हम मात्रात्मक चरण इमेजिंग और मशीन लर्निंग एल्गोरिथ्म का उपयोग करके लिम्फोसाइट उपप्रकारों की लेबल-मुक्त पहचान के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं । 3 डी अपवर्तन सूचकांक की माप tomograms के लिम्फोसाइटों वर्तमान 3d रूपात्मक और जैव रासायनिक जानकारी व्यक्तिगत कोशिकाओं के लिए है, जो तब सेल प्रकार की पहचान के लिए एक मशीन सीखने के एल्गोरिथ्म के साथ विश्लेषण किया जाता है ।
हम यहां लेबल के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन-मात्रात्मक चरण इमेजिंग और मशीन सीखने का उपयोग लिम्फोसाइट उपप्रकार के मुक्त पहचान । इम्यूनोलॉजी के अध्ययन के साथ ही विभिन्न रोगों के निदान और उपचार के लिए लिम्फोसाइट उपप्रकारों की पहचान महत्वपूर्ण है । वर्तमान में, लिम्फोसाइट प्रकार वर्गीकृत करने के लिए मानक तरीके प्रतिजन-एंटीबॉडी प्रतिक्रियाओं के माध्यम से विशिष्ट झिल्ली प्रोटीन लेबलिंग पर निर्भर करते हैं । हालांकि, इन लेबलिंग तकनीक सेलुलर कार्यों में फेरबदल के संभावित जोखिम ले । प्रोटोकॉल यहां वर्णित आंतरिक ऑप्टिकल 3 डी मात्रात्मक चरण इमेजिंग और एक मशीन लर्निंग एल्गोरिथ्म द्वारा मापा विरोधाभासों का दोहन द्वारा इन चुनौतियों पर काबू । 3 डी अपवर्तन सूचकांक (आरआई) के माप लिम्फोसाइटों के tomograms 3d आकृति विज्ञान और phenotypes के बारे में मात्रात्मक जानकारी प्रदान करता है । मापा 3 डी आरआई tomograms से निकाले जाने वाले भौतिक पैरामीटर तो मात्रात्मक एक मशीन अधिगम एल्गोरिथ्म के साथ विश्लेषण कर रहे हैं, एक एकल सेल स्तर पर लिम्फोसाइट प्रकार की लेबल मुक्त पहचान को सक्षम करने से । हम B, CD4 + t, और सीडी 8 + t लिम्फोसाइटों के 3 डी आरआई tomograms उपाय और ८०% से अधिक सटीकता के साथ अपने सेल प्रकार की पहचान की । इस प्रोटोकॉल में, हम लिम्फोसाइट अलगाव, 3 डी मात्रात्मक चरण इमेजिंग, और लिम्फोसाइट प्रकार की पहचान करने के लिए मशीन सीखने के लिए विस्तृत कदम का वर्णन ।
लिम्फोसाइटों को बी, हेल्पर (CD4 +) टी, साइटोटोक्सिक (सीडी 8 +) टी, और रेगुलेटरी टी सेल सहित विभिन्न उपप्रकारों में वर्गीकृत किया जा सकता है । प्रत्येक लिम्फोसाइट प्रकार अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली में एक अलग भूमिका है; उदाहरण के लिए, बी लिम्फोसाइटों एंटीबॉडी का उत्पादन, जबकि टी लिम्फोसाइटों विशिष्ट एंटीजन का पता लगाने, असामान्य कोशिकाओं को खत्म करने, और बी लिम्फोसाइटों को विनियमित. लिम्फोसाइट समारोह और विनियमन कसकर द्वारा नियंत्रित और कैंसर1, स्व-प्रतिरक्षित रोग2, और वायरल संक्रमण3सहित विभिन्न रोगों से संबंधित है । इस प्रकार, लिम्फोसाइट प्रकार की पहचान के लिए इस तरह के रोगों में और क्लीनिक में immunotherapy के लिए अपनी pathophysiological भूमिकाओं को समझने के लिए महत्वपूर्ण है ।
वर्तमान में, लिम्फोसाइट प्रकार वर्गीकृत करने के लिए विधियाँ विशिष्ट सतह झिल्ली प्रोटीन या सतह मार्करों लक्ष्यीकरण द्वारा प्रतिजन-एंटीबॉडी प्रतिक्रियाओं पर निर्भर करते हैं4. लक्ष्यीकरण सतह मार्करों लिम्फोसाइट प्रकार निर्धारित करने के लिए एक सटीक और सटीक तरीका है । हालांकि, यह महंगा रिएजेंट और समय लेने वाली प्रक्रियाओं की आवश्यकता है । इसके अलावा, यह झिल्ली प्रोटीन संरचनाओं के संशोधन और सेलुलर कार्यों के परिवर्तन के जोखिम वहन करती है ।
इन चुनौतियों को दूर करने के लिए, यहां वर्णित प्रोटोकॉल 3 डी मात्रात्मक चरण इमेजिंग (QPI) और मशीन लर्निंग5का उपयोग कर लिम्फोसाइट प्रकारों की लेबल-मुक्त पहचान का परिचय देता है । यह विधि एकल-कक्ष स्तर पर लिम्फोसाइट प्रकार के वर्गीकरण को सक्षम करती है जो व्यक्तिगत लिम्फोसाइटों के लेबल-मुक्त 3d इमेजिंग से निकाली गई रूपात्मक जानकारी पर आधारित होती है. पारंपरिक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी तकनीक के विपरीत, QPI का उपयोग अपवर्तन सूचकांक (आरआई) वितरण (आंतरिक ऑप्टिकल गुण जीवित कोशिकाओं और ऊतकों) के रूप में ऑप्टिकल कंट्रास्ट6,7। व्यक्तिगत लिम्फोसाइटों के आरआई tomograms लिम्फोसाइटों के उपप्रकारों के लिए विशिष्ट phenotypic जानकारी का प्रतिनिधित्व करते हैं । इस मामले में, व्यक्तिगत लिम्फोसाइटों के 3d आरआई tomograms का उपयोग करने के लिए, एक पर्यवेक्षण मशीन अधिगम एल्गोरिथ्म का उपयोग किया गया प्रणालीबद्ध ।
विभिंन QPI तकनीकों का प्रयोग, 3 डी री कोशिकाओं की tomograms सक्रिय रूप से सेल pathophysiology के अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया गया है क्योंकि वे एक लेबल मुक्त, मात्रात्मक इमेजिंग क्षमता प्रदान8,9,10, 11,12,13. इसके अलावा, व्यक्तिगत कोशिकाओं के 3d आरआई वितरण कोशिकाओं के बारे में रूपात्मक, जैव रासायनिक, और यांत्रिक जानकारी प्रदान कर सकते हैं । 3d आरआई tomograms पहले रुधिर के खेतों में उपयोग किया गया है14,15,16,17, संक्रामक रोग18,19, 20, इम्यूनोलॉजी21, सेल जीव विज्ञान22,23, सूजन24, कैंसर25, तंत्रिका विज्ञान26,27, विकास जीव विज्ञान28, विषविज्ञान 29, और माइक्रोबायोलॉजी12,30,31,३२।
हालांकि 3d आरआई tomograms कोशिकाओं की विस्तृत रूपात्मक और जैव रासायनिक जानकारी प्रदान करते हैं, लिम्फोसाइट उपप्रकार के वर्गीकरण के लिए बस इमेजिंग 3 डी री tomograms5द्वारा प्राप्त करने के लिए मुश्किल है । व्यवस्थित और मात्रात्मक सेल प्रकार वर्गीकरण के लिए मापा 3d आरआई tomograms का दोहन करने के लिए, हम एक एल्गोरिथ्म सीखने की मशीन का उपयोग किया । हाल ही में, कई कार्यों में बताया गया है जिसमें कोशिकाओं के मात्रात्मक चरण छवियों विभिन्न मशीन लर्निंग एल्गोरिदम३३के साथ विश्लेषण किया गया, सूक्ष्मजीवों३४का पता लगाने सहित, जीवाणु जीनस३५ का वर्गीकरण , ३६, तेजी से और लेबल-एंथ्रेक्स बीजाणुओं का मुफ्त पता लगाने३७, शुक्राणु कोशिकाओं का स्वचालित विश्लेषण३८, कैंसर कोशिकाओं के विश्लेषण३९,४०, और मैक्रोफेज सक्रियण४१का पता लगाने ।
यह प्रोटोकॉल 3d QPI और मशीन लर्निंग का उपयोग करके व्यक्तिगत सेल स्तर पर लिम्फोसाइट प्रकारों की लेबल-मुक्त पहचान करने के लिए विस्तृत कदम प्रदान करता है । यह भी शामिल है: 1) माउस रक्त से लिम्फोसाइट अलगाव, 2) लिम्फोसाइट प्रवाह cytometry के माध्यम से छंटाई, 3) 3 डी QPI, 4) 3 डी आरआई tomograms से मात्रात्मक सुविधा निष्कर्षण, और 5) लिम्फोसाइट प्रकार की पहचान के लिए सीखने की निगरानी की ।
हम एक प्रोटोकॉल है कि 3 डी मात्रात्मक चरण इमेजिंग और मशीन सीखने का दोहन लिम्फोसाइट प्रकार के लेबल से मुक्त पहचान को सक्षम बनाता है प्रस्तुत करते हैं । इस प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण चरणों मात्रात्मक चरण इ?…
The authors have nothing to disclose.
यह काम KAIST BK21 + प्रोग्राम, Tomocube, इंक, और कोरिया के नेशनल रिसर्च फाउंडेशन (2015R1A3A2066550, 2017M3C1A3013923, 2018K000396) द्वारा समर्थित था । Y. जो KAIST राष्ट्रपति फैलोशिप और आासान फाउंडेशन जैव चिकित्सा विज्ञान छात्रवृत्ति से समर्थन स्वीकार करता है ।
Mouse | Daehan Biolink | C57BL/6J mice | gender and age-matched, 6 – 8 weeks |
Falcon conical centrifuge tube | ThermoFisher Scientific | 14-959-53A | 15 mL |
Phosphate-buffered saline | Sigma-Aldrich | 806544-500ML | |
Ammonium-chloride-potassium lysing buffer | ThermoFisher Scientific | A1049201 | |
RPMI-1640 medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
Fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | 10438018 | |
Antibody | BD Biosciences | 553140 (RRID:AB_394655) | CD16/32 (clone 2.4G2) |
Antibody | BD Biosciences | 555275 (RRID:AB_395699) | CD3ε (clone 17A2) |
Antibody | Biolegnd | 100734 (RRID:AB_2075238) | CD8α (clone 53-6.7) |
Antibody | BD Biosciences | 557655 (RRID:AB_396770) | CD19 (clone 1D3) |
Antibody | BD Biosciences | 557683 (RRID:AB_396793) | CD45R/B220 (clone RA3-6B2) |
Antibody | BD Biosciences | 552878 (RRID:AB_394507) | NK1.1 (clone PK136) |
Antibody | eBioscience | 11-0041-85 (RRID:AB_464893) | CD4 (clone GK1.5) |
DAPI | Roche | 10236276001 | 4,6-diamidino-2-phenylindole |
Flow cytometry | BD Biosciences | Aria II or III | |
Imaging chamber | Tomocube, Inc. | TomoDish | |
Holotomography | Tomocube, Inc. | HT-1H | |
Holotomography imaging software | Tomocube, Inc. | TomoStudio | |
Image professing software | MathWorks | Matlab R2017b |