Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

ללא תווית זיהוי של לימפוציטים יחוברו באמצעות הדמיה תלת פאזה כמותית, מכונת למידה

doi: 10.3791/58305 Published: November 19, 2018

Summary

אנו מתארים פרוטוקול לצורך זיהוי ללא תווית לימפוציט יחוברו באמצעות הדמיה שלב כמותיים באלגוריתם למידה חישובית. מדידות של-tomograms השבירה תלת-ממד של לימפוציטים להציג נתוני תלת-ממד מורפולוגי וביוכימי לתאים בודדים, אשר לאחר מכן ניתוח עם מכונת-learning אלגוריתם זיהוי סוגי תאים.

Abstract

נתאר כאן פרוטוקול לצורך זיהוי ללא תווית לימפוציט יחוברו באמצעות הדמיה כמותיים שלב למידה חישובית. זיהוי של סוגי לימפוציטים חשוב בחקר ואימונולוגיה וכן אבחון וטיפול במחלות שונות. כיום, בשיטות הרגילות לסיווג סוגי לימפוציטים להסתמך על תיוג חלבונים קרום ספציפי באמצעות תגובות אנטיגן-נוגדן. עם זאת, שיטות אלה תיוג לשאת הסיכונים הפוטנציאליים של סירוס ועיקור תאיים. הפרוטוקול המתואר כאן מתגבר על האתגרים הללו על ידי ניצול מהותי ניגודים אופטי נמדד על ידי הדמיה תלת פאזה כמותיים באלגוריתם למידה חישובית. מדידה של תלת-ממד מקדם שבירה (RI) tomograms של לימפוציטים מספק מידע כמותי אודות פנוטיפים של תאים בודדים ומורפולוגיה תלת-ממד. הפרמטרים biophysical מופק את tomograms רי 3D נמדד מכן נותחו באופן כמותי עם מכונת למידה אלגוריתם, הפעלת ללא תווית זיהוי סוגי לימפוציטים ברמה תא בודד. אנחנו מודדים את tomograms רי תלת-ממד של לימפוציטים B, CD4 + T ו CD8 + T ומזוהה שלהם סוגי תאים עם למעלה מ- 80% דיוק. ב פרוטוקול זה, אנו מתארים את השלבים המפורטים לימפוציט בידוד, הדמיה תלת-ממד שלב כמותית של למידה חישובית לזיהוי סוגי לימפוציטים.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

לימפוציטים ניתן לסווג תת השונים לרבות B, המסייע (CD4 +) T, ציטוטוקסיות (CD8 +) T ו- T רגולטורי תאים. לכל סוג של לימפוציט יש תפקיד אחר במערכת החיסון מסתגלת; לדוגמה, B לימפוציטים לייצר נוגדנים, ואילו לימפוציטים מסוג T לזהות אנטיגנים ספציפיים, לחסל תאים חריגים, לווסת B לימפוציטים. לימפוציט פונקציית רגולציה בחוזקה בשליטת ויש הקשורים במחלות שונות, כולל סרטן1, מחלות אוטואימוניות2זיהומים נגיפיים3. לפיכך, זיהוי סוגי לימפוציטים חשוב להבין תפקידיהם pathophysiological במחלות כגון ועבור חיסוני במרפאות.

כיום, שיטות לסיווג סוגי לימפוציטים להסתמך על תגובות אנטיגן-נוגדן על ידי מיקוד חלבוני ממברנה משטח מסוים או סמני פני שטח4. פילוח סמני פני השטח היא שיטה מדויקת כדי לקבוע סוגי לימפוציטים. עם זאת, זה דורש ריאגנטים יקר ונהלים גוזלת זמן. יתר על כן, הוא נושא הסיכונים של השינוי של מבנה החלבונים ממברנה משינוי של פונקציות הסלולר.

כדי להתגבר על האתגרים הללו, הפרוטוקול המתואר כאן מציג ללא תווית זיהוי סוגי לימפוציטים שלב כמותיים 3D הדמיה (ה-QPI) באמצעות מכונת למידה5. שיטה זו מאפשרת את סיווג סוגי לימפוציטים ברמה תא בודד בהתבסס על מידע מורפולוגי מופק ללא תווית הדמיה ממוחשבת של לימפוציטים בודדים. בניגוד קונבנציונאלי פלורסצנטיות טכניקות במיקרוסקופ, ה-QPI מנצל הפצות מקדם שבירה (RI) (מהותי התכונות האופטיות של תאים חיים ורקמות) כמו ניגודיות אופטי6,7. Tomograms רי של לימפוציטים בודדים מייצגים פנוטיפי מידע ספציפי יחוברו של לימפוציטים. במקרה זה, לנצל מערכתית tomograms רי תלת-ממד של לימפוציטים בודדים, אלגוריתם הלמידה המכונה תחת פיקוח היה מנוצל.

תוך שימוש בטכניקות שונות של ה-QPI, tomograms רי תלת-ממד של תאים באופן פעיל שימשו לחקר התא פתופסיולוגיה משום שהם מספקים ללא תווית, כמותיים הדמיה יכולת8,9,10, 11,12,13. בנוסף, חלוקות RI תלת-ממד של תאים בודדים יכול לספק מידע מורפולוגי, ביוכימי, ביו-מכני על תאי. Tomograms רי 3D כבר נעזרו בעבר בתחומי המטולוגיה14,15,16,17, מחלות זיהומיות18,19, 20, אימונולוגיה21, תא ביולוגיה22,23, דלקת24, סרטן25, מדעי המוח26,27, ביולוגיה התפתחותית28, טוקסיקולוגיה 29, מיקרוביולוגיה12,30,31,32.

למרות tomograms רי 3D לספק מידע מורפולוגי וביוכימי מפורט של תאים, הסיווג של לימפוציטים יחוברו קשה להשיג על-ידי פשוט הדמיה תלת-ממדית RI tomograms5. לנצל באופן שיטתי, באופן כמותי את tomograms רי 3D נמדד עבור סיווג סוג תא, אנחנו מנוצל באלגוריתם מכונת למידה. לאחרונה, יצירות אחדות דווח בשלב כמותיים אשר נותחו תמונות של תאים עם מכונת שונים לימוד אלגוריתמים33, כולל הגילוי של מיקרואורגניזמים34, סיווג של חיידקים סוג35 , 36, זיהוי מהיר, ללא תווית של נבגי אנתרקס37, אוטומטי ניתוח של תאי זרע38, ניתוח של סרטן תאים39,40, זיהוי של הפעלת מקרופאג41.

פרוטוקול זה מספק שלבים מפורטים לביצוע ללא תווית זיהוי סוגי לימפוציטים ברמת תא בודד באמצעות ה-QPI 3D ולמידה ממוחשבת. זה כולל: 1) לימפוציט בידוד מן העכבר דם, 2) לימפוציט מיון באמצעות זרימת cytometry, 3) תלת-ממד ה-QPI, 4) כמותית הדמיה של תלת-ממד tomograms רי ו 5) תחת פיקוח למידה לצורך זיהוי סוגי לימפוציטים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

טיפול בבעלי חיים ונהלים ניסיוני בוצעו תחת האישור של הדאגה חיה מוסדיים שימוש הוועדה של KAIST (KA2010-21 KA2014-01, KA2015-03). כל הניסויים במחקר זה בוצעו בהתאם להנחיות שאושרו.

1. לימפוציט בידוד מהדם העכבר

  1. ברגע עכבר C57BL/6J הוא מורדמים באמצעות אינהלציה2 CO, להכניס מחט 26-G העכבר הלב ולאסוף 0.3 מ של דם. ישירות את הדם לתוך צינור עם 100 U/mL הפארין הפתרון מדולל עם 1 מ ל תמיסת באגירה פוספט (PBS).
    הערה: לחלופין, לימפוציטים מן הטחול יכול להיות מבודדים.
  2. Centrifuge את הצינור ב g x 400 דקות 5-4 מעלות צלזיוס.
  3. להוסיף 0.5 מ של מאגר lysing אמוניום כלוריד-אשלגן הצינור, בעדינות היפוך זה כמה פעמים כדי לערבב את הפתרון.
  4. דגירה הצינור בטמפרטורת החדר (RT) במשך 5 דקות.
  5. לשטוף את התאים על ידי הוספת 4.5 מ של PBS ו צריך שתוציאו ב g x 400 דקות 5-4 ° C, פעמיים.
  6. הסר את תגובת שיקוע ולאחר resuspend בגדר תא ב- 100 µL בינוני RPMI-1640 טריים עם 10% סרום שור עוברית (FBS).
  7. להוסיף µg 0.1 של נוגדן CD16/32 (2.4G2) הצינורית לצורך חסימת.
  8. שמור את הצינורית על קרח.

2. לזרום Cytometry ומיון של לימפוציטים תת

הערה: מיון לימפוציטים בהתאם לסוג התא הוא הכרחי לביסוס התא הקרקע-האמת (קרי, הנכונה) הקלד תוויות הרכבת ולבדוק מסווג סוג התא בלמידה תחת פיקוח. Cytometry זרימה, שיטת תקן הזהב, משמש כדי לזהות ולהפריד בין לימפוציטים42.

  1. להכין תערובת של סמן משטח מכתים נוגדנים ב 100 µL בינוני RPMI-1640 טריים [עם 10% FBS, 0.1 µg של CD3e (17A2), CD8a (53-6.7), CD19 (ד 1 3), CD45R (B220, RA3-6B2), ו- NK1.1 (PK136)], µg 0.25 של נוגדנים יעד B, CD4 + T ו CD8 + T CD4 (GK1.5) לימפוציטים.
  2. להוסיף 100 µL של תערובת נוגדן התליה תא (שהושג בשלב 1.8).
  3. תקופת דגירה של 25 דקות על קרח.
  4. לשטוף את התאים על ידי הוספת 5 מ של PBS ו צריך שתוציאו ב g x 400 דקות 5-4 ° C, פעמיים.
  5. Resuspend בגדר תא ב 5 מ של טרי RPMI-1640 בינוני עם 10% FBS ו- 2.5 µg של דאפי (4', 6-diamidino-2-phenylindole).
  6. לאסוף את כל סוג של לימפוציט בנפרד עם cytometry זרימה באמצעות רמות קרינה פלואורסצנטית סמני שתוארו לעיל. במקביל לכלול תאים מתים באמצעות על דאפי האותות.
    הערה: פרוטוקולים מפורט לגבי זרימת מיון מבוססי cytometry תא היה שתואר לעיל42.

3. תלת פאזה כמותיים הדמיה

  1. שמור לימפוציטים הממוינים על קרח לאורך כל ההליכים הדמיה, אשר אמורה להסתיים בתוך 5 שעות (מאז לימפוציט בידוד מן העכבר) כדי למנוע נזק לתאים והשינויים הביוכימי.
  2. בחר סוג תאים ממוינים (בין לימפוציטים B, CD4 + T ו CD8 + T) ו לדלל את הדגימה (שהושג בשלב 2.6) כדי 180 תאים µL RPMI בינונית למצב הדמיה אופטימלית (קרי, תא אחד לכל יחידה שדה-of-view).
  3. לטעון μL 120 המדגם מדולל לתוך חדר הדמיה באמצעות הזרקת איטי. בדוק ביסודיות על הנוכחות של בועות בבית הבליעה הדמיה עם הדוגמה. אם יש בועות, בזהירות להסיר אותם, כפי שהם תסכן את האיכות של המדידות.
  4. רוכשים 3D tomograms רי שימוש מסחרי 3D כמותיים שלב מיקרוסקופ, או holotomography, והתוכנה ההדמיה שלה.
    הערה: ניתן למצוא מידע מפורט אודות הגדרת הניסוי כתב היד המקורי5.
    1. המקום טיפה של מים מזוקקים על גבי העדשה המטרה של המיקרוסקופ.
    2. במקום לחדר ההדמיה עם הדגימה על השלב תרגום של המיקרוסקופ ולהתאים את מיקומו כך המדגם יתיישר עם העדשה המטרה.
    3. להתאים את העמדות צירית של עדשות אובייקטיבית, מעבה על-ידי לחיצה על המוקד של פני השטח, בהתאמה, בכרטיסיה "כיול" המבט "מיקרוסקופ" של תוכנת הדמיה.
    4. יישר את העדשות אובייקטיבית, מעבה בלחיצה על מצב אוטומטי. לחלופין, השתמש במצב סריקה ולאחר להתאים ידנית את העדשות כך הדפוסים תאורה מותאמים על האזור המרכזי של השדה-of-view.
    5. לחזור למצב רגיל ולהתאים את הבמה תרגום לאתר תא השדה-of-view.
    6. למצוא את המטוס מוקד על ידי התאמת המיקום צירית של העדשה אובייקטיבי. התמקדות מושלם הופך לגבול מדגם דמיינו במסך כמעט בלתי נראה.
    7. התאם את הבמה תרגום למצוא במיקום ללא תא.
    8. לחץ על כיול למדוד הולוגרמות 2D מרובים עם זוויות שונות של תאורה.
    9. התאם את הבמה תרגום לאתר תא במרכזו של השדה-of-view.
    10. לעבור ללשונית "רכישת" ולחץ על תמונת תלת-ממד כדי למדוד את הולוגרמות של התא עם הזוויות תאורה זהים כפי שנעשה צעד 3.4.8.
    11. כאשר הנתונים שהושגו מוצג בלוח 'ניהול נתונים', לחץ לחיצה ימנית על הנתונים שהושגו ולחץ על תהליך לבנייה מחדש של tomogram רי 3D מ הולוגרמות נמדד בשלבים 3.4.8 ו 3.4.10, באמצעות האלגוריתם טומוגרפיה עקיפה 9 , 10 מיושמת בתוכנת הדמיה.
    12. חזור על צעדים 3.4.5-3.4.11 למדוד יותר מ-100 תאים כדי להבטיח עוצמה סטטיסטית עבור למידה חישובית.
    13. כל התמונות המעובדות דרך השלב 3.4.11. ניתן לאבחן. בלוח "ניהול נתונים", לחץ לחיצה ימנית את הנתונים, לחץ על פתח כדי להמחיש את הנתונים. לחץ על רי Tomogram על הלוח "נתוני מנהל". בכרטיסיה "מראש", לחץ על טען, לחץ פעמיים על "lymphocyte.xml", אשר היא פונקציה העברה מראש הניתנים על ידי תוכנת הדמיה כדי להמחיש את tomogram על פי חלוקות RI תלת-ממד.
  5. חזור על שלבים 3.2-3.4 למדוד 3D RI tomograms של כל סוגי לימפוציטים.

4. כמותיים מורפולוגי וביוכימי הדמיה של רי 3D Tomograms

  1. מקם כל הנתונים טומוגרפי נמדד מעל בתיקיה אחת. לפצל את סוגי תאים בתיקיות המשנה של תיקיה זו. להכין את כל tomogram להיות קובץ יחיד .mat .
  2. פתח את קובץ משלים 1 - הדמיה (שנכתב עבור תמונה בתוכנת עיבוד).
  3. ערוך קו 14 כדי לייעד את התיקייה tomogram מוכן בשלב 4.1.
  4. ערוך קו 15 כדי לייעד תיקיה כדי לשמור את הנתונים שחולצו תכונה.
  5. לחלופין, ערוך קו 17 כדי להתאים את הפרמטרים הסף RI עבור הדמיה. אפשרות ברירת המחדל היא 20 ספי רי מ 1.378 1.340, עם תוספת קבועה של 0.002 כפי שתואר לעיל5.
  6. הפעל את הקוד. עבור כל tomogram ב- dataset, הקוד מחשבת חמש תכונות: פני שטח (SA), תאי אחסון (CV), sphericity (SI), חלבון צפיפות (PD) ו יבש מסה (DM), לכל סף RI. האלגוריתמים מפורט לחילוץ תכונה מתוארים במקום5.
  7. על מנת לפקח על הדמיה, במהלך הביצוע בדוק על המסך להמחיש פילוח המבוסס על הסף תא רי.
  8. לבדוק הנתונים שחולצו תכונה, כמו קובץ .mat לכל tomogram, נשמר בתיקיה המיועד בשלב 4.4.

5. פיקוח למידה וזיהוי

  1. באופן אקראי ולפצל את הנתונים בתכונה שהושג בערכות צעד 4.8 הדרכה (70%) ובדיקה (30%) עם תיקיות נפרדות.
  2. פתוח 2 הקבצים המשלימים - הרכבת (נכתב עבור תמונה בתוכנת עיבוד).
  3. ערוך קו 14 כדי לייעד את ערכת הדרכה מוכן בשלב 5.1.
  4. ערוך קו 16 כדי לייעד תיקיה לשמור את המסווג מיומן.
  5. ערוך קו 17 כדי להגדיר שם קובץ עבור המסווג.
  6. לחלופין, ערוך קו 19 כדי לבחור את התכונות לאימונים. אפשרות ברירת המחדל, כפי שצוין קודם לכן5, נעשה שימוש כדי להשיג את התוצאות נציג להלן.
  7. הפעל את הקוד. באמצעות תכונות נבחרות של ערכת הדרכה, הקוד רכבות מסווג עם k-הקרוב שכן אלגוריתם (k -NN; ג = 4) ושומר את המסווג (כמו בשם בשלב 5.5) בתיקיה המיועד בשלב 5.4.
  8. בדוק על המסך להמחיש את הביצועים המסווג ודיוק קרוס-אימות.
  9. באופן אופציונלי, הרכבת מסווגים מרובים עם שילובים תכונה שונה על-ידי חזרה על צעדים 5.5-5.7. לאחר מכן, בחר את המסווג עם הצלב-אימות הדיוק הגבוה ביותר.
  10. פתח את 3 הקבצים המשלימים - מבחן (נכתב עבור תמונה בתוכנת עיבוד).
  11. ערוך שורות 14-15 כדי לייעד את המסווג מיומן להיבדק.
  12. ערוך קו 17 כדי לייעד את ערכת המבחן מוכן בשלב 5.1.
  13. הפעל את הקוד. המסווג שתוארו לעיל מזהה את סוגי תאים לימפוציטים בודדים בערכת הבדיקה.
  14. בדוק על המסך להמחיש את ביצועי זיהוי ודיוק הבדיקה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

איור 1 מראה תהליך סכמטי של פרוטוקול כולו. באמצעות ההליך המובאת כאן, בודדנו B (n = 149), CD4 + T (n = 95), ו CD8 + T (n = 112) לימפוציטים. לקבלת מידע שלב ו משרעת בזוויות שונות של תאורה, הולוגרמות 2D מרובים של לימפוציטים כל נמדדו על ידי שינוי זווית תאורה (מ-60 ° עד 60 ° צלזיוס). בדרך כלל, הולוגרמות 50 יכול לשמש לבנייה מחדש של tomogram רי תלת-ממד, אך המספר של הולוגרמות 2D ניתן להתאים בהתחשב על המהירות והאיכות הדמיה. משרעת ומידע שלב הולוגרמות נמדד מאוחזרות משתמש באלגוריתם אחזור שדה בהתבסס על43,של התמרת פורייה44. Tomogram רי תלת-ממד של לימפוציטים כל שוחזר ממידע מרובים 2D שאוחזרו שלב ו משרעת בזוויות שונות של תאורה באמצעות אלגוריתם טומוגרפיה אופטית עקיפה. פרטים על התמונה תהליך ושיטת 3D RI tomogram שיקום ניתן למצוא במקום אחר21,45.

איור 2 A-2_C מראה נציג 3D שניתנו RI tomograms של לימפוציטים B, CD4 + T ו CD8 + T על-ידי הקצאת ערכות צבעים שונים לפי רי ערכים באמצעות תוכנת הדמיה. מתוך הערכים RI, כמותיים מורפולוגי (SA, CV ו- SI), תכונות ביוכימיות (PD ו- DM) חושבו (איור 2A-2_C). תוצאה זו מפגינה בפועל את התפלגות RI 3D מאפשר ניתוח כמותי של מידע מורפולוגי, כמו גם ביוכימיות של לימפוציטים.

למידה חישובית תחת פיקוח נוצלה כדי לזהות סוגי לימפוציטים ברמה תא בודד. Tomograms רי 3D נמדד היו באופן אקראי לפצל 70% ו-30% של אימונים (ב': 104, CD4 + t: 66 ו CD8 + t: 77) ובדיקה (ב': 45, CD4 + t: 29 ו CD8 + t: 35) datasets, בהתאמה. אנחנו אופטימיזציה של מסווגים לנצל מקסימאלית את טביעות ייחודיים לסוג התא מקודד בחלל תכונה. דיוק מוחלט רגישות (נכון חיובי), ירידה לפרטים (נכון שלילי) חושבו על-ידי השוואת תוצאות חזה המסווג של סוגי תאים הקרקע-האמת.

כדי להדגים הוכחה הרעיון של הפרוטוקול המוצע, ביצענו למידה ממוחשבת בפיקוח על שלושה מקרים שונים: סיווג בינארי (i) B ו- T לימפוציטים (ii) שני סוגי לימפוציטים-T (CD4 + ו CD8 +-), ואת multiclass (iii) סיווג של כל סוגי לימפוציטים.

איור 3 מציג ביצועי זיהוי ממוטבת מסווגים לשלבים מבחן והדרכה. הדיוק של הסיווג T ו- B לימפוציטים היה 93.15% 89.81% עבור הכשרה של מקרי מבחן, בהתאמה. CD4 + ו CD8 + T לימפוציטים סווגו סטטיסטית, הדיוק היה 87.41% ו 84.38% עבור הכשרה של ערכות בדיקה, בהתאמה. לבסוף, הדיוק של המסווג סוג תא multiclass היה 80.65% ל- 75.93% לשלבים הכשרה ובדיקה, בהתאמה.

Figure 1
איור 1 : דיאגרמות סכמטית של הזיהוי ללא תווית של סוגי לימפוציטים ניצול 3 D שלב כמותיים הדמיה ומערכות לומדות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 : נציג 3 D שניתנו RI tomograms של כל אחד מסוגי תאים לימפוציטים עם תכונות כמותיות מורפולוגי וביוכימי. (א) תא B (ב) CD4 + T תאים, תא (ג) CD8 + T. סרגל קנה מידה = 2 מיקרומטר. SA, פני השטח; קורות חיים, כרך הסלולר; סי, sphericity; PD, צפיפות חלבון; מיט, מסה יבש. נתון זה משתנה עם הרשאה5. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3 : זיהוי של לימפוציטים בודדים סוגי באמצעות למידה ממוחשבת בפיקוח (א) איבחונים של B ו- T תאים, (ב) איבחונים תאי CD4 + ו CD8 + T (ג) multiclass סיווג של כל שלושת לימפוציט סוגי תאים; עבור ערכות הדרכה והן במבחן. שים לב להבדל קטן בין אימון לבין מקרי מבחן, רומז נחמד הכללה של מסווגים הוקמה. המספרים מתחת השמות של כל סוג התא מציינים את מספר התאים בשימוש. נתון זה משתנה עם הרשאה5. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Supplementary File 1
1 הקבצים המשלימים: כוללים קוד חילוץ. חילוץ תכונות (SA, CV, SI, PD ו DM) לאחר RI פילוח המבוסס על הסף של כל tomogram. מיושם בתוכנת עיבוד תמונה. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

Supplementary File 2
2 הקבצים המשלימים: הכשרה קוד. הדרכה k -NN המסווג אימון המבוסס על התכונות שנבחרו. מיושם בתוכנת עיבוד תמונה. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

Supplementary File 3
3 הקבצים המשלימים: בדיקות קוד. בדיקות מסווג - NN מיומן kעבור dataset חדש (כלומר., מבחן סט). מיושם בתוכנת עיבוד תמונה. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

אנו מציגים פרוטוקול המאפשר זיהוי סוגי לימפוציטים ניצול הדמיה תלת פאזה כמותי ולימוד מכונה ללא תווית. השלבים הקריטיים של פרוטוקול זה הם הדמיה שלב כמותיים ובחירת תכונה. עבור ההדמיה הולוגרפית אופטימלית, הצפיפות של תאים צריכה להיות נשלטת כפי שתואר לעיל. יציבות מכנית של התאים חשוב גם להשיג התפלגות RI 3D מדויק כי תנועות צף או הרטט הסלולר יפריע מדידות הולוגרמה על שינויים זווית תאורה. לכן חיכינו כמה דקות עד המדגם הפך סטטי ויציב בבית הבליעה הדמיה לפני מדידה הולוגרמות. לבסוף, בועות בתוך החדר הדמיה בעייתיים כאשר מדידת הולוגרמות עקב רי הבדלים בין האוויר לבין המדגם; לפיכך, המדגם ייטען בקפידה לחדר ההדמיה.

הדמיה ומבחר יסייע לקבוע את ביצועי זיהוי המסווג. אנחנו מחושבים 5 כמותיים מורפולוגי (קורות חיים, SA, SI) ו ביוכימי (PD, מיט) תכונות מהתפלגות RI תלת-ממד ב- 20 שונה RI ערכי הסף; לפיכך, שלפנו סך של 100 תכונות. חיפשנו בדקדקנות אופטימלית שילובים תכונה, מסווג, שהראו כי הדיוק הטוב ביותר קרוס-אימות נבחר. בדקנו 6 אלגוריתמים למידה מחשב שונה, לרבות k -NN (k = 4 ו- k = 6), ניתוח האפליה ליניארי, ניתוח האפליה ריבועית, תמים Bayes, ואת עץ ההחלטות, מצאנו את k -NN (k = 4 ) הראה את הביצועים הטובים ביותר של זיהוי. עם זאת, יש הזדמנות לשפר את דיוק הזיהוי באמצעות מחשב אחר לימוד שיטות, כולל מכונת וקטורים תומכים ורשתות עצביים.

פרוטוקול זה מודד את התכונות האופטיות מהותי דרך שלב כמותיים 3D הדמיה כדי לזהות סוגי לימפוציטים; לכן, זה לא דורש תהליך תיוג המבוסס על תגובות אנטיגן-נוגדן בשימוש זריחה או מגנטיים מבוססי חרוז מיון תא טכניקות, אשר יש סיכונים של שינוי תפקוד התאים על ידי שינוי מבני חלבון ממברנה. יתר על כן, מודד הפצה RI 3D השיטה הנוכחית, והיא מספקת מידע מורפולוגי וביוכימי 3D על התא, אשר אינה יכולה להתקבל על ידי שיטת הולוגרפיה קליע בודד46; לכן, ביצועי זיהוי הפרוטוקול הוא מדויק יותר עקב מידע גבוהה-ממדי.

מגבלה מינור של פרוטוקול זה התאמה ידנית של השלב מדגם, חובה תיוג תהליך למידה חישובית תחת פיקוח. חיפשנו הלימפוציטים על-ידי התאמת נמדד הולוגרמות, אשר הם הצעדים הכי הגוזלות זמן והבמה translational ידנית. מגבלה זו יהיה משופר על ידי העסקת שלב ממונע אוטומטיות או התקנים ערוץ microfluidic. לגבי לימוד בפיקוח, סוגי לימפוציטים ידועים נדרשים להקים את המסווג אופטימלי; לפיכך, אנו נאלץ לנתק את הראשון, לזהות סוגי תאים לימפוציטים מבוסס על טכניקת המיון אנטיגן-נוגדן מבוססי. למרות זאת, פרוטוקול זה עדיין משתמשת הניגוד אופטי פנימי של לימפוציטים, הסוכנים תיוג נהגה לציין נוגדנים יש השפעות זניח על האות רי 3D נמדד. לכן, המסווג הוקמה עשוי לשמש לזיהוי לימפוציטים באופן ללא תווית.

למרות פרוטוקול זה בעיקר מנצל פנוטיפים של לימפוציטים על ידי מדידת תלת-ממד RI tomograms של תאים בודדים, הנתונים הללו-RI 3D יכול לשמש גם בשילוב עם באופנים כתובות אחרים או פרוטיאומיה מבנית מידע עבור סיווג טוב יותר של תתי סוגים. לאחרונה, טכניקות במיקרוסקופ correlative שילוב הדמיה פלורסצנטיות, ה-QPI כבר הציג47,48,49. ניתן להרחיב את הגישה הוצג פרוטוקול זה גם שיטות הדמיה correlative אלה.

ניתן להחיל ללא תווית זיהוי סוגי לימפוציטים לימוד פתופיזיולוגיה או אבחון המחלה על ידי גילוי לימפוציטים חריגים או היחס בין סוגי לימפוציטים. יתר על כן, פרוטוקול זה ניתן ליישם ניתוח דם מלא על-ידי זיהוי תאים שונים כולל כדוריות דם אדומות, טסיות דם, תאי דם לבנים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

פרופסור י' פארק, ג'ו י', י' ס קים ולי ס יש אינטרסים כלכליים של Tomocube, inc., חברה commercializes טומוגרפיה אופטית עקיפה ושלב כמותיים הדמיה מכשירים, היא אחת של נותני החסות של העבודה.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי את KAIST BK21 + תוכנית, Tomocube, inc., ו את נבחרת מחקר קרן של קוריאה (2015R1A3A2066550, 2017M3C1A3013923, 2018K 000396). י' ג'ו מאשר תמיכה מן אחוות לנשיאות KAIST אסאן קרן המלגות מדע הביו-רפואית.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mouse Daehan Biolink C57BL/6J mice  gender and age-matched, 6 – 8 weeks
Falcon conical centrifuge tube ThermoFisher Scientific 14-959-53A 15 mL
Phosphate-buffered saline  Sigma-Aldrich 806544-500ML
Ammonium-chloride-potassium lysing buffer  ThermoFisher Scientific A1049201
RPMI-1640 medium Sigma-Aldrich R8758
Fetal bovine serum ThermoFisher Scientific 10438018
Antibody BD Biosciences 553140 (RRID:AB_394655) CD16/32 (clone 2.4G2)
Antibody BD Biosciences 555275 (RRID:AB_395699) CD3ε (clone 17A2)
Antibody Biolegnd 100734 (RRID:AB_2075238) CD8α (clone 53-6.7)
Antibody BD Biosciences 557655 (RRID:AB_396770) CD19 (clone 1D3)
Antibody BD Biosciences 557683 (RRID:AB_396793) CD45R/B220 (clone RA3-6B2)
Antibody BD Biosciences 552878 (RRID:AB_394507) NK1.1 (clone PK136)
Antibody eBioscience 11-0041-85 (RRID:AB_464893) CD4 (clone GK1.5)
DAPI  Roche 10236276001 4,6-diamidino-2-phenylindole
Flow cytometry  BD Biosciences Aria II or III 
Imaging chamber Tomocube, Inc. TomoDish
Holotomography Tomocube, Inc. HT-1H
Holotomography imaging software Tomocube, Inc. TomoStudio
Image professing software MathWorks Matlab R2017b

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alizadeh, A. A., et al. Distinct types of diffuse large B-cell lymphoma identified by gene expression profiling. Nature. 403, (6769), 503 (2000).
  2. Von Boehmer, H., Melchers, F. Checkpoints in lymphocyte development and autoimmune disease. Nature Immunology. 11, (1), 14 (2010).
  3. Sáez-Cirión, A., et al. HIV controllers exhibit potent CD8 T cell capacity to suppress HIV infection ex vivo and peculiar cytotoxic T lymphocyte activation phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, (16), 6776-6781 (2007).
  4. Fischer, K., et al. Isolation and characterization of human antigen-specific TCRαβ+ CD4-CD8-double-negative regulatory T cells. Blood. 105, (7), 2828-2835 (2005).
  5. Yoon, J., et al. Identification of non-activated lymphocytes using three-dimensional refractive index tomography and machine learning. Scientific Reports. 7, (1), 6654 (2017).
  6. Popescu, G. Quantitative phase imaging of cells and tissues. McGraw Hill Professional. (2011).
  7. Lee, K., et al. Quantitative phase imaging techniques for the study of cell pathophysiology: from principles to applications. Sensors. 13, (4), 4170-4191 (2013).
  8. Kim, D., et al. Refractive index as an intrinsic imaging contrast for 3-D label-free live cell imaging. bioRxiv. 106328 (2017).
  9. Kim, K., et al. Optical diffraction tomography techniques for the study of cell pathophysiology. Journal of Biomedical Photonics & Engineering. 2, (2), (2016).
  10. Wolf, E. Three-dimensional structure determination of semi-transparent objects from holographic data. Optics Communications. 1, (4), 153-156 (1969).
  11. Kus, A., Dudek, M., Kemper, B., Kujawinska, M., Vollmer, A. Tomographic phase microscopy of living three-dimensional cell cultures. Journal of Biomedical Optics. 19, (4), 046009 (2014).
  12. Kim, T., et al. White-light diffraction tomography of unlabelled live cells. Nature Photonics. 8, (3), 256 (2014).
  13. Simon, B., et al. Tomographic diffractive microscopy with isotropic resolution. Optica. 4, (4), 460-463 (2017).
  14. Kim, Y., et al. Profiling individual human red blood cells using common-path diffraction optical tomography. Scientific Reports. 4, (2014).
  15. Park, H., et al. Measuring cell surface area and deformability of individual human red blood cells over blood storage using quantitative phase imaging. Scientific Reports. 6, (2016).
  16. Lee, S., et al. Refractive index tomograms and dynamic membrane fluctuations of red blood cells from patients with diabetes mellitus. Scientific Reports. 7, (2017).
  17. Merola, F., et al. Tomographic flow cytometry by digital holography. Light-Science & Applications. 6, (2017).
  18. Park, Y., et al. Refractive index maps and membrane dynamics of human red blood cells parasitized by Plasmodium falciparum. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 13730-13735 (2008).
  19. Park, H., et al. Characterizations of individual mouse red blood cells parasitized by Babesia microti using 3-D holographic microscopy. Scientific Reports. 5, 10827 (2015).
  20. Chandramohanadas, R., et al. Biophysics of malarial parasite exit from infected erythrocytes. Public Library of Science ONE. 6, (6), 20869 (2011).
  21. Yoon, J., et al. Label-free characterization of white blood cells by measuring 3D refractive index maps. Biomedical Optics Express. 6, (10), 3865-3875 (2015).
  22. Kim, K., et al. Three-dimensional label-free imaging and quantification of lipid droplets in live hepatocytes. Scientific Reports. 6, 36815 (2016).
  23. Kim, D., et al. Label-free high-resolution 3-D imaging of gold nanoparticles inside live cells using optical diffraction tomography. Methods. (2017).
  24. Lenz, P., et al. Multimodal Quantitative Phase Imaging with Digital Holographic Microscopy Accurately Assesses Intestinal Inflammation and Epithelial Wound Healing. Journal of Visualized Experiments. (115), (2016).
  25. Huang, J., Guo, P., Moses, M. A. A Time-lapse, Label-free, Quantitative Phase Imaging Study of Dormant and Active Human Cancer Cells. Journal of Visualized Experiments. (132), (2018).
  26. Yang, S. A., Yoon, J., Kim, K., Park, Y. Measurements of morphological and biochemical alterations in individual neuron cells associated with early neurotoxic effects in Parkinson's disease. Cytometry Part A. 91, (5), 510-518 (2017).
  27. Cotte, Y., et al. Marker-free phase nanoscopy. Nature Photonics. 7, (2), 113-117 (2013).
  28. Nguyen, T. H., Kandel, M. E., Rubessa, M., Wheeler, M. B., Popescu, G. Gradient light interference microscopy for 3D imaging of unlabeled specimens. Nature Communications. 8, (1), 210 (2017).
  29. Kwon, S., et al. Mitochondria-targeting indolizino [3, 2-c] quinolines as novel class of photosensitizers for photodynamic anticancer activity. European Journal of Medicinal Chemistry. 148, 116-127 (2018).
  30. Bennet, M., Gur, D., Yoon, J., Park, Y., Faivre, D. A Bacteria-Based Remotely Tunable Photonic Device. Advanced Optical Materials. (2016).
  31. Kim, T. I., et al. Antibacterial Activities of Graphene Oxide-Molybdenum Disulfide Nanocomposite Films. ACS Applied Materials & Interfaces. 9, (9), 7908-7917 (2017).
  32. Bedrossian, M., Barr, C., Lindensmith, C. A., Nealson, K., Nadeau, J. L. Quantifying Microorganisms at Low Concentrations Using Digital Holographic Microscopy (DHM). Journal of Visualized Experiments. (129), (2017).
  33. Jo, Y., et al. Quantitative Phase Imaging and Artificial Intelligence: A Review. arXiv preprint. arXiv:1806.03982 (2018).
  34. Javidi, B., Moon, I., Yeom, S., Carapezza, E. Three-dimensional imaging and recognition of microorganism using single-exposure on-line (SEOL) digital holography. Optics Express. 13, (12), 4492-4506 (2005).
  35. Jo, Y., et al. Label-free identification of individual bacteria using Fourier transform light scattering. Optics Express. 23, (12), 15792-15805 (2015).
  36. Jo, Y., et al. Angle-resolved light scattering of individual rod-shaped bacteria based on Fourier transform light scattering. Scientific Reports. 4, 5090 (2014).
  37. Jo, Y., et al. Holographic deep learning for rapid optical screening of anthrax spores. Science Advances. 3, (8), 1700606 (2017).
  38. Mirsky, S. K., Barnea, I., Levi, M., Greenspan, H., Shaked, N. T. Automated analysis of individual sperm cells using stain-free interferometric phase microscopy and machine learning. Cytometry Part A. 91, (9), 893-900 (2017).
  39. Roitshtain, D., et al. Quantitative phase microscopy spatial signatures of cancer cells. Cytometry Part A. 91, (5), 482-493 (2017).
  40. Lam, V. K., Nguyen, T. C., Chung, B. M., Nehmetallah, G., Raub, C. B. Quantitative assessment of cancer cell morphology and motility using telecentric digital holographic microscopy and machine learning. Cytometry Part A. (2017).
  41. Pavillon, N., Hobro, A. J., Akira, S., Smith, N. I. Noninvasive detection of macrophage activation with single-cell resolution through machine learning. Proceedings of the National Academy of Sciences. (2018).
  42. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). Journal of Visualized Experiments. (41), e1546 (2010).
  43. Takeda, M., Ina, H., Kobayashi, S. Fourier-transform method of fringe-pattern analysis for computer-based topography and interferometry. Journal of the Optical Society of America. 72, (1), 156-160 (1982).
  44. Debnath, S. K., Park, Y. Real-time quantitative phase imaging with a spatial phase-shifting algorithm. Optics Letters. 36, (23), 4677-4679 (2011).
  45. Kim, K., et al. High-resolution three-dimensional imaging of red blood cells parasitized by Plasmodium falciparum and in situ hemozoin crystals using optical diffraction tomography. Journal of Biomedical Optics. 19, (1), 011005 (2013).
  46. Vercruysse, D., et al. Three-part differential of unlabeled leukocytes with a compact lens-free imaging flow cytometer. Lab on a Chip. 15, (4), 1123-1132 (2015).
  47. Kim, K., et al. Correlative three-dimensional fluorescence and refractive index tomography: bridging the gap between molecular specificity and quantitative bioimaging. Biomedical Optics Express. 8, (12), 5688-5697 (2017).
  48. Shin, S., Kim, D., Kim, K., Park, Y. Super-resolution three-dimensional fluorescence and optical diffraction tomography of live cells using structured illumination generated by a digital micromirror device. arXiv preprint. arXiv:1801.00854 (2018).
  49. Chowdhury, S., Eldridge, W. J., Wax, A., Izatt, J. A. Structured illumination multimodal 3D-resolved quantitative phase and fluorescence sub-diffraction microscopy. Biomedical Optics Express. 8, (5), 2496-2518 (2017).
ללא תווית זיהוי של לימפוציטים יחוברו באמצעות הדמיה תלת פאזה כמותית, מכונת למידה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yoon, J., Jo, Y., Kim, Y. S., Yu, Y., Park, J., Lee, S., Park, W. S., Park, Y. Label-Free Identification of Lymphocyte Subtypes Using Three-Dimensional Quantitative Phase Imaging and Machine Learning. J. Vis. Exp. (141), e58305, doi:10.3791/58305 (2018).More

Yoon, J., Jo, Y., Kim, Y. S., Yu, Y., Park, J., Lee, S., Park, W. S., Park, Y. Label-Free Identification of Lymphocyte Subtypes Using Three-Dimensional Quantitative Phase Imaging and Machine Learning. J. Vis. Exp. (141), e58305, doi:10.3791/58305 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter