يمكننا وصف بروتوكول لتحديد الأنواع الفرعية اللمفاويات باستخدام تصوير المرحلة الكمية وخوارزميه تعلم آلة خالية من التسمية. قياسات توموجرامس 3D الانكسار من الخلايا الليمفاوية يقدم معلومات ثلاثية الأبعاد المورفولوجية والبيوكيميائية للخلايا الفردية، التي ثم يتم تحليل خوارزمية التعلم الآلي للتعرف على أنواع الخلايا.
يصف لنا هنا بروتوكولا لتحديد الأنواع الفرعية اللمفاويات باستخدام تصوير المرحلة الكمية وآله التعلم خالية من التسمية. تحديد أنواع فرعية اللمفاويات مهم لدراسة علم المناعة، فضلا عن تشخيص وعلاج الأمراض المختلفة. حاليا، تعتمد الأساليب القياسية لتصنيف أنواع اللمفاويات على وسم البروتينات الغشاء محددة عن طريق التفاعلات ضد مستضد. ومع ذلك، هذه التقنيات وصفها تحمل المخاطر المحتملة لتغيير الوظائف الخلوية. البروتوكول هو موضح هنا يتغلب على هذه التحديات عن طريق استغلال التناقضات البصرية الجوهرية تقاس بتصوير ثلاثي الأبعاد الكمية المرحلة وخوارزميه آلة تعلم. قياس الانكسار 3D (RI) توموجرامس من الخلايا الليمفاوية معلومات كمية عن مورفولوجيا 3D وتعمل الخلايا الفردية. ثم يتم تحليل البارامترات الفيزيائية المستخرجة من توموجرامس ري 3D قياس كمي مع خوارزمية تعلم جهاز، مما يتيح تحديد أنواع اللمفاويات على مستوى خلية واحدة خالية من التسمية. قياس توموجرامس ري 3D من الخلايا اللمفية CD4 + T ب و CD8 + T، والتعرف على أنواع الخلايا مع أكثر من 80% الدقة. في هذا البروتوكول، يصف لنا الخطوات التفصيلية لعزل الخلايا اللمفاوية، وتصوير ثلاثي الأبعاد الكمية المرحلة، وآله التعلم لتحديد أنواع اللمفاويات.
ويمكن تصنيف الخلايا الليمفاوية إلى أنواع فرعية مختلفة بما في ذلك ب، مساعد التائية (CD4 +) والسامة للخلايا (CD8 +) تي تي التنظيمية الخلايا. يحتوي كل نوع اللمفاويات على دوراً مختلفاً في النظام المناعي التكيفي؛ على سبيل المثال، تنتج الخلايا الليمفاوية ب الأجسام المضادة، بينما لمفاوية T كشف المستضدات محددة والقضاء على الخلايا غير الطبيعية، وتنظيم الخلايا الليمفاوية ب. وظيفة اللمفاويات وتنظيم محكم يسيطر عليها والمتعلقة بمختلف الأمراض بما فيها السرطان1،2من أمراض المناعة الذاتية، والعدوى الفيروسية3. وبالتالي، من المهم تحديد أنواع اللمفاويات على فهم أدوارهم الفيزيولوجية المرضية في مثل هذه الأمراض والعلاج المناعي في العيادات.
حاليا، تعتمد أساليب لتصنيف أنواع اللمفاويات على التفاعلات ضد مستضد باستهداف البروتينات الغشاء السطحي محددة أو علامات السطح4. استهداف علامات السطحية طريقة دقيقة ودقيقة لتحديد أنواع اللمفاويات. ومع ذلك، فإنه يتطلب الكواشف باهظة الثمن وإجراءات تستغرق وقتاً طويلاً. وعلاوة على ذلك، فإنه ينطوي على مخاطر تعديل الهياكل بروتين الغشاء وتحوير الوظائف الخلوية.
للتغلب على هذه التحديات، يدخل البروتوكول الموصوفة هنا تحديد أنواع اللمفاويات باستخدام المرحلة الكمية 3D التصوير (كبي) وآله التعلم5خالية من التسمية. هذا الأسلوب يتيح لتصنيف أنواع اللمفاويات على مستوى خلية واحدة استناداً إلى الخصائص المورفولوجية المعلومات المستخرجة من تصوير 3D تسمية خالية من الخلايا الليمفاوية الفردية. خلافا لتقنيات الفحص المجهري الفلورية التقليدية، يستخدم قبي الانكسار (RI) توزيعات (الخصائص البصرية الأصيلة للخلايا الحية والأنسجة) كالتباين الضوئي6،7. وتمثل توموجرامس ري من الخلايا الليمفاوية الفردية المظهرية معلومات محددة لأنواع فرعية من الخلايا الليمفاوية. وفي هذه الحالة، عناصره استخدام 3D توموجرامس ري من الخلايا الليمفاوية الفردية، استخدم خوارزمية تعلم تحت إشراف جهاز.
باستخدام تقنيات مختلفة كبي، توموجرامس ري 3D للخلايا بنشاط استخدمت لدراسة الخلية الفيزيولوجيا المرضية لأنها توفر تسمية مجاناً، كمية التصوير قدرة8،،من910، 11،،من1213. أيضا، يمكن أن توفر توزيعات ري 3D من خلايا فردية المورفولوجية والكيميائية الحيوية والنشاط الحيوي من المعلومات حول الخلايا. 3D ري توموجرامس قد استخدمت سابقا في مجالات أمراض الدم14،15،،من1617،18،الأمراض المعدية19، 20، علم المناعة21، خلية علم الأحياء22،23، التهاب24، السرطان25، علم الأعصاب26،27، علم الأحياء التنموي28، وعلم السموم 29، وعلم الأحياء الدقيقة12،30،،من3132.
على الرغم من أن 3D ري توموجرامس توفير معلومات تفصيلية المورفولوجية والبيوكيميائية للخلايا، أمر يصعب تحقيقه ببساطة التصوير 3D توموجرامس ري5تصنيف الأنواع الفرعية اللمفاويات. منهجياً وكمياً استغلال توموجرامس ري 3D قياس لتصنيف نوع الخلية، ونحن تستخدم خوارزمية تعلم آلة. في الآونة الأخيرة، عدة أعمال أفيد في المرحلة الكمية التي تم تحليل صور خلايا مع مختلف آلة التعلم خوارزميات33، بما في ذلك الكشف عن الكائنات الحية الدقيقة34، تصنيف جنس البكتيرية35 , الآلي 36، الكشف السريع وخاليا من جراثيم الجمرة الخبيثة37، تحليل الخلايا المنوية38، وتحليل لسرطان خلايا39،40، والكشف عن التنشيط بلعم41.
يوفر هذا البروتوكول خطوات تفصيلية القيام بتحديد أنواع اللمفاويات على مستوى الخلية الفردية باستخدام 3D كبي وآله التعلم خالية من التسمية. وهذا يشمل: 1) اللمفاويات في معزل عن الدم الماوس وفرز الخلايا اللمفاوية 2) عن طريق التدفق الخلوي، كبي 3) ثلاثي الأبعاد، استخراج ميزة 4) كمية من 3D ري توموجرامس والتعلم 5) تحت إشراف لتحديد أنواع اللمفاويات.
نقدم بروتوكول التي تمكن من تحديد أنواع اللمفاويات استغلال المرحلة الكمية 3D تصوير وآله التعلم خالية من التسمية. الخطوات الأساسية لهذا البروتوكول تصوير وميزة اختيار المرحلة الكمية. للتصوير المجسم الأمثل، ينبغي أن تتم مراقبة كثافة الخلايا كما هو موضح أعلاه. الاستقرار الميكانيكي للخلايا مه…
The authors have nothing to disclose.
أيد هذا العمل الكوري BK21 + البرنامج, توموكوبي, Inc.، والوطنية بحوث مؤسسة كوريا (2015R1A3A2066550, 2017M3C1A3013923, 2018 ك 000396). يوسف جو تسلم الدعم من الزمالات الرئاسي الكوري واسان منحة العلوم الطبية الحيوية.
Mouse | Daehan Biolink | C57BL/6J mice | gender and age-matched, 6 – 8 weeks |
Falcon conical centrifuge tube | ThermoFisher Scientific | 14-959-53A | 15 mL |
Phosphate-buffered saline | Sigma-Aldrich | 806544-500ML | |
Ammonium-chloride-potassium lysing buffer | ThermoFisher Scientific | A1049201 | |
RPMI-1640 medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
Fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | 10438018 | |
Antibody | BD Biosciences | 553140 (RRID:AB_394655) | CD16/32 (clone 2.4G2) |
Antibody | BD Biosciences | 555275 (RRID:AB_395699) | CD3ε (clone 17A2) |
Antibody | Biolegnd | 100734 (RRID:AB_2075238) | CD8α (clone 53-6.7) |
Antibody | BD Biosciences | 557655 (RRID:AB_396770) | CD19 (clone 1D3) |
Antibody | BD Biosciences | 557683 (RRID:AB_396793) | CD45R/B220 (clone RA3-6B2) |
Antibody | BD Biosciences | 552878 (RRID:AB_394507) | NK1.1 (clone PK136) |
Antibody | eBioscience | 11-0041-85 (RRID:AB_464893) | CD4 (clone GK1.5) |
DAPI | Roche | 10236276001 | 4,6-diamidino-2-phenylindole |
Flow cytometry | BD Biosciences | Aria II or III | |
Imaging chamber | Tomocube, Inc. | TomoDish | |
Holotomography | Tomocube, Inc. | HT-1H | |
Holotomography imaging software | Tomocube, Inc. | TomoStudio | |
Image professing software | MathWorks | Matlab R2017b |