Summary
Les auteurs décrivent un protocole visant à induire l’athérosclérose à la racine aortique de l’ApoE- / - souris nourries avec un régime athérogène, grâce à un rejet constant de l’aldostérone. Méthodes pour caractériser la composition de la plaque sont également décrites.
Abstract
L’athérosclérose est due à une réaction inflammatoire chronique affectant l’endothélium vasculaire et est favorisée par plusieurs facteurs tels que l’hypertension, la dyslipidémie et diabète. A ce jour, il y a preuve à l’appui d’un rôle pour l’aldostérone en circulation comme un facteur de risque pour le développement des maladies cardiovasculaires. Modèles de souris transgéniques ont été générés pour étudier les processus cellulaires et moléculaires, conduisant à l’athérosclérose. Dans ce manuscrit, les auteurs décrivent un protocole qui profite d’une perfusion continue de l’aldostérone dans ApoE- / - souris et génère des plaques d’athérome dans la racine aortique après 4 semaines de traitement. Nous avons, par conséquent, illustrent une méthode pour la quantification et la caractérisation des lésions athéroscléreuses au niveau de la racine aortique. La valeur ajoutée de la perfusion d’aldostérone est représentée par la génération des lésions athéroscléreuses riches en lipides et en cellules inflammatoires après 4 semaines de traitement. Nous décrivons en détail les méthodes de coloration afin de quantifier la teneur en lipides et macrophages au sein de la plaque. Notamment, dans ce protocole, nous réalisons le coeur tissu-incorporation en octobre afin de préserver l’antigénicité du tissu cardiaque et faciliter la détection des antigènes d’intérêt. Analyse du phénotype plaque représente une approche valide d’étudier la physiopathologie du développement de l’athérosclérose et d’identifier de nouvelles cibles pharmacologiques pour le développement de médicaments anti-athérogènes.
Introduction
L’athérosclérose est l’une des principales causes de mortalité et morbidité dans le monde1. Elle est caractérisée par un état inflammatoire chronique où les vaisseaux sanguins sont infiltrés par les lipides et les leucocytes qui déterminent la formation des plaques d’athérosclérose. La majorité des événements cardiaques aigus est associée à des événements thrombotiques en raison de la rupture de la plaque. Sujettes à la rupture des plaques sont définis « vulnérables » et sont caractérisées par l’infiltration accrue des leucocytes pro-inflammatoires, un noyau nécrotique et un couvercle fibreux fin2. Au cours des dernières décennies, les études cliniques et expérimentales ont clarifié la physiopathologie complexe de la maladie. Plusieurs modèles animaux sont utilisées pour étudier les mécanismes moléculaires impliqués dans l’induction de l’athérosclérose,3. La souris est actuellement les espèces les plus fréquemment utilisées pour étudier l’athérosclérose malgré quelques différences propres à chaque espèce existant dans sa physiopathologie en comparaison avec les humains. En particulier, cholestérol en circulation se compose principalement de lipoprotéines de haute densité (avec des propriétés antiathérogènes) dans des modèles murins, tandis que chez les humains en circulation cholestérol est principalement transporté comme les lipoprotéines de basse densité (LDL), probablement ce qui représente la principale raison pourquoi les souris de type sauvage ne développent pas d’athérosclérose spontanée4. En outre, souris de type sauvage sont généralement résistantes à l’absorption de cholestérol provenant de l’alimentation, alors que les humains absorbent environ 50 % de cholestérol alimentaire4. Pour surmonter ces limites, plusieurs modèles de souris génétiquement modifiées ont été générés. L’apolipoprotéine E-deficient souris (ApoE−/−) et LDL récepteur – carence souris (LDLr−/−) sont largement utilisés. Un régime riche en graisses riche en cholestérol, ApoE−/− souris développent plaque plus rapidement par rapport aux souris−−/LDLr, et pour cette raison, l’utilisation desouris ApoE−/ est plus répandu que celui de LDLr−/−souris5,6. Les souris ApoE− −/développent des lésions à un stade quelconque de l’athérosclérose et sont comparables à celles observées chez les humains, bien que les plaques de souris ne montrent pas un phénotype instable7. En général, ApoE−/− souris développent spontanément l’athérosclérose et ce processus est accéléré par une alimentation occidentale3. La sévérité de l’athérosclérose peut être évaluée au niveau de la carotide, pneumologie, fémorale et artère brachiocéphalique et la racine aortique6. En particulier, la racine aortique représente un site anatomique enclin à développer des lésions athéroscléreuses chez la souris. Pour cette raison, il est pratique courante d’évaluer la formation de plaques d’athérome dans cette région.
Plusieurs études ont montré que l’aldostérone est impliquée dans le développement de l’athérosclérose8,9,10. Perfusion d’aldostérone dans ApoE−/− souris nourries avec un régime athérogène accélère le développement des lésions athéroscléreuses racine aortique induisant la formation de plaque enflammée et riches en lipides10.
En résumé, les auteurs décrivent un protocole dont la perfusion d’aldostérone, diète athérogène alimentation, incorporant des tissus cardiaques, quantification et caractérisation des lésions athéroscléreuses dans ApoE- / - souris. Cette procédure favorise une formation efficace des plaques d’athérome enflammées, riche en lipides et représente un modèle précieux pour l’étude de l’athérogenèse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
L’étude a été approuvée par l’Italian National Institutes of Health Care et comités d’utilisation, autorisation numéro 493/2016-PR. Toutes les procédures ont été menées par les lignes directrices de la Communauté européenne pour l’utilisation des animaux d’expérimentation (Directive européenne 2010/63/UE).
Remarque : L’implantation sous-cutanée de Minipompe osmotique contenant du véhicule (éthanol en solution saline) ou l’aldostérone (240 µg · kg-1 · d-1) en 8-10 semaines-vieux mâles souris déficientes pour le gène ApoE . En général, 8-10 semaines-vieux−/− ApoE des souris mâles pèsent environ 25-26 g.
1. dissoudre aldostérone
- Dissoudre 5 mg de poudre de l’aldostérone dans 1 mL d’éthanol absolu.
- Ajouter 56,7 µL d’aldostérone (dissous dans l’éthanol) à 68,3 µL d’une solution saline afin d’obtenir une concentration de 2,27 µg / µL. Remplissez l’ensemble minipompes osmotiques complètement avec 125 µL de cette solution (capacité maximale de chaque Minipompe est 125 µL).
- Utiliser un débit Minipompe de 0,11 µL/h ; par conséquent 2,64 µL de la solution est libéré chaque 24 h. donner chacun la souris autour de 6 µg · d-1 de l’aldostérone pendant 28 jours.
2. implantation et remplissage de la pompe osmotique
Remarque : Les pompes sont fournies en deux parties distinctes : le corps de la pompe et le régulateur de débit.
- Remplir et gérez les minipompes à l’aide de gants chirurgicaux.
Remarque : Les huiles pour la peau peuvent interférer avec la performance des minipompes. Les étapes suivantes doivent être effectuées sous une hotte à flux laminaire stérile. - Fixer le tube de remplissage (fourni avec le minipompes) à une seringue de 1 mL et établit par la solution de l’aldostérone ou le véhicule.
Remarque : Il est important de ne pas laisser d’air à l’intérieur de la seringue lors de l’aspiration des solutions du tube pour éviter la formation de bulles d’air dans la pompe. - Insérer le tube de remplissage dans le trou en haut de la Minipompe jusqu'à ce qu’il peut pas aller plus loin (Figure 1 a-1 b). Lentement, remplir la pompe avec l’aldostérone ou le véhicule. Remarquez l’ombre à l’intérieur de la pompe qui indique le niveau du liquide. Regardez cette hausse niveau ainsi que la pompe de remplissage.
- Arrêter la pompe de remplissage lorsqu’une perle de liquide déborde le corps de la pompe.
- Avec précaution, retirez le tube de remplissage et insérez le régulateur de débit dans le corps de la minipompe (Figure 1). Assurez-vous que le régulateur est assis solidement contre le corps de la pompe. Laisser les pompes osmotiques remplis dans un bécher contenant une solution saline stérile à 37 ° C pendant 24 h avant l’implantation chez la souris (procédure d’amorçage).
- Procéder à une chirurgie dans une zone désinfectée avec de l’éthanol 70 % qui favorise l’asepsie.
- Appliquez 1 à 3 gouttes au site d’incision de bupivacaïne des 0,25 % et anesthésier l’animal à l’isoflurane 3 %. Allumez le gaz d’alimentation et affectez-lui le débitmètre 500-1000 mL/min. Place l’animal dans la chambre de l’induction et sceller la partie supérieure. Allumez le vaporisateur à 5 % isoflurane et contrôler la souris jusqu'à ce que couché.
- Changer le système pour s’écouler vers la pointe. Retirer l’animal de la chambre et la position de l’ogive. En 2 ou 3 minutes, la souris commence à s’éveiller. Redémarrez le débit de gaz avec le débitmètre à 100-200 mL/min et le vaporisateur à 3 % isoflurane.
- Assurer une profondeur adéquate de l’anesthésie avant de procéder en testant les pédale retrait et réflexes palpébrales. Surveiller la respiration et la réponse à la stimulation au cours de la procédure et réglez vaporisateur si nécessaire.
- Protéger la cornée ne se dessèchent pas en appliquant une pommade ophtalmique.
- Préparer l’animal par l’épilation sur le site chirurgical à l’aide d’un rasoir (Figure 1). Le site habituel pour l’implantation sous-cutanée des pompes est sur le dos.
- Préparer le site chirurgical avec matériel non-tissé pad saturé d’alcool isopropylique à 70 %.
- Utiliser un espace propre et dédié (désinfecté avec l’éthanol à 70 %) et recouvert d’un drap stérile. Placez l’extrémité des instruments dans un stérilisateur de perle de verre. Commencer la chirurgie avec des instruments stérilisés et manipuler les instruments aseptiquement.
- Utiliser des ciseaux chirurgicaux pour faire un 0,8-1 incision cm (environ 2 cm près de la queue), comme le montre Figures 1E-1F. Maintenir la stérilité de ne pas toucher quoi que ce soit en dehors de l’espace dédié chirurgicale avec des gants stériles ou des conseils des instruments.
- Prenez soin de couper seulement la peau mais pas les tissus sous-jacents. Utilisez une main pour tenir la pince pour ouvrir l’incision. Utilisez l’autre main pour tenir le trocart pour répandre la peau afin de créer une poche pour la pompe de l’arrière vers le haut de l’omoplate (sur le côté droit ou gauche de la souris).
- Insérez la pompe dans l’incision. Poussez doucement la pompe complètement dans la poche (Figure 1 H). Il devrait y avoir assez de peau libre pour refermer la plaie avec aucune tension ou étirement de la peau nécessaire. Une fois que la pompe a été insérée, suture de l’incision avec fil de chirurgie (polyglactine 910 avec suture taille 6-0)
Remarque : La tête de l’organisme de réglementation doit être orientée vers l’avant de la souris (Figure 1). - Appliquez l’onguent topique de povidone/iode 10 % avec un coton tige propre (Figure 1I) et gardez l’animal sur une phase de réchauffement de la planète. Ne laissez pas de souris en mode sans assistance jusqu'à ce qu’ils récupèrent décubitus sternal. Évaluer l’état d’hydratation et d’administrer 0,5 mL de solution saline à 0,9 % par voie sous-cutanée, si nécessaire. Retourner l’animal à son logement systématique.
- Suivez les lignes directrices pour la documentation (par exemple, remplir un formulaire de chirurgical opératoire et post-opératoire information, mise à jour carte de cage avec la procédure et la date) et fournir des analgésiques (buprénorphine, 0,05 mg/kg) pour réduire les douleurs postopératoires et antibiotiques (enrofloxacine 85 mg/kg) pour éviter l’infection post-chirurgicale.
- Poursuivre la surveillance de tous les jours et examiner les signes de la douleur. Faire attention que la plaie est complètement fermée et Minipompe est maintenu dans la poche sous-cutanée. La plaie peut s’ouvrir et la souris peut perdre la Minipompe.
3. dissection du cœur
- À l’heure du sacrifice, anesthésier souris avec 80-100 mg/kg de Zoletil administré par voie intramusculaire. Zoletil induit une anesthésie profonde. Remarque : Vérifiez que les souris sont à une profondeur suffisante de l’anesthésie avant de procéder par essais de la pédale et les réflexes palpébrales ; souris vont être perfusés pendant que profondément anesthésiés. Ouvrir la cavité thoracique, à l’aide de ciseaux et pinces, en coupant les côtes latéralement au sternum, avec le sternum réenroulée vers la tête.
- Perfuse souris via le ventricule gauche par système de perfusion par gravité avec 10 à 15 mL d’une solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco glacee (PBS), puis à 40-50 mL de 10 % de formol tamponné neutre pour fixer le système vasculaire. La fixation est indiquée lorsque les souris présentent des contractions musculaires vigoureux et deviennent rigides.
Remarque : Le processus de fixation se déroule en 10-20 min. Il est possible d’utiliser les organes fixes et tissus pour effectuer l’immunofluorescence ou des analyses de l’immunohistochimie. Ce qui est important, ces tissus fixés ne peuvent servir pour l’expression des gènes et western blot analyses. - Séparer le coeur de l’aorte en tenant le coeur avec la pince et coupe avec des ciseaux ou une lame de bistouri Swann-Morton, perpendiculairement à l’axe de l’aorte, aussi près que possible de cœur sans causer de dommages (Figure 2 a). Utilisez une lame de bistouri pour couper transversalement le long de la ligne droite qui joint les points inférieurs de l’oreillette droite et gauche (Figure 2 b).
- Remplir la partie supérieure du cœur sectionné (à travers la cavité du cœur) avec composé de coupe optimale (OCT) (Figure 2D-2E). Mettre le tissu dans un moule en plastique cryosection avec l’axe de l’aorte placé perpendiculairement à la base du moule rectangulaire et couvrir avec l’OCT (Figure 2F). Il ne devrait y avoir aucune bulle d’air piégé. Si aucune bulle n’est présent, essayez de déplacer vers le bord.
- Placez une plaque métallique sur la glace sèche et puis Rangez soigneusement le moule sur (Figure 2). Lorsque l’outil OPO devient blanche, envelopper le moule avec du papier argenté et ensuite stocker à-80 ° C.
4. Coupe des sections de la racine aortique
- Régler la machine cryostat à – 20 ° C. Avant de couper, placez le tissu embarqué et y laisser pendant environ 15 minutes pour s’adapter à cette température. Régler la température de titulaire du spécimen à-17 ° C (Figure 3 a).
- Déposer le bloc cœur gelé à l’intérieur de la machine cryostat à équilibrer la température du bloc à celle du cryostat (Figure 3 b), sortir le bloc cœur gelé du moule (Figure 3). Couper l’excès OCT du bloc congelé de mieux adapter les dimensions du bloc le porte-échantillon (Figure 3D).
- Montez le bloc cœur gelé sur le porte-échantillon orienté avec le ventricule vers l’extérieur (Figure 3E-3I) et insérez le porte-échantillon dans le spécimen en orientant la tête (Figure 3J). Ajustez l’orientation de la porte-échantillon pour permettre la découpe du bloc afin de rendre la racine aortique perpendiculaire à la lame (Figure 3 K).
- Couper le bloc et jeter les tranches jusqu'à atteindre la racine aortique (Figure 3 L-3N). Recueillir des coupes sériées et placez-les sur les lames de verre (Figure 3O). Surveiller le profil anatomique de la racine aortique sous le microscope, jusqu'à ce que toutes les valves aortiques 3 apparaissent (Figure 3 P-3 q).
- Recueillir des articles à 10 µm/section Oil Red O et la coloration rouge Sirius Picro et à 6 µm/section pour MAC3 coloration (Figure 3R). Frais virés autour de 6-8 diapositives (pour chaque coeur) jusqu'à ce qu’une des trois soupapes disparaît ou n’est plus intacts.
5. immunohistochimie
Remarque : Toutes les étapes de coloration dans les protocoles suivants sont exécutés en verre Coplin cuves de coloration.
-
Tache d’huile rouge O pour graisses neutres
- Difficulté des sections dans 70 mL de 37 % de formaldéhyde pendant 5 min. laver à l’eau du robinet et éponger hors de l’eau en excès.
- Diluer 48 mL de l’huile rouge O (0,5 % dans l’alcool isopropylique) 32 mL d’eau distillée pour obtenir l’huile rouge O 0,3 %.
- Tache de sections dans 70 mL d’huile rouge O 0,3 % pour les sections de lavage 10 minutes dans l’eau pendant 10 min du robinet.
- Détachant pendant 1 min dans 70 mL d’hématoxyline de Mayer. Laver les sections dans l’eau du robinet pendant 1 min.
- Immerger les sections dans 70 mL de carbonate de lithium de 0,5 %. Laver à l’eau du robinet pendant 1 min.
- Monter les sections avec un montage aqueux moyen et capture des images à l’aide d’un appareil photo numérique, monté sur un microscope optique.
-
Picro Sirius rouge tache pour le collagène
- Coupes de 10 µm congelés et monter dans le bas de la diapositive.
- Difficulté des sections dans 70 mL d’acétone pendant 5 min, sécher à l’air et rincer brièvement dans l’eau distillée.
- Placer les sections dans 70 mL d’acide phosphomolybdique 0,2 % pendant 5 min. Rincer brièvement à l’eau distillée.
- Placer les sections dans 70 mL de solution à 0,1 % Picro Sirius pour 90 min. Rincez une fois avec 70 mL de solution de HCl. jeter N 0,01.
- Lieu dans 70 mL de 0,01 N HCl pendant 2 min. Rincer brièvement dans de l’eau distillée. Sécher à l’air.
- Place brièvement dans 70 mL d’éthanol à 70 %.
- Une fois complètement sec, placer dans 70 mL d’agent d’origine de terpène de compensation et monter des sections à l’aide de poly (butyle méthacrylate -co-méthacrylate de méthyle) montage moyen et capture des images à l’aide d’un appareil photo numérique, monté sur un microscope optique de base.
Remarque : Un des avantages de la coloration rouge Sirius Picro est qu’il est possible de distinguer le Type I (fibres épaisses, biréfringence de jaune-Orange) et réseaux de fibres de collagène de Type III (fibres fines, biréfringence verte) par microscopie à lumière polarisée11 .
-
MAC3 tache pour la coloration des macrophages
- Coupes de 6 µm congelés et monter dans le bas de la diapositive.
- Difficulté des sections dans 70 mL d’acétone froid pendant 5 min. immerger dans 70 mL de PBS pendant 2 min.
- À l’aide d’une pipette, profilés de recouvrement avec 1 % de sodium dodecyl sulfate solution (SDS) et incuber pendant 5 min à température ambiante (RT) pour la recherche d’antigène. Plongez dans 70 mL de PBS pendant 5 min.
- À l’aide d’une pipette, couvrir les tranches avec 0,3 % de peroxyde d’hydrogène pendant 20 min. Lavez dans 70 mL de PBS 3 fois pendant 5 min.
- Utiliser des Complexes avidine-biotine (ABC)-Kit HRP pour les étapes suivantes.
- À l’aide d’une pipette, bloquer les sections dans le sérum de lapin Normal à température ambiante pendant 20 min. Ne pas rincer au large.
- Tache avec MAC3 (1 : 300) pendant 90 min. à RT. Wash dans 70 mL de PBS 3 fois pendant 5 min.
- Tache avec secondaire-biotinylé anti-rat IgG (1 : 200) pendant 45 min à RT. rinçage avec 70 mL de PBS 3 fois pendant 5 min.
- Couvrir les sections avec ABC IgG de lapin pendant 30 min à RT. rinçage avec 30 mL de PBS 3 fois pendant 5 min.
- Couvrir les sections avec 3-amino-9-ethylcarbazole (AEC) pendant 10 min. rincer avec 70 mL d’eau distillée pour 10 fois.
- Détachant pendant 1 min dans 70 mL d’hématoxyline de Mayer. Laver les sections dans l’eau du robinet pendant 1 min.
- Immerger les sections dans 70 mL de 0,5 % de Carbonate de Lithium. Laver à l’eau du robinet pendant 1 min.
- Monter les sections avec un montage aqueux moyen et capture des images à l’aide d’un appareil photo numérique, monté sur un microscope optique.
6. analyse des lésions athéroscléreuses dans les Sections de la racine aortique
Remarque : Sections de la racine aortique tachées avec de l’huile rouge O ou MAC3 ou un anticorps d’intérêt peuvent être analysées à l’aide des logiciels appropriés (indiqué dans la Table des matières). Pixels totaux coloration positive pour la composante d’intérêt est normalisée à la surface totale de la plaque. Des images ont été recueillies et analysées par un enquêteur du traitement aveugle.
-
Calibration
- Ouvrez le logiciel, puis sélectionnez l’image (au format jpg) à analyser.
- Sélectionnez page d’accueil | Créer | Calibration rapide.
- Mettre en place la calibration de l’image en traçant une ligne le long de la barre d’échelle de l’image.
- Sauvegarder l’installation d’étalonnage.
-
Analyse d’images
- Sélectionnez la configuration enregistrée d’étalonnage dans le menu Options | Option de Calibration spatiale.
- Sélectionnez étalonnage | S’appliquent.
- Sélectionnez l’outil Polygone dans le menu Sélectionner et dessiner le périmètre le long de toutes les lésions athéroscléreuses.
- Sélectionnez/Grosseur | Types. Dans le Menu, ajoutez et Zone de pour cent .
- Dans le menu Format/Count , sélectionnez Manuel et une nouvelle fenêtre seront ouvrira.
- Depuis cette fenêtre cliquez sur l’outil sélectionner couleur sur l’image et sélectionnez le mode de l’HSI .
- Pointez le curseur de la souris sur les pixels positifs du marqueur d’intérêt à créer une gamme de couleurs.
- Cliquez sur le nombre et la valeur Sum, observé dans la Table de mesure, indique le pourcentage de la superficie du marqueur (également exprimée en µm2) en ce qui concerne la superficie totale des lésions athéroscléreuses.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
8-10 semaines souris- / - Apo, minipompes ont été implantés pour infuser du véhicule ou de l’aldostérone (Figure 1E-1I) et nourris avec un régime athérogène (42 % de matières grasses de régime calories ajustés) pendant 4 semaines. À la fin du traitement, les souris ont été euthanasiés et perfusés avec du PBS et 10 % de formol comme décrit ci-dessus. La racine aortique a été séparée de la partie apicale du cœur et a été incorporée en OCT (Figure 2). Des coupes transversales de la racine aortique ont été préparés pour une coloration différente à l’aide d’une machine de cryostat (Figure 3).
Composition de la plaque athéromateuse peut être caractérisée par la coloration pour des composants spécifiques, qui définissent le stade de développement de la plaque. Huile rouge O coloration est utilisée pour déterminer la teneur en lipides des lésions athéroscléreuses comme indiqué au point 5.1, coloration rouge Sirius Picro est utilisée pour déterminer la teneur en collagène, comme indiqué au point 5.2 et Mac3 coloration sert à mesurer la teneur en macrophage décrit à l’étape 5.3. Après 4 semaines de traitement avec l’aldostérone, souris affichent une augmentation significative dans les lipides (Figure 4 a-4 C) et le contenu de macrophages (Figure 4-4F) dans les plaques d’athérome au niveau de la racine aortique, mais aucune différence n’était observé dans la teneur en collagène (Figure 4-4I) par rapport à des souris traitées avec le véhicule. En effet, l’aldostérone accéléré athérogenèse dans ce modèle, induisant l’inflammation vasculaire mais pas de fibrose (Figure 4).
Figure 1. Préparation et implantation de Minipompe osmotique avec véhicule ou de l’aldostérone. A-B) étapes pour remplir des minipompes osmotiques de véhicule ou de l’aldostérone. C) mesures pour fermer le corps de pompe avec le régulateur de débit. D-F) Étapes pour créer une incision pour l’implantation de la pompe sur l’arrière de la souris. G-I) Implantation de Minipompe osmotique et la suture de l’incision. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2. Préparer le coeur et la racine aortique d’enrobage et de sectionnement. A-B) coeur est coupé transversalement suivant une ligne droite qui joint les points inférieurs de l’oreillette droite et gauche. La partie apicale du cœur est traitée pour quantifier la composition des lésions athéroscléreuses dans la racine aortique. C) la racine aortique d’à l’intérieur du cœur. D-E) Remplissage de la cavité cardiaque avec octobre F) l’Orientation du cœur découpé dans un moule pré-remplie avec OCT (avec la cavité du cœur en direction du fond du moule) G) congélation du cœur disséqué avec OCT dans le moule. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3. La section de la racine aortique à l’aide d’un microtome cryostat. A) refroidir préalablement le cryostat et définir la bonne température pour la machine et le mandrin. B-D) Le solide bloc OCT est séparé du moule et l’OPO excès autour du coeur est éliminé à l’aide d’une lame. E-I) Le bloc d’OCT est fixé, à l’aide de liquide OPO, sur la prise en charge. J-K) Le support est inséré dans le mandrin et orienté avec le ventricule vers l’extérieur. L-M) Section du bloc jusqu'à ce que le cœur disséqué est complètement exposé. N.-O.) Définir l’épaisseur de 10 ou 6 µm et recueillir les tranches sur le verre. P-Q) Vérifier la présence de toutes les trois vannes sous le microscope. R) tranches suivantes sont collectées, comme indiqué, jusqu'à ce qu’une ou plusieurs soupapes ne s’observent pas plus. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
La figure 4. Quantification de composition de plaque athéromateuse en aldostérone véhicules traités ou ApoE- / -. A-B) représentatif de l’huile rouge O teint des coupes transversales de la racine aortique 8-10 semaines-vieux ApoE- / - souris traitées avec le véhicule (A) ou de l’aldostérone (B) et nourris avec un régime athérogène pendant 4 semaines. C) Quantification de la teneur en lipides en pourcentage de la surface de la plaque de coloration/total positif. D-E) Mac3 représentant colorées des coupes transversales de la racine aortique. F) Quantification de la teneur en macrophages comme pourcentage de la surface de la plaque de coloration/total positif. G-H) Représentant Picro Sirius rouge coloré des coupes transversales de la racine aortique. j’ai) Quantification de la teneur en collagène en pourcentage de la zone de la plaque de coloration/total positif. Les valeurs sont exprimées en moyenne ± écart-type moyen (SEM ; n = 6 pour chaque groupe). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
L’athérosclérose est une affection inflammatoire chronique associée à grandes et moyennes des navires faisant intervenir des interactions entre plusieurs types de cellules, telles que les macrophages, lymphocytes T, les cellules endothéliales et les cellules de muscle lisse1. Malgré les limites des modèles murins d’athérogènes, un grand nombre de preuves sur le processus athérosclérotique est disponible. Ces modèles ont l’avantage de générer rapidement des cohortes expérimentales d’un âge spécifique et le sexe. Souris montrent également un bagage génétique homogène et définie.
Le développement des plaques d’athérosclérose, observée dans des modèles murins sujettes à l’athérosclérose, ressemble partiellement à celle observée chez des sujets humains, à l’exception de la formation de plaques instables4. Rupture de la plaque et thrombose subséquente, la principale cause de l’infarctus du myocarde chez l’homme, n’est pas observé dans les modèles murins athérogènes. Dans nos papiers récents, nous avons montré que la perfusion d’aldostérone est capable d’induire, après 4 semaines, un phénotype plaque instable ApoE- / -souris nourris un SIH10. En fait, ce traitement est capable d’augmenter la zone de la plaque, le contenu en lipides et zone inflammatoire au niveau de la racine aortique, avec aucune différence significative de la teneur en collagène par rapport aux souris non traitées10. À noter, ces souris montrent un développement accru d’athérosclérose indépendante de l’hypertension, étant donné que la pression artérielle n’est pas significativement changée par aldostérone traitement10.
Dans le présent manuscrit, nous illustrons en détail la procédure technique pour incorporer le tissu cardiaque en octobre ainsi que les étapes séquentielles, c'est-à-dire la racine aortique plaque de découpe et de l’analyse. Par rapport à la paraffine, OCT permet la section avec une grande gamme d’épaisseurs (1-100 µm) avec un cryostat microtome et de la transformation minimale de tissu. Limitations incluent la qualité des tissus congelés, ce qui sont potentiellement affectée par la formation de cristaux de glace et peuvent modifier les détails subcellulaires et générer des artefacts détectables par coloration immunohistological. En effet, cryoconservation est pensée pour mieux préserver l’antigène et antigénicité. En fait, des tissus congelés préservent la structure des antigènes. En outre, tissus congelés de transformation pour l’immunohistochimie permettent d’éviter l’utilisation de formol, ce qui est un composé toxique et cancérogène.
La racine aortique est un site relativement simple d’identifier à la transformation histologique. Ce site anatomique est un étalon-or pour étudier le développement des lésions athéroscléreuses chez les souris sujettes à l’athérosclérose. Les données obtenues par l’analyse de cette région spécifique permettent des comparaisons entre les souris appartenant au même groupe ou différents groupes expérimentaux. En effet, au cours de la section de la racine aortique, il est facile de reconnaître une région spécifique, caractérisée par la présence de toutes les trois vannes. Afin d’obtenir une telle région spécifique, il est strictement recommandé à accorder une attention particulière à plusieurs étapes cruciales au cours de l’incorporation et de sectionnement. Il est important de remplir la cavité de la partie supérieure du cœur sectionné avec OCT pour éviter la formation de bulles d’air dans le tissu qui peuvent compromettre l’intégrité des sections. En outre, afin d’assurer que l’angle de coupe est exactement perpendiculaire à l’aorte ascendante au cours de la section, il faut orienter correctement supérieur coeur sectionné perpendiculairement à la surface inférieure de la moule de tissu. Pour obtenir des tranches intactes, la température du cryostat doit être exactement à-20 ° C. En fait, une température plus basse pourrait compromettre la qualité des articles (c'est-à-dire, la lame pourrait s’effondrer les sections ce qui les rend inutilisables).
À noter, lorsque les trois vannes apparaissent, il est recommandé de couper le tissu avec des épaisseurs différentes, selon le type de l’analyse qui sera effectuée. En effet, certaines diapositives seront utilisés pour la détermination de la progression de la plaque, alors que les diapositives restants pourraient être utilisés pour différentes salissures (i.e., Picro Sirius, Mac3, etc..).
Les lésions athéroscléreuses chez les souris traitées avec l’aldostérone apparaissent riches en lipides et en macrophages caractérisées par l’utilisation de l’huile rouge O (pour la coloration de lipides), Mac3 (pour la coloration de macrophage), Sirius rouge (pour la coloration du collagène) ou autres anticorps spécifiques pour protéines d’intérêt. Il est important de souligner que l’OCT déguisant, contrairement à l’enrobage de paraffine, évite l’utilisation de solvants organiques qui enlèvent la teneur en lipides des lésions. Par conséquent, lipides coloration à l’huile rouge O est faisable en sections OCT-encastrées et teneur en lipides des plaques d’athérome peut être quantifié précisément.
Dans le présent manuscrit, nous avons montré que la perfusion d’aldostérone est une méthode utile pour promouvoir l’athérosclérose chez les souris- / - ApoE. In fact, perfusion d’aldostérone ApoE- / - souris est capable de : 1) augmenter l’activation des cellules endothéliales, comme en témoigne l’augmentation de l’expression des molécules impliquées dans l’adhérence et la migration des monocytes aux premiers stades de la plaque d’athérosclérose formation de12,13; et 2) augmenter les lipides et le macrophages pro-inflammatoires contenu à la racine aortique niveau10,13. Ces effets ne sont pas en raison des effets hémodynamiques de l’aldostérone,10. En conclusion, la proposition de protocole représente une méthode valable pour générer et caractériser l’athérosclérose chez les souris ; Cela pourrait aider le moniteur premiers stades de la maladie et les résultats de l’intervention thérapeutique et la réadaptation dans l’athérosclérose.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par les subventions accordées par le ministère italien de la santé (Ricerca Corrente, GR-2009-1594563 et PE-2011-02347070 à M.C.)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adjusted calories diet (42 % from fat) | Envigo | TD.88137 | atherogenic diet |
| Osmotic minipump with filling tube | Alzet | model 1004 | for continous realase |
| Aldosterone | SIGMA | A9477 | hormone |
| Ethanol | SIGMA | 34852-M | solvent |
| Alchol Preps saturated with 70 % Isopropyl Alcohol | Kendal Webcol | 6818 | Disinfectant |
| Surgery wire (Vicryl 6.0) | Demas | 500004 | surgery |
| 10% Povidone/iodine ointment | Aplicare-Meriden | 52380-0026-1 | Antiseptic |
| Formalin 10% | SIGMA | HT5012 | to fix vascolature |
| Cryomold | Bio-Optica | 07-MP1515 | for embedding |
| O.C.T. Compound | Sakura Finetek | 4583 | for embedding |
| Cryostat | Leica | CM1900 | instrument for sectioning |
| Dulbecco's Phosphat Buffered Saline | Aurogene | AU-L0615-500 | buffer solution |
| Adhesion Slides Polysine | VWR | 631-0107 | microscope glasses |
| Cover Glasses | Bio-Optica | 72015 | cover glasses |
| Formaldehyde 37% | SIGMA | 252549 | solvent |
| Oil Red O solution (0.5 % in isopropanol) | SIGMA | O1391 | staining solution |
| Mayer’s Hematoxylin | SIGMA | MHS32 | staining solution |
| Lithium Carbonate | SIGMA | 62470 | washing buffer |
| Acqueous Mounting Medium | Thermo Scientific | TA-125-AM | mounting solution |
| Acetone | SIGMA | 179124 | solvent |
| Phosphomolybdic acid solution | SIGMA | HT153 | for hystology |
| Direct Red 80 (Picrosirius Red) | SIGMA | 365548 | staining solution |
| Bio Clear (clearing agent of terpene origin) | Bio-Optica | 06-1782D | product for the preparation of histological samples |
| Eukitt Quick Hardening mounting medium (Poly(butyl methacrylate-co-methyl methacrylate) | SIGMA | 3989 | mounting solution |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Fluka | 71725 | powder |
| Hydrogen Peroxide solution (30 %) | SIGMA | H1009 | solution |
| Vectorstain ABC KIT including: anti-rabbit IgG ABC, normal rabbit serum, Secondary-biotinylated Anti-Rat IgG , | Vector Laboratories | PK-6100 | staining solution |
| 3-amino-9-ethylcarbazole | Vector Laboratories | SK-4200 | staining solution |
| Mac3 antibody | BD Biosciences | 553322 | antibody |
| ImagePro Premier 9 | Media Cybernetics | 050910000-2534 | software to analyze images |
References
- Ross, R. Atherosclerosis--an inflammatory disease. New England Journal of Medicine. 340 (2), 115-126 (1999).
- Lafont, A. Basic aspects of plaque vulnerability. Heart. 89 (10), 1262-1267 (2003).
- Getz, G. S., Reardon, C. A. Animal models of atherosclerosis. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 32 (5), 1104-1115 (2012).
- Bentzon, J. F., Falk, E. Atherosclerotic lesions in mouse and man: is it the same disease? Current Opinion in Lipidology. 21 (5), 434-440 (2010).
- Getz, G. S., Reardon, C. A. Do the Apoe-/- and Ldlr-/- Mice Yield the Same Insight on Atherogenesis? Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 36 (9), 1734-1741 (2016).
- Emini Veseli, B., et al. Animal models of atherosclerosis. European Journal of Pharmacology. 816, 3-13 (2017).
- Schwartz, S. M., Galis, Z. S., Rosenfeld, M. E., Falk, E. Plaque rupture in humans and mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 27 (4), 705-713 (2007).
- de Rita, O., Hackam, D. G., Spence, J. D. Effects of aldosterone on human atherosclerosis: plasma aldosterone and progression of carotid plaque. Canadian Journal of Cardiology. 28 (6), 706-711 (2012).
- Ivanes, F., et al. Aldosterone, mortality, and acute ischaemic events in coronary artery disease patients outside the setting of acute myocardial infarction or heart failure. European Heart Journal. 33 (2), 191-202 (2012).
- McGraw, A. P., et al. Aldosterone increases early atherosclerosis and promotes plaque inflammation through a placental growth factor-dependent mechanism. Journal of the American Heart Association. 2 (1), e000018 (2013).
- Rittie, L. Method for Picrosirius Red-Polarization Detection of Collagen Fibers in Tissue Sections. Methods in Molecular Biology. 1627, 395-407 (2017).
- Caprio, M., et al. Functional mineralocorticoid receptors in human vascular endothelial cells regulate intercellular adhesion molecule-1 expression and promote leukocyte adhesion. Circulation Research. 102 (11), 1359-1367 (2008).
- Marzolla, V., et al. Essential role of ICAM-1 in aldosterone-induced atherosclerosis. International Journal of Cardiology. 232, 233-242 (2017).
