Summary
Vi beskriver en protokoll for å indusere aterosklerose i aorta roten av ApoE- / - mus med en atherogenic kosthold, gjennom en kontinuerlig utgivelsen av aldosteron. Metoder for å karakterisere plakk sammensetning er også beskrevet.
Abstract
Atherosclerosis er en kronisk inflammatorisk respons påvirker vaskulære endotelet, og er fremmet av flere faktorer som hypertensjon, dyslipidemi og diabetes. Dato er det bevis for å støtte en rolle for sirkulerende aldosteron som en risikofaktor for utvikling av hjerte-og karsykdommer. Transgene musen modeller har generert for å studere cellulære og molekylære prosesser som fører til åreforkalkning. I dette manuskriptet beskrive vi en protokoll som utnytter kontinuerlig infusjon av aldosteron i ApoE- / - mus og genererer aterosklerotisk plaketter i aorta roten etter 4 uker med behandling. Vi derfor illustrerer en metode for kvantifisering og karakterisering av aterosklerotisk lesjoner på aorta rotnivået. Merverdien av aldosteron infusjon er representert ved generering av aterosklerotisk lesjoner rik lipid og inflammatoriske celler etter 4 uker med behandling. Vi beskriver i detalj flekker prosedyrene for å kvantifisere lipid og macrophage innhold i plakk. Spesielt i denne protokollen utfører vi hjertet vev-innebygging i OCT for å bevare antigenicity av hjerte vev og lette detectability av antigener rundt. Analyse av plakk fenotypen representerer en gyldig tilnærming til å studere i Patofysiologien ved aterosklerose utvikling og identifisere romanen farmakologiske mål for utviklingen av anti-atherogenic narkotika.
Introduction
Atherosclerosis er en av hovedårsakene til dødelighet og sykelighet verden1. Det er preget av en kronisk inflammatorisk tilstand der blod fartøy er infiltrert av lipider og leukocytter som bestemmer dannelsen av aterosklerotisk plaketter. Flertallet av akutt cardiac hendelser knyttes trombotiske hendelser på grunn av plakk brudd. Plaketter utsatt for brudd defineres "utsatt" og er preget av økt infiltrasjon av pro-inflammatoriske leukocytter, en nekrotisk kjerne og en tynn fibrøs cap2. I de siste tiårene, har kliniske og eksperimentelle studier avklart i komplekse patofysiologien av sykdom. Flere dyr modeller brukes til å undersøke molekylære mekanismer involvert i induksjon av aterosklerose3. Foreløpig er musen den mest brukte å studere aterosklerose tross artsspesifikke forskjeller i sin patofysiologi med mennesker. Særlig består sirkulerer kolesterol hovedsakelig av high-density lipoproteiner (med antiatherogenic egenskaper) i musen modeller, mens hos mennesker sirkulerende kolesterol er hovedsakelig transportert som low-density lipoproteiner (LDL), sannsynligvis representerer den viktigste grunnen hvorfor vill-type mus ikke utvikle spontan aterosklerose4. Videre er vill type mus generelt motstandsdyktig å absorbere kolesterol fra kostholdet, mens mennesker absorbere rundt 50% av kosttilskudd kolesterol4. For å overvinne disse begrensningene, har flere genmodifiserte musen modeller generert. Apolipoprotein E-mangelfull mus (ApoE−/−) og LDL reseptoren-mangelfull mus (LDLr−/−) er mye brukt. På en høy fett høyt kolesterol diett, ApoE−/− mus utvikle plaque mer raskt sammenlignet LDLr−/−mus og derfor bruk av ApoE−/− mus er mer utbredt enn LDLr−/−mus5,6. ApoE−/− musene utvikle lesjoner av åreforkalkning og er sammenlignbare observert hos mennesker, selv om musen plaketter ikke viser en ustabil fenotypen7. Vanligvis ApoE−/− mus utvikle spontant åreforkalkning og denne prosessen er akselerert med vestlig kosthold3. Alvorlighetsgraden av aterosklerose kan evalueres på nivå med carotis, lunge, femur og truncus og aorta roten6. Spesielt representerer aorta roten en anatomiske området utsatt for å utvikle aterosklerotisk lesjoner i mus. Derfor er det vanlig praksis å evaluere dannelsen av aterosklerotisk plaketter i denne regionen.
Flere studier har vist at aldosteron er involvert i utvikling av aterosklerose8,9,10. Aldosteron infusjon i ApoE−/− mus matet en atherogenic kosthold akselererer utviklingen av aorta roten aterosklerotisk lesjoner inducing betent og lipid-rik plakk formasjon10.
I sammendraget beskriver vi en protokoll inkludert aldosteron infusjonen atherogenic kosthold fôring, innebygging av hjertet vev, kvantifisering og karakterisering av aterosklerotisk lesjoner i ApoE- / - mus. Denne fremgangsmåten fremmer en effektiv dannelsen av betent, lipid-rik aterosklerotisk plaketter og representerer en verdifull modell for studiet av atherogenesis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Studien ble godkjent av den italienske nasjonale institutter for helse og bruk komiteer, autorisasjon tall 493/2016-PR. Alle prosedyrer ble utført per retningslinjene i EU for bruk av forsøksdyr (EU-direktiv, 2010/63/UE).
Merk: Subcutaneous implantering av osmotisk minipump som inneholder kjøretøy (etanol i saltvann) eller aldosteron (240 µg · kg-1 · d-1) i 8-10-uke-gamle mannlige mus mangelfull for ApoE genet. Generelt, 8-10-uke-gamle mannlige ApoE−/− mus veier rundt 25-26 g.
1. oppløsende aldosteron
- Oppløse 5 mg aldosteron pulver i 1 mL av absolutt etanol.
- Legge til 56,7 µL av aldosteron (oppløst i etanol) 68.3 µL av saltvann for å få en konsentrasjon av 2.27 µg / µL. fyll det hele osmotisk minipumps helt med 125 µL av denne løsningen (maksimum antall hver minipump er 125 µL).
- Bruke en minipump flow rate 0,11 µL/t; Derfor 2.64 µL av løsningen slippes hver 24 h. gi hver musen rundt 6 µg · d-1 av aldosteron i 28 dager.
2. osmotisk pumpe fylling og implantering
Merk: Pumper leveres i to deler: hoveddelen av pumpen og flyt regulator.
- Fyll og håndtere minipumps med kirurgiske hansker.
Merk: Hud oljer kan påvirke ytelsen til minipumps. Følgende trinn skal utføres i sterilt laminær strømning hette. - Feste fylling tuben (følger med på minipumps) til en 1 mL sprøyte og trekke opp aldosteron løsning eller kjøretøy.
Merk: Det er viktig å unngå å la luften inne sprøyten mens aspirating løsninger fra røret for å hindre dannelse av luftbobler i pumpen. - Sett inn fylling røret hullet på toppen av minipump før det kan gå lenger (figur 1A-1B). Langsomt fyll pumpen med aldosteron eller kjøretøy. Merke mørke skyggen inne pumpen som angir hvilket væske. Se denne nivå stiger sammen med fylling pumpen.
- Stoppe fylle pumpen når en perle av væske stiger av pumpen kroppen.
- Nøye fjerne fylling røret og flyt regulator inn i kroppen av minipump (figur 1 c). Kontroller at regulatoren sitter tett mot pumpen kroppen. La fylt osmotisk pumper i et beaker med sterilt saltvann løsning på 37 ° C i opptil 24 timer før implantasjon i musen (grunning prosedyre).
- Utføre kirurgi i et desinfiseres med 70% etanol som fremmer asepsis.
- Bruk 1-3 dråper på incision sted av 0,25% bupivacaine og bedøve dyret med 3% isoflurane. Slå på forsyning gassen og satt flowmeter til 500-1000 mL/min. sted dyret i induksjon kammeret og forsegle toppen. Slå på vaporizer til 5% isoflurane og overvåke musen til liggende.
- Bryteren systemet å strømme til nosecone. Fjerne dyret fra kammeret og posisjon i nosecone. I 2-3 minutter begynner musen å vekke. Starte gasstrømmen flowmeter på 100-200 mL/min og vaporizer på 3% isoflurane.
- Sikre tilstrekkelig dybdeskarphet anestesi før prosedyrer ved å teste pedal uttak og palpebral reflekser. Overvåke åndedrett og respons på stimulering under prosedyren og justere vaporizer etter behov.
- Beskytte hornhinner tørker ut ved å bruke en ophthalmica salve.
- Forberede dyr ved å fjerne håret fra det kirurgiske området ved hjelp av en barberhøvel (figur 1 d). Vanlige nettstedet for subcutaneous implantasjon av pumper er på baksiden.
- Forberede kirurgiske området med nonwoven pad materiale mettet med 70% isopropylalkohol.
- Bruk en ren og dedikert plass (desinfiseres med 70% etanol) og dekket med et sterilt drapere. Plass tuppen av instrumentene i et glass bead sterilisere. Begynne kirurgi med steriliserte instrumenter og håndtere instrumenter tas aseptisk.
- Bruke kirurgisk saks til å gjøre en 0,8-1 cm snitt (ca 2 cm nær halen), som vist i tall 1E-1F. Opprettholde sterilitet ved å ikke røre noe utenfor den kirurgiske dedikert plassen med sterilt hansker eller tips av instrumenter.
- Ta vare for å kutte bare i huden, men ikke den underliggende vev. Bruke en hånd for å holde tang åpne innsnitt. Bruke derimot for å holde trocar å spre huden for å danne en lomme for pumpen fra baksiden oppover til skulderblad (på høyre eller venstre side av musen).
- Pumpen inn i snitt. Skyv pumpen fullstendig i lommen (figur 1 H). Det bør være nok huden gratis å lukke såret med nei spenning eller strekke av huden behov. Når pumpen er satt inn, Sutur av såret med kirurgi wire (polyglactin 910 med Sutur størrelse 6-0)
Merk: Hodet av regulator må være orientert mot fronten av musen (figur 1G). - Bruk aktuelle 10% povidon/jod salven med en ren vattpinne (figur 1I) og holde dyr på en oppvarming scene. Ikke la mus i uovervåket før de komme sternal recumbency. Evaluere hydration status og administrere 0,5 mL 0,9% saltvann subcutaneously om nødvendig. Tilbake dyret til rutinemessig kabinettet.
- Følg institusjonelle retningslinjene for dokumentasjon (f.eks fylle et kirurgisk skjema med operative og postoperativ, oppdateringen bur kort med fremgangsmåten og dato) og analgetika (buprenorfin, 0,05 mg/kg) for å redusere etter kirurgiske smerte og antibiotika (enrofloxacin 85 mg/kg) å unngå etter kirurgiske infeksjon.
- Fortsette daglig overvåking og undersøke for underskriver av smerte. Vær oppmerksom at såret er helt lukket og minipump opprettholdes i subcutaneous lommen. Såret kan åpne og musen kan miste minipump.
3. Disseksjon av hjertet
- Ved offer, anestethize mus med 80-100 mg/kg av Zoletil administreres intramuskulært. Zoletil induserer dyp anestesi. Merk: kontrolle at mus er i en tilstrekkelig dybde av anestesi før prosedyrer ved å teste på pedalen og palpebral reflekser; mus vil være perfused mens dypt anesthetized. Åpne bryst hulrom, ved hjelp av saks og tang, ved å kutte ribbeina lateralt til sternum, med sternum blir trukket mot hodet.
- Perfuse musen via venstre ventrikkel av tyngdekraften perfusjon system med 10-15 mL iskalde Dulbecco fosfat bufret saltvannsoppløsning (PBS) og deretter med 40-50 mL av 10% av nøytrale bufrede formalin å fastsette er blodkar. Fiksering angis når mus utstilling energisk muskelsammentrekninger og bli stiv.
Merk: Fikse prosessen foregår på 10-20 minutter. Det er mulig å bruke faste organer og vev for å utføre immunofluorescence eller immunohistochemistry analyser. Viktigere, kan ikke slik fast vev brukes for genuttrykk og vestlige blotting analyser. - Skille hjertet fra aortabuen ved å holde hjertet med tang og klippe med saks eller en skalpell blad, vinkelrett på aksen av aorta, så nær som mulig til hjertet uten å forårsake skade (figur 2A). Bruk en skalpell blad for å klippe tvers langs en rett linje som kobler de nedre poengene av høyre og venstre atrium (figur 2B).
- Fyll den øvre delen av appa hjertet (gjennom hulrommet av hjertet) med optimal kutte sammensatte (OCT) (figur 2D-2E). Sette vevet cryosection plast mold med aksen av aorta plassert vinkelrett til bunnen av den rektangulære formen og dekk med OCT (figur 2F). Det skal ingen luftboble fanget. Hvis en boble finnes, prøve å fortrenge det til kanten.
- Plasser en metallplate på tørris og deretter sette nøye mold på (figur 2 g). Når Tilpasningsverktøy blir hvit, vikle formen med folie og deretter lagre på –80 ° C.
4. skjæring deler av aorta roten
- Still kryostaten maskinen til –20 ° C. Før kutte, plasser den innebygde vev og la den være der i ca 15 min å justere til denne temperaturen. Angi holderen prøvetemperatur-17 ° c (figur 3A).
- Plass frosne hjertet blokken inni kryostaten maskinen equilibrate temperaturen på blokken som kryostaten (figur 3B) og ta ut frosne hjertet blokken fra formen (Figur 3 c). Kutt overflødig Tilpasningsverktøy for Office fra frosne blokken bedre justere blokk dimensjonene til prøveholderen (figur 3D).
- Montere frosne hjertet blokken på prøveholderen orientert med ventrikkel vender utover (figur 3E-3I) og prøveholderen inn prøven orientere hodet (figur 3J). Juster retningen til prøveholderen slik at kutting av blokken for å gjøre aorta roten vinkelrett bladet (Figur 3 K).
- Skjær blokken og forkaste skiver til aorta roten (Figur 3 L-3N). Samle føljetong deler og plassere dem på glass lysbilder (figur 3O). Overvåke aorta roten anatomiske profilen under mikroskopet til alle 3 aorta ventiler vises (Figur 3 P-3Q).
- Samle deler ved 10 µm/avdeling for olje Red O og Picro Sirius røde flekker og 6 µm/seksjon for MAC3 flekker (figur 3R). Samle rundt 6-8 lysbilder (for hvert hjerte) til ett av de tre ventilene forsvinner eller er ikke intakt lenger.
5. Immunohistochemistry
Merk: Alle flekker trinnene i følgende protokoller utføres i glass Coplin flekker glass.
-
Olje røde O Stain nøytral fett
- Fikse delene i 70 mL av 37% formaldehyd i 5 min. vaske i vann fra springen og blot av overskytende vann.
- Fortynne 48 mL olje Red O (0,5% i isopropanol) i 32 mL destillert vann å få olje Red O 0,3%.
- Stain inndelinger i 70 mL olje Red o 0,3% for 10 min. vask inndelinger i trykk vann i 10 minutter.
- Flekker i 1 min i 70 mL av Mayers Hematoxylin. Vask deler i springvann for 1 min.
- Legg seksjoner i 70 mL over 0,5% lithium carbonate. Vaskes i vann fra springen i 1 min.
- Montere delene med en vandig montering medium og ta bilder med et digitalt kamera montert på en lett mikroskop.
-
Picro Sirius røde flekker for kollagen
- Skjær 10 µm frosset seksjoner og montere nederst i lysbildet.
- Fikse delene i 70 mL av aceton i 5 min, lufttørke og skyll kort i destillert vann.
- Sett deler i 70 mL 0,2% phosphomolybdic syre for 5 min. skyll kort i destillert vann.
- Sett deler i 70 mL 0,1% Picro Sirius løsning for 90 min. skyll én gang med 70 mL 0,01 N HCl. kast.
- Sted i 70 mL 0,01 N HCl i 2 min. skyll kort i destillert vann. Lufttørke.
- Sted kort i 70 mL 70% etanol.
- Når det er helt tørt, plasser i 70 mL fjerne agent terpene opprinnelse og montere seksjoner med poly (butyl methacrylate -co-methyl methacrylate) basert montering medium og ta bilder med et digitalt kamera montert på en lett mikroskop.
Merk: En av fordelene med den Picro Sirius røde flekker er at det er mulig å skille typen jeg (tykk fiber, gul-oransje birefringence) og Type III (tynne fibre, grønne birefringence) kollagen fiber nettverk av polarisert * lys11 .
-
Mac3 flekk til Macrophage farging
- Klipp 6 µm frosne deler og montere nederst i lysbildet.
- Fikse delene i 70 mL av kaldt aceton for 5 min. Immerse i 70 mL av PBS i 2 minutter.
- Bruker en pipette, dekke seksjoner med 1% natrium dodecyl sulfate (SDS) løsning og ruge i 5 minutter ved romtemperatur (RT) for antigen henting. Fordyp i 70 mL PBS i 5 min.
- Bruker en pipette, dekk skiver med 0,3% Hydrogenperoksid i 20 min. vask i 70 mL PBS 3 ganger i 5 minutter.
- Bruk Avidin-Biotin komplekser (ABC)-HRP Kit for følgende.
- Bruker en pipette, blokkere inndelinger i Normal kanin serum ved romtemperatur for 20 min. Ikke skyll av.
- Flekker med MAC3 (1:300) i 90 min. på RT. Wash i 70 mL av PBS 3 ganger i 5 minutter.
- Flekker med sekundær-biotinylated anti-rotte IgG (1:200) for 45 min på RT. skyll med 70 mL PBS 3 ganger i 5 minutter.
- Dekk delene med kanin IgG ABC i 30 min på RT. skyll med 30 mL PBS 3 ganger i 5 minutter.
- Dekke avsnittene med 3-amino-9-ethylcarbazole (AEC) for 10 min. skyll med 70 mL destillert vann for 10 ganger.
- Flekker i 1 min i 70 mL av Mayers Hematoxylin. Vask deler i springvann for 1 min.
- Fordype deler i 70 mL av 0,5% Lithium Carbonate. Vaskes i vann fra springen i 1 min.
- Montere delene med en vandig montering medium og ta bilder med et digitalt kamera montert på en lett mikroskop.
6. bildeanalyser av aterosklerotisk lesjoner i aorta roten deler
Merk: Aorta roten deler med olje Red O eller MAC3 eller et antistoff rundt kan analyseres ved hjelp av riktig programvare (angitt i Tabell av materialer). Totalt antall piksler flekker positivt for komponenten av interesse er normalisert til generelle plakk området. Bildene ble samles og analyseres av en behandling-blindet etterforsker.
-
Kalibrering
- Åpne programvare og velg bildet (i jpg) som skal analyseres.
- Velg den hjem | Opprette | Quick Kalibreringsverksted.
- Definere kalibrering av bildet ved å tegne en linje langs baren skala av bildet.
- Lagre oppsettet for kalibrering.
-
Bildeanalyser
- Velg lagrede oppsett kalibrering Alternativer menyen | Romlig kalibrering.
- Velg kalibrering | Bruke.
- Velger polygonverktøyet på Velg menyen og tegne omkretsen langs alle aterosklerotisk lesjoner.
- Velg Antall/størrelse | Typer. Legge til og Prosent område på menyen.
- Antall/størrelse -menyen, vil Velg manuell og et nytt vindu åpne.
- Fra dette vinduet klikker du på verktøyet velge farge på bildet og velg HSI modus.
- Velg musepekeren på positive bildepunktene på markøren rundt opprette et fargeområde.
- Klikk på antallet og verdien summeni Måling tabell, angir prosentandelen av markøren (også uttrykt i µm2) forhold til det totale arealet av aterosklerotisk lesjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I 8-10 uker Apo- / - mus, minipumps ble implantert til med kjøretøy eller aldosteron (figur 1E-1I) og matet en atherogenic kosthold (justert kalorier kosthold 42% fra fett) i 4 uker. På slutten av behandlingen, var mus euthanized og parfyme med PBS og 10% formalin som beskrevet ovenfor. Aorta roten ble skilt fra den apikale delen av hjertet og var forankret i OCT (figur 2). Tverrsnitt av aorta røttene var forberedt annerledes flekker ved hjelp av en kryostaten maskin (Figur 3).
Aterosklerotisk plakk komposisjon kan være preget gjennom den flekker bestemte komponenter, som definerer utviklingstrinn plakk. Olje Red O flekker brukes til å bestemme lipid innhold av aterosklerotisk lesjoner som beskrevet i trinn 5.1 Picro Sirius røde flekker brukes til å bestemme kollagen innhold som beskrevet i trinn 5.2 og Mac3 flekker er ansatt å måle macrophage innhold beskrevet i trinn 5.3. Etter 4 ukers behandling med aldosteron, mus vises en betydelig økning i lipid (figur 4A-4 C) og macrophage innhold (Figur 4 d-4F) i aterosklerotisk plaketter på aorta rotnivået, men ingen forskjeller ble observert i kollagen innhold (figur 4G-4I) sammenlignet med mus behandlet med bilen. Faktisk akselerert aldosteron atherogenesis i denne modellen, inducing vaskulær betennelse men ikke fibrose (Figur 4).
Figur 1. Forberedelse og implantering av osmotisk minipump med kjøretøy eller aldosteron. A-B) skritt å fylle osmotisk minipumps med kjøretøy eller aldosteron. C) slik Lukk kroppen av pumpen med flyt regulator. D-F) Trinnene for å opprette et snitt for implantering av pumpen på baksiden av musen. G-jeg) Implantering av osmotisk minipump og suturing av snitt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Forbereder hjertet og aorta roten for innebygging og snitting. A-B) hjertet er kuttet tvers langs en rett linje som kobler de nedre poengene av høyre og venstre atrium. Den apikale delen av hjertet behandles for å kvantifisere aterosklerotisk lesjoner komposisjon i aorta roten. C) aorta roten fra innenfor hjertet. D-E) Fylling av hjertet hulrom med oktober F) retning dissekert hjertet i en mold pre fylt med OCT (med hjertet hulrom i retning av bunnen av mold) G) frysing av dissekert hjertet med OCT i mold. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Inndeling av aorta roten bruker en kryostaten mikrotomen. A) Pre-avkjøle kryostaten og angi riktig temperatur for maskinen og chuck. B-D) Solid OCT blokk er skilt fra mold og overflødig Tilpasningsverktøy rundt hjertet elimineres med et blad. E-jeg) Blokken av OCT er fast, bruker flytende oktober, på støtte. J-K) Støtte er satt inn i chuck og orientert med ventrikkel vender utover. L-M) Delen blokken til dissekert hjertet er fullstendig eksponert. N-O) Angi tykkelse til 10 og/eller 6 µm og samle skiver på glasset. P-Q) Sjekke tilstedeværelse av alle tre ventiler under mikroskopet. R) etterfølgende skiver er samlet inn, som vist, til én eller flere ventiler ikke er observert lenger. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Kvantifisering av aterosklerotisk plakk komposisjon i aldosteron eller kjøretøy-behandlet ApoE- / -. A-B) representant røde olje O beiset tverrsnitt av aorta roten i 8-10-uke-gamle ApoE- / - mus behandlet med kjøretøy (A) eller aldosteron (B) og matet en atherogenic kosthold i 4 uker. C) kvantifisering av lipid innhold prosentandel av positive flekker/totalt plakk skjermområdet. D-E) Representant Mac3 farget tverrsnitt av aorta roten. F) kvantifisering macrophage innhold prosentandel av positive flekker/totalt plakk skjermområdet. G-H) Representant Picro Sirius rød farget tverrsnitt av aorta roten. jeg) kvantifisering av kollagen innhold som en prosentandel av positive flekker/totalt plakk. Verdiene uttrykkes som betyr ± standardfeil mener (SEM, n = 6 for hver gruppe). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Atherosclerosis er en kronisk betennelsestilstand forbundet med store og mellomstore fartøy som involverer interaksjoner mellom flere celletyper, som makrofager, T-lymfocytter, endotelceller og glatt muskel celler1. Begrensningene av murine atherogenic modeller er en stor mengde bevis på aterosklerotisk prosessen tilgjengelig. Disse modellene har fordelen av raskt generere eksperimentelle kohorter av en bestemt alder og kjønn. Mus viser også en definert og homogen genetisk bakgrunn.
Utviklingen av aterosklerotisk plaketter, observert i musen modeller utsatt for aterosklerose, delvis ligner som observert i menneskelig fag, med unntak av ustabilt plakk formasjon4. Plakk brudd og påfølgende trombose, den viktigste årsaken til hjerteinfarkt hos mennesker, er ikke observert i murine atherogenic modeller. I vårt siste artikler, vi viste at infusjon av aldosteron er i stand å indusere, etter 4 uker, et ustabilt plakk fenotypen i ApoE- / -mus matet en HFD10. Denne behandlingen er faktisk øke plakk, lipid innhold, og provoserende område på aorta roten nivå, med ingen signifikant forskjell i kollagen innhold sammenlignet med ubehandlet mus10. Av notatet viser disse musene økt utvikling av hypertensjon-uavhengig aterosklerose, gitt at blodtrykk ikke var betydelig endret av aldosteron behandling10.
I stede manuskriptet illustrere vi i detalj tekniske fremgangsmåten for å legge hjerte vevet i OCT samt den sekvensielle trinn, dvs. aorta roten snitting og plakk analyse. Sammenlignet med parafin, gjør OCT delen utarbeidelsen med en høy rekke tykkelser (1-100 µm) med kryostaten mikrotomen og minimal vev behandling. Begrensninger kan omfatter kvaliteten på frossent, som er potensielt berørt av dannelsen av iskrystaller og endre subcellular detaljer og generere gjenstander synlig ved immunohistological flekker. Faktisk er kryonisk bevaring tenkt å bedre bevare antigen og antigenicity. Faktisk, bevare frosne vev strukturen for antigener. Videre frossent behandling for immunohistochemistry gjør det mulig for å unngå bruk av formalin, som er et giftige og kreftfremkallende stoff.
Aorta roten er et område som er relativt enkelt å identifisere for histologiske behandling. Dette anatomiske området er en gull-standard å studere aterosklerotisk lesjon utvikling i mus utsatt til åreforkalkning. Data innhentet av analyse av denne bestemt område at sammenligninger mellom mus tilhører samme gruppen eller annen eksperimentell gruppene. Faktisk, under snitting av aorta roten, er det enkelt å gjenkjenne en bestemt region preget av tilstedeværelsen av alle tre ventiler. For å oppnå et bestemt område, er det strengt anbefalt å være spesielt oppmerksom på flere viktige trinn under innebygging og snitting. Det er viktig å fylle hulrom i den øvre delen av appa hjertet med oktober-Unngå dannelse av luftbobler i vev som kan kompromiss integriteten til delene. Videre, for å sikre at cutting vinkel er nøyaktig vinkelrett stigende aorta under snitting, er det nødvendig å orientere riktig øvre inndelte hjertet vinkelrett til bunnen av vev mold. For å få intakt skiver, skal temperaturen på kryostaten være akkurat på 20 ° C. Faktisk lavere temperatur kunne kompromittere kvaliteten på delene (dvs. bladet kan forvitre delene gjør dem ubrukelig).
Når tre ventilene vises, av notatet anbefales det å kutte vevet med forskjellige tykkelser, avhengig av hvilken type analyse som skal utføres. Faktisk noen lysbilder skal brukes for fastsettelse av plakk progresjon, mens de resterende lysbildene kan brukes til forskjellige stainings (dvs., Picro Sirius, Mac3, etc.).
Aterosklerotisk lesjoner i mus behandlet med aldosteron vises rik lipid og makrofager preget av bruk av olje Red O (for lipid farging), Mac3 (for macrophage farging), Sirius rød (for farging av kollagen) eller andre spesifikke antistoffer for proteiner av interesse. Det er viktig å understreke at OCT embedding, i motsetning til parafininnstøper, unngår bruk av organiske løsemidler som fjerne lipid innholdet av lesjoner. Derfor lipid flekker med olje Red O er mulig i OCT-embedded deler og lipid innhold av aterosklerotisk plaketter kan kvantifiseres nøyaktig.
I stede manuskriptet viste vi at aldosteron infusjon er en nyttig metode for å fremme aterosklerose i ApoE- / - mus. In fact, aldosteron infusjon i ApoE- / - mus er kjøpedyktig: 1) øke aktivering av endotelceller, som vist av økt uttrykk for molekyler involvert i adhesjon og migrering av monocytter i de tidlige stadiene av aterosklerotisk plakett dannelse12,13; og 2) øke lipid og pro-inflammatoriske makrofager innhold aorta roten nivå10,13. Disse effektene er ikke på grunn av hemodynamic effekter av aldosteron10. Avslutningsvis representerer foreslåtte protokollen en gyldig metode for å generere og karakterisere aterosklerose i mus; Dette kan hjelpe skjermen tidlige stadier av sykdommen og resultatene av terapeutisk intervensjon og rehabilitering i åreforkalkning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra italiensk Helsedepartementet (Ricerca Corrente, GR-2009-1594563 og PE-2011-02347070 til M.C.)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adjusted calories diet (42 % from fat) | Envigo | TD.88137 | atherogenic diet |
| Osmotic minipump with filling tube | Alzet | model 1004 | for continous realase |
| Aldosterone | SIGMA | A9477 | hormone |
| Ethanol | SIGMA | 34852-M | solvent |
| Alchol Preps saturated with 70 % Isopropyl Alcohol | Kendal Webcol | 6818 | Disinfectant |
| Surgery wire (Vicryl 6.0) | Demas | 500004 | surgery |
| 10% Povidone/iodine ointment | Aplicare-Meriden | 52380-0026-1 | Antiseptic |
| Formalin 10% | SIGMA | HT5012 | to fix vascolature |
| Cryomold | Bio-Optica | 07-MP1515 | for embedding |
| O.C.T. Compound | Sakura Finetek | 4583 | for embedding |
| Cryostat | Leica | CM1900 | instrument for sectioning |
| Dulbecco's Phosphat Buffered Saline | Aurogene | AU-L0615-500 | buffer solution |
| Adhesion Slides Polysine | VWR | 631-0107 | microscope glasses |
| Cover Glasses | Bio-Optica | 72015 | cover glasses |
| Formaldehyde 37% | SIGMA | 252549 | solvent |
| Oil Red O solution (0.5 % in isopropanol) | SIGMA | O1391 | staining solution |
| Mayer’s Hematoxylin | SIGMA | MHS32 | staining solution |
| Lithium Carbonate | SIGMA | 62470 | washing buffer |
| Acqueous Mounting Medium | Thermo Scientific | TA-125-AM | mounting solution |
| Acetone | SIGMA | 179124 | solvent |
| Phosphomolybdic acid solution | SIGMA | HT153 | for hystology |
| Direct Red 80 (Picrosirius Red) | SIGMA | 365548 | staining solution |
| Bio Clear (clearing agent of terpene origin) | Bio-Optica | 06-1782D | product for the preparation of histological samples |
| Eukitt Quick Hardening mounting medium (Poly(butyl methacrylate-co-methyl methacrylate) | SIGMA | 3989 | mounting solution |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Fluka | 71725 | powder |
| Hydrogen Peroxide solution (30 %) | SIGMA | H1009 | solution |
| Vectorstain ABC KIT including: anti-rabbit IgG ABC, normal rabbit serum, Secondary-biotinylated Anti-Rat IgG , | Vector Laboratories | PK-6100 | staining solution |
| 3-amino-9-ethylcarbazole | Vector Laboratories | SK-4200 | staining solution |
| Mac3 antibody | BD Biosciences | 553322 | antibody |
| ImagePro Premier 9 | Media Cybernetics | 050910000-2534 | software to analyze images |
References
- Ross, R. Atherosclerosis--an inflammatory disease. New England Journal of Medicine. 340 (2), 115-126 (1999).
- Lafont, A. Basic aspects of plaque vulnerability. Heart. 89 (10), 1262-1267 (2003).
- Getz, G. S., Reardon, C. A. Animal models of atherosclerosis. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 32 (5), 1104-1115 (2012).
- Bentzon, J. F., Falk, E. Atherosclerotic lesions in mouse and man: is it the same disease? Current Opinion in Lipidology. 21 (5), 434-440 (2010).
- Getz, G. S., Reardon, C. A. Do the Apoe-/- and Ldlr-/- Mice Yield the Same Insight on Atherogenesis? Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 36 (9), 1734-1741 (2016).
- Emini Veseli, B., et al. Animal models of atherosclerosis. European Journal of Pharmacology. 816, 3-13 (2017).
- Schwartz, S. M., Galis, Z. S., Rosenfeld, M. E., Falk, E. Plaque rupture in humans and mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 27 (4), 705-713 (2007).
- de Rita, O., Hackam, D. G., Spence, J. D. Effects of aldosterone on human atherosclerosis: plasma aldosterone and progression of carotid plaque. Canadian Journal of Cardiology. 28 (6), 706-711 (2012).
- Ivanes, F., et al. Aldosterone, mortality, and acute ischaemic events in coronary artery disease patients outside the setting of acute myocardial infarction or heart failure. European Heart Journal. 33 (2), 191-202 (2012).
- McGraw, A. P., et al. Aldosterone increases early atherosclerosis and promotes plaque inflammation through a placental growth factor-dependent mechanism. Journal of the American Heart Association. 2 (1), e000018 (2013).
- Rittie, L. Method for Picrosirius Red-Polarization Detection of Collagen Fibers in Tissue Sections. Methods in Molecular Biology. 1627, 395-407 (2017).
- Caprio, M., et al. Functional mineralocorticoid receptors in human vascular endothelial cells regulate intercellular adhesion molecule-1 expression and promote leukocyte adhesion. Circulation Research. 102 (11), 1359-1367 (2008).
- Marzolla, V., et al. Essential role of ICAM-1 in aldosterone-induced atherosclerosis. International Journal of Cardiology. 232, 233-242 (2017).
