Vi beskriver ett protokoll för etikett-fri identifiering av lymfocyter subtyper använder kvantitativa fas imaging och en algoritm för maskininlärning. Mätningar av 3D brytningsindex tomograms av lymfocyter presentera 3D morfologiska och biokemiska information för enskilda celler, som sedan analyseras med en maskininlärning algoritmen för identifiering av celltyper.
Här beskriver vi ett protokoll för etikett-fri identifiering av lymfocyter subtyper använder kvantitativa fas imaging och maskininlärning. Identifiering av lymfocyter subtyper är viktigt för studien av immunologi samt diagnos och behandling av olika sjukdomar. För närvarande, lita standardiserade metoder för klassificering av lymfocyter typer på märkning specifika membranproteiner via antigen-antikroppsreaktioner. Dock utföra dessa märkning tekniker de potentiella riskerna med att ändra cellulära funktioner. Protokollet beskrivs här övervinner dessa utmaningar genom att utnyttja inneboende optiska kontraster mätt med 3D kvantitativa fas imaging och en algoritm för maskininlärning. Mätning av 3D brytningsindex (RI) tomograms av lymfocyter ger kvantitativ information om 3D morfologi och fenotyper av enskilda celler. De biofysiska parametrar extraheras från den uppmätta 3D RI tomograms analyseras sedan kvantitativt med en maskin lärande algoritm, möjliggör etikett-fri identifiering av lymfocyter typer på en enskild cell-nivå. Vi mäter den 3D RI tomograms av B, T CD4 + och CD8 + T-lymfocyter och identifierat deras celltyper med över 80% noggrannhet. I detta protokoll beskriver vi de detaljerade anvisningarna för lymfocyter isolering, 3D kvantitativa fas imaging och maskininlärning för att identifiera lymfocyter typer.
Lymfocyter kan delas in i olika subtyper inklusive B, helper (CD4 +) T, cytotoxiska (CD8 +) T och regulatoriska T celler. Varje typ av lymfocyter har en annan roll i det adaptiva immunsystemet; till exempel producerar B-lymfocyter antikroppar, medan T-lymfocyter upptäcka specifika antigener, eliminera onormala celler och reglera B-lymfocyter. Lymfocyter funktion och reglering är tätt kontrolleras av och relaterade till olika sjukdomar inklusive cancer1, autoimmuna sjukdomar2och virusinfektioner3. Identifiering av lymfocyter typer är därför viktigt att förstå deras patofysiologiska roller i sådana sjukdomar och för immunterapi i kliniker.
För närvarande beroende metoder för klassificering av lymfocyter typer antigen-antikroppsreaktioner genom att rikta specifika ytan membranproteiner eller yta markörer4. Inriktning yta markörer är en exakt och noggrann metod för att bestämma lymfocyter typer. Det kräver dock dyra reagenser och tidskrävande förfaranden. Dessutom medför det risker för ändring av protein membranstrukturer och förändringen av cellulära funktioner.
För att övervinna dessa utmaningar, införs i protokollet som beskrivs här etikett-fri identifiering av lymfocyter typer som använder 3D kvantitativa fas imaging (QPI) och machine learning-5. Denna metod möjliggör klassificering av lymfocyter typer på en enskild cell nivå baserat på morfologiska informationsutdrag från etikett-gratis 3D imaging av enskilda lymfocyter. Till skillnad från konventionella fluorescence mikroskopi tekniker använder QPI brytningsindex (RI) distributioner (inneboende optiska egenskaper av levande celler och vävnader) som optiska kontrast6,7. De RI tomograms av enskilda lymfocyter utgör fenotypiska information specifik för subtyper av lymfocyter. I det här fallet för att systemiskt utnyttja 3D RI tomograms av enskilda lymfocyter, utnyttjades en övervakad dator lärande algoritm.
Använda olika QPI tekniker, de 3D RI tomograms celler har aktivt använts för studier av cell patofysiologi eftersom de ger en etikett-fri, kvantitativa imaging kapacitet8,9,10, 11,12,13. Också, de 3D RI-distributionerna av enskilda celler kan ge morfologiska, biokemiska och biomekaniska information om celler. 3D RI tomograms använts tidigare inom hematologi14,15,16,17, infektionssjukdomar18,19, 20, immunologi21, cellbiologi22,23, inflammation24, cancer25, neurovetenskap26,27, utvecklingsbiologi28, toxikologi 29och mikrobiologi12,30,31,32.
Även om 3D RI tomograms ger detaljerad information om morfologiska och biokemiska celler, är klassificering av lymfocyter subtyper svårt att uppnå genom att helt enkelt imaging 3D RI tomograms5. Kvantitativt och systematiskt utnyttja den uppmätta 3D RI tomograms för klassificeringen av cellen, utnyttjade vi en maskin lärande algoritm. Nyligen, flera verk har rapporterats i vilka kvantitativa fasen analyserades bilder av celler med olika maskininlärning algoritmer33, inklusive upptäckt av mikroorganismer34, klassificering av bakteriesläkte35 , 36, etikett-gratis och snabb påvisande av mjältbrand sporer37, automatiserad analys av spermacellerna38, analys av cancer celler39,40, och upptäckt av makrofag aktiveringen41.
Detta protokoll ger detaljerade steg för att utföra etikett-fri identifiering av lymfocyter typer på enskild cellnivå använder 3D QPI och maskininlärning. Detta omfattar: (1) lymfocyter isolering från mus blod, 2) lymfocyter sortering via flöde flödescytometri, 3) 3D QPI, 4) kvantitativa funktionen utvinning från 3D RI tomograms och 5) övervakade lärande för att identifiera lymfocyter typer.
Vi presenterar ett protokoll som möjliggör etikett-fri identifiering av lymfocyter typer att utnyttja 3D kvantitativa fas imaging och maskininlärning. Kritiska steg i detta protokoll är kvantitativa fas imaging och funktionen urval. För den optimala holographic imaging kontrolleras tätheten av celler enligt ovan. Mekanisk stabilitet av cellerna är också viktigt att få en exakt 3D RI distribution eftersom flytande eller vibrerande cellulära motioner kommer att störa hologram mätningar vid belysning vinkel för…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöds av den KAIST BK21 + Program, Tomocube, Inc., och National Research Foundation Korea (2015R1A3A2066550, 2017M3C1A3013923, 2018K 000396). Y. Jo erkänner stöd från KAIST Presidential gemenskap och Asan Foundation biomedicinsk vetenskap stipendium.
Mouse | Daehan Biolink | C57BL/6J mice | gender and age-matched, 6 – 8 weeks |
Falcon conical centrifuge tube | ThermoFisher Scientific | 14-959-53A | 15 mL |
Phosphate-buffered saline | Sigma-Aldrich | 806544-500ML | |
Ammonium-chloride-potassium lysing buffer | ThermoFisher Scientific | A1049201 | |
RPMI-1640 medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
Fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | 10438018 | |
Antibody | BD Biosciences | 553140 (RRID:AB_394655) | CD16/32 (clone 2.4G2) |
Antibody | BD Biosciences | 555275 (RRID:AB_395699) | CD3ε (clone 17A2) |
Antibody | Biolegnd | 100734 (RRID:AB_2075238) | CD8α (clone 53-6.7) |
Antibody | BD Biosciences | 557655 (RRID:AB_396770) | CD19 (clone 1D3) |
Antibody | BD Biosciences | 557683 (RRID:AB_396793) | CD45R/B220 (clone RA3-6B2) |
Antibody | BD Biosciences | 552878 (RRID:AB_394507) | NK1.1 (clone PK136) |
Antibody | eBioscience | 11-0041-85 (RRID:AB_464893) | CD4 (clone GK1.5) |
DAPI | Roche | 10236276001 | 4,6-diamidino-2-phenylindole |
Flow cytometry | BD Biosciences | Aria II or III | |
Imaging chamber | Tomocube, Inc. | TomoDish | |
Holotomography | Tomocube, Inc. | HT-1H | |
Holotomography imaging software | Tomocube, Inc. | TomoStudio | |
Image professing software | MathWorks | Matlab R2017b |