- MAC3와 얼룩 (1:300) 90 분 실시간 세척에서 70 ml에서 PBS의 5 분 동안 3 번에 대 한.
- 5 분에 대 한 PBS 3 번 70 mL와 실시간 린스에서 45 분에 대 한 보조 biotinylated 반대로 쥐 IgG (1: 200)으로 얼룩.
- 5 분에 대 한 PBS 3 번 30 mL와 실시간 린스에서 30 분 토끼 IgG ABC로 섹션을 커버.
- 10 시간 동안 증류수 70 mL와 함께 10 분 린스에 대 한 3-아미노-9-ethylcarbazole (AEC)와 섹션을 커버.
- 메이어의 되며의 70 mL에 1 분 동안 얼룩. 섹션 1 분 동안 수돗물에 씻어.
- 섹션 70 mL에 0.5%의 담가 리튬 탄산염. 1 분 동안 수돗물에 씻어.
- 가벼운 현미경에 장착 된 디지털 카메라를 사용 하 여 수성 장착 매체 및 캡처 이미지 섹션을 탑재 합니다.
6. 대동맥 루트 섹션에 동맥 경 화성 병 변 이미지 분석
참고: 대동맥 루트 섹션 기름 빨간 O 또는 MAC3 또는 관심의 항 체로 얼룩진 분석할 수 있습니다 ( 테이블의 자료에 표시) 하는 적절 한 소프트웨어를 사용 하 여. 총 픽셀의 구성 요소에 대 한 긍정적인 얼룩 전체 플 라크 영역으로 정규화 됩니다. 이미지 수집 하 고 눈 멀게 하는 치료 조사 하 여 분석 했다.
-
교정
- 오픈 소프트웨어 고 분석 (jpg)에서 이미지를 선택 합니다.
- 홈 선택 | 만들기 | 빠른 교정.
- 이미지의 눈금 막대를 따라 선을 그려 이미지의 보정을 설정 합니다.
- 교정의 설정을 저장 합니다.
-
이미지 분석
- 옵션 메뉴에서 선택 하는 저장 된 설정 교정 | 공간 교정 옵션입니다.
- 보정 을 선택 | 적용됩니다.
- 선택 메뉴에서 다각형 도구를 선택 하 고 모든 동맥 경 화성 병 변 따라 경계를 그립니다.
- 개수/크기 선택 | 유형. 메뉴에서 영역과 % 영역 을 추가 합니다.
- 개수/크기 메뉴에서 선택 설명서 및 새 창이 열립니다.
- 이 창 에서 이미지에 색상 선택 도구를 클릭 하 고 HSI 모드를 선택 합니다.
- 색상의 범위를 생성 하는 관심의 마커의 긍정적인 픽셀에 마우스 커서를 가리킵니다.
- 에 클릭 하 고 값 합계, 측정 테이블에 동맥 경 화성 병 변의 총 면적 기준 마커 (또한 µ m2로 표현)의 면적의 비율을 나타냅니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
8-10 주 apo는-/- 생쥐, minipumps 차량 또는 호르몬에 이식 되었다 (그림 1E-1I) 4 주 (조정된 칼로리 다이어트 지방에서 42%)는 atherogenic 다이어트를 먹이. 치료의 끝에, 마우스는 안락사 되었고 PBS와 10% 포 르 말린 위에서 설명한 대로 끼얹는다. 대동맥 루트는 심장의 꼭대기 부분에서 분리 되었다 고 OCT (그림 2)에 포함 된. 대동맥 뿌리의 횡단면 cryostat 기계 (그림 3)를 사용 하 여 다른 얼룩에 대 한 준비가 되어 있었다.
동맥 경 화성 플 라크 구성 플 라크 발달의 단계를 정의 하는 특정 구성 요소에 대 한 얼룩 통해 특징 수 있습니다. 5.1 단계에서 설명한 대로 동맥 경 화성 병 변의 지질 콘텐츠를 결정 하는 데 사용은 기름 빨간 O 얼룩, 5.2, 단계에서 설명한 대로 콜라겐 콘텐츠를 결정 하는 데 사용은 Picro 시리우스 붉은 얼룩이 고 Mac3 얼룩 설명 macrophage 콘텐츠를 측정 하 5.3 단계. 호르몬 치료 4 주 후 쥐 지질 (그림 4A-4 C)와 대 식 세포 내용 (그림 4D-4 층) 대동맥 루트 수준에서 동맥 경 화성 플 라크에 상당한 증가 표시 하지만 차이가 있었다 콜라겐 콘텐츠에서 관찰 (그림 4G-4I) 차량으로 치료 하는 쥐에 비해. 실제로, 호르몬 유도 혈관 염증만 하지 섬유 증 (그림 4)이이 모델에서 atherogenesis 가속.
그림 1입니다. 준비와 삼 투 minipump 차량 또는 호르몬의 주입. A-B) 차량 또는 호르몬 삼투성 minipumps 작성 단계. C) 단계 흐름 레 귤 레이 터와 펌프의 시체를 닫습니다. D-F) 마우스의 뒷면에 펌프의 주입에 대 한 절 개를 만드는 단계. G-나) 삼 투 minipump 고의 절 개 봉합 이식 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2입니다. 심장 및 대동맥 루트를 준비 하 고 포함 하 고 단면에 대 한. A-B) 심장 transversely 왼쪽과 오른쪽 아 트리 움의 낮은 포인트를 조인 하는 직선을 따라 절단 됩니다. 심장의 꼭대기 부분 대동맥 루트에서 동맥 경 화성 병 변 구성 척도를 처리 됩니다. C) 심장 내부에서 대동맥 루트. D E) 10 월을 가진 심장 구멍의 작성 F) 형에서 해 부 심장의 방향을 미리 가득 oct (금형의 아래쪽 방향으로 심장 구멍) G) 10 월와 해 부 심장의 금형에 얼어. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3입니다. 대동맥 루트 cryostat 톰을 사용 하 여의 단면. A) 미리는 cryostat 냉각 하 고 기계 및 척에 대 한 적당 한 온도 설정. B D) 솔리드 10 월 블록 형에서 분리 하 고 심장 주위 초과 10 월 블레이드를 사용 하 여 제거 됩니다. E-나) 10 월의 블록, 지원에 액체 OCT를 사용 하 여 고정 됩니다. J K) 지원 물림 쇠에 삽입 하 고 심 실 직면 바깥쪽으로 지향. L M) 해 부 심장 완전히 노출 될 때까지 블록 섹션. N O) 10 / 6 μ m 두께 설정 하 고 유리에는 슬라이스를 수집 합니다. P-Q) 모든 3 개의 밸브는 현미경의 존재를 확인 합니다. R) 같이, 될 때까지 하나 이상의 밸브 더 이상 나타나지 않으면 후속 분할 수집 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4입니다. 동맥 경 화성 플 라크 구성에 호르몬 또는 차량-대우 ApoE-/-부 량이 고 A-B) 대표 레드 오일 O 8-10 주에 대동맥 뿌리의 횡단면을 스테인드-오래 된 ApoE-/- 생쥐 차량 (A) 또는 (B) 호르몬 치료와 4 주 동안 atherogenic 다이어트를 먹이. C) 긍정적인 얼룩/총 패 영역의 백분율로 지질 콘텐츠의 정량화. D E) 대표 Mac3 스테인드 대동맥 뿌리의 횡단면. F) 의 긍정적인 얼룩/총 패 영역 비율으로 macrophage 콘텐츠의 정량화. G H) 대표 Picro 시리우스 레드 스테인드 대동맥 뿌리의 횡단면. 나) 의 긍정적인 얼룩/총 패 영역 비율으로 콜라겐 콘텐츠의 정량화. 값은 ± 표준 오차 의미 의미 표시 (SEM, n = 6 각 그룹에 대 한). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
동맥 경화 증 여러 세포 유형, 대 식 세포, T 세포, 내 피 세포 및 평활 근 세포1등 간의 상호 작용을 포함 하는 대형 및 중형 배와 관련 된 만성 염증 성 질환 이다. Murine atherogenic 모델의 한계에도 불구 하 고 동맥 경 화성 프로세스에 대 한 증거의 큰 몸은 사용할 수 있는. 이러한 모델 특정 나이 및 성별 실험 동료를 빠르게 생성의 이점이 있다. 마우스도 정의 하 고 균질 유전 배경을 표시 됩니다.
동맥 경 화성 플 라크의 개발 마우스 모델에서 동맥 경화, 하는 경향이 관찰 부분적으로 불안정 플 라크 형성4제외한 인체에서 관찰을 닮았다. 플 라크 파열과 후속 혈전 증, 인간, 심근 경색의 주요 원인은 murine atherogenic 모델 관찰 이다. 우리의 최근 논문에서 우리는 호르몬의 주입은 유도, 수 보였다 4 주 후, ApoE-/-생쥐에서 불안정 플 라크 형 HFD10먹이. 사실,이 치료는 플 라크 지역, 지질 콘텐츠 및 콜라겐 콘텐츠 치료 쥐10에 비해 상당한 차이와 대동맥 루트 수준에서 선 동적인 영역을 증가 수 있습니다. 메모의 이러한 마우스는 혈압 크게 변경 호르몬 치료10독립적인 고혈압 동맥 경화 증의 증가 개발을 보여줍니다.
현재 원고, 우리 상세히에서 포함 10 월에 심장 조직으로 일련의 단계, 즉, 대동맥 루트 단면화 및 상 패 분석 기술 절차를 설명 합니다. 파라핀에 비해, 10 월 cryostat 톰와 최소한의 조직 처리 섹션 준비를 두께 (1-100 µ m)의 높은 범위를 수 있습니다. 제한 냉동된 조직, 잠재적으로 얼음 결정의 형성에 의해 영향을의 품질을 포함 subcellular 세부 정보를 변경 하 고 immunohistological 얼룩에 의해 감지 아티팩트를 생성 수 있습니다. 실제로, cryopreservation는 항 원 및 antigenicity을 유지 더 나은 생각. 사실, 냉동된 조직 항 원의 구조를 유지합니다. 또한, 냉동된 조직 immunohistochemistry 처리 포 르 말린, 독성 및 발암 성 화합물의 사용을 피하기 위해 수 있습니다.
대동맥 루트는 비교적 조직학 처리용 식별 하는 사이트입니다. 이 해 부 사이트는 동맥 경화 경향이 생쥐에서 동맥 경 화성 병 변 개발 공부 골드 표준입니다. 이 특정 영역의 분석 하 여 얻은 데이터 쥐 같은 그룹 또는 다른 실험적인 그룹에 속하는 사이 비교를 허용 한다. 사실, 대동맥 루트의 단면, 동안 그것은 쉽게 모든 3 밸브의 존재에 의해 특징 특정 지역 인식. 같은 특정 영역을 얻으려면, 그것은 엄격 하 게 포함 하 고 구분 하는 동안 몇 가지 중요 한 단계에 특히 주의를 권장. 섹션의 무결성을 손상 시킬 수 있는 조직에 기포의 형성을 피하기 위해 10 월을 sectioned 심장의 윗부분의 구멍을 채우기 위해 중요 하다. 또한, 되도록 절단 각도 오름차순 대동맥에 정확 하 게 수직 단면 하는 동안, 그것은 제대로 위 sectioned 심장 조직 형의 하단 표면에 수직인 방향을 지정 하는 데 필요한. 그대로 슬라이스를 얻기 위하여는 cryostat의 온도-20 ° c.에 정확 하 게 이어야 한다 사실, 낮은 온도 섹션의 품질을 손상 시킬 수 있는 (즉, 잎 그들을 사용할 수 없게 만드는 섹션을 무너질 수).
메모의 3 개의 밸브 나타나면이 좋습니다 잘라 수행 됩니다 분석의 유형에 따라 다른 두께와 조직. 사실, 일부 슬라이드 사용 됩니다 패 진행의 결정에 대 한 반면 나머지 슬라이드는 다른 stainings에 대 한 사용할 수 (즉., Picro 시리우스, Mac3, 등.).
호르몬으로 치료 하는 생쥐에서 동맥 경 화성 병 변 표시 풍부한 지질 및 대 식 세포 (대 한 지질 얼룩) 기름 빨간 O, (대 식 세포는 얼룩)에 대 한 Mac3, 시리우스 빨간색 (는 얼룩 콜라겐의), 또는 다른 특정 항 체에 대 한 사용에 의해 특징 관심의 단백질입니다. 그것은 그는 장애의 지질 콘텐츠를 제거 하는 유기 용 매를 사용 하 여 방지 10 월 파라핀 포함 달리 포함을 강조 하는 것이 중요. 따라서, 기름 빨간 O와 얼룩 지질 가능 10 월 임베디드 섹션에서 이며 동맥 경 화성 플 라크의 지질 내용을 정확 하 게 측정할 수 있습니다.
현재 원고에 우리는 호르몬 주입 ApoE-/- 생쥐에서 동맥 경화를 촉진 하는 중요 한 메서드는 다는 것을 보였다. In fact, ApoE-/- 생쥐에서 호르몬 주입 수 있다: 1)과 같이 분자의 증가 식으로 접착 및 monocytes의 동맥 경 화성 플 라크의 초기 단계에서 마이그레이션에 관련 된 내 피 세포의 활성화를 증가 형성12,13; 그리고 2) 지질과 대동맥 루트 레벨10,13프로-염증 성 세포 콘텐츠 증가. 이러한 효과 호르몬10의 hemodynamic 효과 인해 되지 않습니다. 결론적으로, 제안 된 프로토콜이 나타냅니다 생성 및 마우스; 동맥 경화 특성에 유효한 방법을 이 질병의 초기 단계를 모니터와 치료 개입 및 동맥 경화에 재활의 결과 도울 수 있었다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품은 이탈리아의 보건 (검색 전류 GR-2009-1594563, 엠씨에 PE-2011-02347070)에서 교부 금에 의해 지원 되었다
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adjusted calories diet (42 % from fat) | Envigo | TD.88137 | atherogenic diet |
| Osmotic minipump with filling tube | Alzet | model 1004 | for continous realase |
| Aldosterone | SIGMA | A9477 | hormone |
| Ethanol | SIGMA | 34852-M | solvent |
| Alchol Preps saturated with 70 % Isopropyl Alcohol | Kendal Webcol | 6818 | Disinfectant |
| Surgery wire (Vicryl 6.0) | Demas | 500004 | surgery |
| 10% Povidone/iodine ointment | Aplicare-Meriden | 52380-0026-1 | Antiseptic |
| Formalin 10% | SIGMA | HT5012 | to fix vascolature |
| Cryomold | Bio-Optica | 07-MP1515 | for embedding |
| O.C.T. Compound | Sakura Finetek | 4583 | for embedding |
| Cryostat | Leica | CM1900 | instrument for sectioning |
| Dulbecco's Phosphat Buffered Saline | Aurogene | AU-L0615-500 | buffer solution |
| Adhesion Slides Polysine | VWR | 631-0107 | microscope glasses |
| Cover Glasses | Bio-Optica | 72015 | cover glasses |
| Formaldehyde 37% | SIGMA | 252549 | solvent |
| Oil Red O solution (0.5 % in isopropanol) | SIGMA | O1391 | staining solution |
| Mayer’s Hematoxylin | SIGMA | MHS32 | staining solution |
| Lithium Carbonate | SIGMA | 62470 | washing buffer |
| Acqueous Mounting Medium | Thermo Scientific | TA-125-AM | mounting solution |
| Acetone | SIGMA | 179124 | solvent |
| Phosphomolybdic acid solution | SIGMA | HT153 | for hystology |
| Direct Red 80 (Picrosirius Red) | SIGMA | 365548 | staining solution |
| Bio Clear (clearing agent of terpene origin) | Bio-Optica | 06-1782D | product for the preparation of histological samples |
| Eukitt Quick Hardening mounting medium (Poly(butyl methacrylate-co-methyl methacrylate) | SIGMA | 3989 | mounting solution |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Fluka | 71725 | powder |
| Hydrogen Peroxide solution (30 %) | SIGMA | H1009 | solution |
| Vectorstain ABC KIT including: anti-rabbit IgG ABC, normal rabbit serum, Secondary-biotinylated Anti-Rat IgG , | Vector Laboratories | PK-6100 | staining solution |
| 3-amino-9-ethylcarbazole | Vector Laboratories | SK-4200 | staining solution |
| Mac3 antibody | BD Biosciences | 553322 | antibody |
| ImagePro Premier 9 | Media Cybernetics | 050910000-2534 | software to analyze images |
References
- Ross, R. Atherosclerosis--an inflammatory disease. New England Journal of Medicine. 340 (2), 115-126 (1999).
- Lafont, A. Basic aspects of plaque vulnerability. Heart. 89 (10), 1262-1267 (2003).
- Getz, G. S., Reardon, C. A. Animal models of atherosclerosis. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 32 (5), 1104-1115 (2012).
- Bentzon, J. F., Falk, E. Atherosclerotic lesions in mouse and man: is it the same disease? Current Opinion in Lipidology. 21 (5), 434-440 (2010).
- Getz, G. S., Reardon, C. A. Do the Apoe-/- and Ldlr-/- Mice Yield the Same Insight on Atherogenesis? Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 36 (9), 1734-1741 (2016).
- Emini Veseli, B., et al. Animal models of atherosclerosis. European Journal of Pharmacology. 816, 3-13 (2017).
- Schwartz, S. M., Galis, Z. S., Rosenfeld, M. E., Falk, E. Plaque rupture in humans and mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 27 (4), 705-713 (2007).
- de Rita, O., Hackam, D. G., Spence, J. D. Effects of aldosterone on human atherosclerosis: plasma aldosterone and progression of carotid plaque. Canadian Journal of Cardiology. 28 (6), 706-711 (2012).
- Ivanes, F., et al. Aldosterone, mortality, and acute ischaemic events in coronary artery disease patients outside the setting of acute myocardial infarction or heart failure. European Heart Journal. 33 (2), 191-202 (2012).
- McGraw, A. P., et al. Aldosterone increases early atherosclerosis and promotes plaque inflammation through a placental growth factor-dependent mechanism. Journal of the American Heart Association. 2 (1), e000018 (2013).
- Rittie, L. Method for Picrosirius Red-Polarization Detection of Collagen Fibers in Tissue Sections. Methods in Molecular Biology. 1627, 395-407 (2017).
- Caprio, M., et al. Functional mineralocorticoid receptors in human vascular endothelial cells regulate intercellular adhesion molecule-1 expression and promote leukocyte adhesion. Circulation Research. 102 (11), 1359-1367 (2008).
- Marzolla, V., et al. Essential role of ICAM-1 in aldosterone-induced atherosclerosis. International Journal of Cardiology. 232, 233-242 (2017).
