Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Etikett-fri identifikasjon av lymfocytt subtyper med tredimensjonale kvantitative fase Imaging og maskin læring

doi: 10.3791/58305 Published: November 19, 2018

Summary

Vi beskriver en protokoll for etikett-fri identifikasjon av lymfocytt subtyper kvantitative fase bildebehandling og en maskinlæring algoritme. Målinger av 3D brytningsindeks tomograms av lymfocytter presenterer 3D morfologiske og biokjemiske informasjon for enkeltceller som analyseres deretter med en apparat-innlæring algoritme for identifikasjon av celletyper.

Abstract

Her beskriver vi en protokoll for etikett-fri identifikasjon av lymfocytt subtyper kvantitative fase bildebehandling og maskinlæring. Identifikasjon av lymfocytt subtyper er viktig for studiet av immunologi samt diagnose og behandling av ulike sykdommer. Foreløpig avhengige standard metoder for klassifisering lymfocytt merking bestemt membran proteiner via antigen-antistoff reaksjoner. Men bærer disse merking teknikker den potensielle risikoen ved å endre cellulære funksjoner. Protokollen beskrevet her overvinner disse utfordringene ved å utnytte innebygd optisk kontraster målt ved 3D kvantitative fase bildebehandling og en maskinlæring algoritme. Måling av 3D brytningsindeks (RI) tomograms av lymfocytter gir kvantitativ informasjon om 3D morfologi og fenotyper individuelle celler. De Biofysiske parameterne Hentet fra den målte 3D RI tomograms analyseres deretter kvantitativt med en maskin læring algoritme, aktivere etikett-fri identifikasjon av lymfocytt på en enkeltcelle nivå. Vi måle i 3D RI tomograms av B, CD4 + T og CD8 + T-lymfocytter og identifisert deres celletyper med over 80% nøyaktighet. I denne protokollen beskriver vi detaljerte trinn for lymfocytt isolasjon, 3D kvantitative fase bildebehandling og maskinlæring identifisere lymfocytt typer.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Lymfocytter kan klassifiseres i ulike undergrupper inkludert B, hjelper (CD4 +) T, cytotoksiske (CD8 +) T og regulatoriske T celler. Hver lymfocytt har en annen rolle i det adaptive immunsystemet; for eksempel, produserer B-lymfocytter antistoffer, mens T-lymfocytter gjenkjenner bestemte antigener, fjerne unormale celler og regulere B-lymfocytter. Lymfocytt funksjon og regulering er tett kontrollert av og relatert til ulike sykdommer, inkludert kreft1, autoimmune sykdommer2og virusinfeksjoner3. Identifikasjon av lymfocytter er derfor viktig å forstå sine patofysiologiske roller i slike sykdommer og for immunterapi i klinikker.

Foreløpig avhengig metoder for klassifisering lymfocytt antigen-antistoff reaksjoner av målretting bestemte overflaten membran proteiner eller overflate markører4. Målretting overflate markører er en presis og nøyaktig metode for å bestemme lymfocytt typer. Men krever det dyre reagenser og tidkrevende prosedyrer. Videre bærer risikoen for endring av membran proteinstrukturer og endring av cellulære funksjoner.

For å overvinne disse utfordringene, introduserer protokollen beskrevet her etikett-fri identifikasjon av lymfocytt 3D kvantitative fase imaging (QPI) og maskinen lære5. Denne metoden gjør det mulig for klassifisering av lymfocytt typer på en enkeltcelle nivå basert på morfologiske informasjon fra etikett-gratis 3D-bildebehandling av personlige lymfocytter. I motsetning til konvensjonelle fluorescens mikroskopi teknikker benytter QPI brytningsindeks (RI) distribusjoner (innebygde optiske egenskaper av levende celler og vev) optisk kontrast6,7. RI tomograms av personlige lymfocytter representerer fenotypiske informasjon spesifikk for subtyper av lymfocytter. I dette tilfellet å systematisk bruke 3D RI tomograms av personlige lymfocytter, ble en veiledet maskin læring algoritmen benyttet.

Bruke ulike QPI teknikker, 3D RI tomograms celler er aktivt brukt for studiet av cellen patofysiologi fordi de gir en etikett-fri, kvantitativ imaging evne8,9,10, 11,12,13. 3D RI distribusjonen av enkeltceller kan også gi morfologiske biokjemiske og biomekaniske informasjon om celler. 3D RI tomograms har tidligere blitt utnyttet innen hematologi14,15,16,17, infeksjonssykdommer18,19, 20, immunologi21, cell biologi22,23, betennelse24, kreft25, nevrovitenskap26,27, utviklingsbiologi28, toksikologi 29og mikrobiologi12,30,31,32.

Selv om 3D RI tomograms gir detaljert morfologiske og biokjemiske informasjon av celler, er klassifiseringen av lymfocytt subtyper vanskelig å oppnå av bare imaging 3D RI tomograms5. Systematisk og kvantitativt utnytte den målte 3D RI tomograms for celle typeklassifisering, benyttet vi en maskin læring algoritme. Nylig har flere blitt rapportert i som kvantitative fase bilder av celler ble analysert med ulike maskin læring algoritmer33, inkludert påvisning av mikroorganismer34, klassifisering av bakterie-slekt35 , 36, rask og etikett-fri påvisning av anthrax sporer37, automatisk analyse av sædceller38, analyse av kreft celler39,40, og oppdagelsen av macrophage aktivisering41.

Denne protokollen gir detaljert fremgangsmåte for å utføre etikett-fri identifikasjon av lymfocytt typer enkeltcelle nivået med 3D QPI og maskinlæring. Dette inkluderer: 1) lymfocytt isolert fra mus blod, 2) lymfocytt sortering via flyt cytometri, 3) 3D QPI, 4) kvantitative egenskapsuttrekking fra 3D RI tomograms og 5) tilsyn læring for å identifisere lymfocytt typer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Dyr omsorg og eksperimentelle prosedyrer ble utført under godkjenning av institusjonelle dyr omsorg og bruk komiteen av KAIST (KA2010-21, KA2014-01 og KA2015-03). Alle eksperimenter i denne studien ble utført av godkjente retningslinjer.

1. lymfocytt isolert fra mus blod

  1. Når en C57BL/6J mus er euthanized via CO2 innånding, en 26-G nål inn musen hjertet og samle 0,3 mL blod. Direkte sette blod inn i et rør med 100 U/mL heparin-oppløsningen fortynnet med 1 mL av fosfat-bufret saltvann (PBS).
    Merk: Alternativt lymfocytter fra milten kan være isolert.
  2. Sentrifuge røret på 400 x g i 5 min på 4 ° C.
  3. Legg til 0,5 mL ammonium klor kalium lysing bufferen røret og forsiktig invertere det noen ganger å blande løsningen.
  4. Inkuber røret ved romtemperatur (RT) for 5 min.
  5. Vask cellene ved å legge 4,5 mL PBS og sentrifugering 400 x g i 5 min på 4 ° C, to ganger.
  6. Fjern nedbryting og resuspend celle pellet i 100 µL av fersk RPMI-1640 medium med 10% fosterets bovin serum (FBS).
  7. Legge til 0,1 µg CD16/32 (2.4G2) antistoff røret for å blokkere.
  8. Holde røret på is.

2. flow cytometri og sortering av lymfocytt undertyper

Merk: Sortering lymfocytter avhengig av celle type er avgjørende for å etablere bakken-sannheten (dvs. riktig) cellen skriver etiketter å trene og teste en celle type klassifiserer i overvåkede læring. Flowcytometri, en gull-standard metode, brukes til å identifisere og skille lymfocytter42.

  1. Gjør en blanding av overflaten markør flekker antistoffer i 100 µL av fersk RPMI-1640 medium [med 10% FBS, 0.1 µg av CD3e (17A2), CD8a (53-6,7), CD19 (1D 3), CD45R (B220, RA3-6B2) og NK1.1 (PK136)] og 0,25 µg av CD4 (GK1.5) antistoffer mot målet B, CD4 + T og CD8 + T lymfocytter.
  2. Legge til 100 µL av antistoff blandingen i cellen suspensjon (innhentet i trinn 1.8).
  3. Inkuber for 25 min på is.
  4. Vask cellene ved å legge 5 mL av PBS og sentrifugering 400 x g i 5 min på 4 ° C, to ganger.
  5. Resuspend celle pellet i 5 mL av fersk RPMI-1640 medium med 10% FBS og 2,5 µg av DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole).
  6. Samle Kurstype lymfocytt separat med flowcytometri de fluorescens nivåene av markørene som er beskrevet ovenfor. Samtidig utelukke døde celler bruker DAPI signaler.
    Merk: Detaljert protokoller om flyt cytometri-baserte celle sortering har vært beskrevet tidligere42.

3. 3D kvantitative fase Imaging

  1. Holde sorterte lymfocytter på is gjennom tenkelig prosedyrer, som må fullføres innen 5 h (siden lymfocytt isolasjon fra musen) for å unngå celleskader og biokjemiske endringer.
  2. Velg en sortert celle (blant B, CD4 + T og CD8 + T-lymfocytter) og fortynne prøven (innhentet i trinn 2.6) til 180 celler/µL med RPMI medium for optimal tenkelig tilstand (dvs. en celle per enkelt felt-of-view).
  3. Legg 120 μL utvannet prøven i en tenkelig kammer av langsom injeksjon. Kontrollere om tilstedeværelse av bobler i tenkelig kammer med prøven. Hvis det er bobler, nøye fjerne dem, som de vil kompromittere kvaliteten på målingene.
  4. Få 3D RI tomograms bruker en kommersiell 3D kvantitative fase mikroskop, eller holotomography, og dens tenkelig programvare.
    Merk: Detaljert informasjon om eksperimentell oppsettet kan finnes i den opprinnelige manuskript5.
    1. Plass en dråpe destillert vann over linsen av mikroskopet.
    2. Plasser til tenkelig kammeret prøven på oversettelse scenen av mikroskopet og justere plasseringen slik at prøven er justert til linsen.
    3. Justere aksial plasseringen av målet og kondensatoren linsene ved å klikke fokus og overflaten, henholdsvis i kategorien "Kalibrering" av "Microscope" perspektiv av tenkelig programvare.
    4. Justere mål og kondensatoren linsene ved Automatisk modus. Alternativt bruke Skanning-modus og manuelt justere linser slik at belysning mønstre er lokalisert på den sentrale regionen i feltet-of-view.
    5. Gå tilbake til Normalmodus og justere oversettelse scenen for å finne en celle i felt-of-view.
    6. Finne fokalplanet ved å justere aksial posisjon på linsen. Perfekt fokusering gjør eksempel grensen visualisert skjermen nesten usynlig.
    7. Justere oversettelse scenen for å finne et sted uten en celle.
    8. Klikk Kalibrer for å måle flere 2D hologrammer med varierende belysning vinkler.
    9. Justere oversettelse scenen for å finne en celle i midten av feltet-of-view.
    10. Gå til kategorien "Erverv" og klikk 3D bilde for å måle holograms i cellen med identiske belysning vinkler som gjort i trinn 3.4.8.
    11. Når ervervet dataene presenteres på "Data Management" panelet, høyreklikk på ervervet dataene og klikk prosessen for å rekonstruere en 3D RI tomogram fra holograms målt i trinn 3.4.8 og 3.4.10, ved hjelp av Diffraksjon tomografi algoritme 9 , 10 implementert i tenkelig programvare.
    12. Gjenta trinn 3.4.5-3.4.11 som måler mer enn 100 celler for å sikre statistisk styrke for maskinlæring.
    13. Alle bilder som behandles gjennom trinn 3.4.11. kan visualiseres. Høyreklikk data på "Data Management" panelet, og klikk Åpne for å visualisere data. Klikk RI Tomogram på "Data Manager"-panelet. "Preset" i kategorien velger du Last inn og dobbeltklikk "lymphocyte.xml", som er en forhåndsdefinert overføringsfunksjon levert av bildebehandlingsprogramvare å visualisere tomogram ifølge den 3D RI-distribusjonen.
  5. Gjenta 3.2-3.4 måle 3D RI tomograms av alle lymfocytt undertyper.

4. kvantitativ morfologiske og biokjemiske egenskapsuttrekking fra 3D RI Tomograms

  1. Sett alle tomographic data målt over i en enkelt mappe. Delt i celletyper i undermappene i denne mappen. Forberede hver tomogram være en enkelt .mat -fil.
  2. Åpne supplerende fil 1 - egenskapsuttrekking (skrevet for en bildebehandling).
  3. Redigere linje 14 å angi mappen tomogram i trinn 4.1.
  4. Redigere linje 15 for å angi en mappe å lagre utdraget funksjonen dataene.
  5. Du kan også redigere linje 17 justere RI terskelparameterne for egenskapsuttrekking. Standardalternativet er 20 RI terskler fra 1.340-1.378, med en tilvekst på 0,002 som beskrevet tidligere5.
  6. Kjøre koden. For hver tomogram i datasettet, koden beregner fem funksjoner: overflaten området (SA), mobilnettet volum (CV), sphericity (SI), protein tetthet (PD) og tørr masse (DM), per RI terskel. Detaljert algoritmer for egenskapsuttrekking beskrives andre steder5.
  7. For å overvåke funksjonen utvinning, under kjøring kontroller på skjermen visualisere RI terskel-baserte celle segmentering.
  8. Sjekk på utdraget funksjonen data, som .mat fil per tomogram, lagret i mappen angitt i trinn 4.4.

5. veiledet læring og identifikasjon

  1. Tilfeldig delt funksjon dataene innhentet i trinn 4.8 til opplæring (70%) og test (30%) sett med separate mapper.
  2. Åpne supplerende fil 2 - tog (skrevet for en bildebehandling).
  3. Redigere linje 14 for å angi hvilke opplæring i trinn 5.1.
  4. Redigere linje 16 for å angi en mappe å lagre utdannet klassifisereren.
  5. Redigere linje 17 angi et filnavn for klassifisereren.
  6. Du kan også redigere linje 19 velge funksjonene for trening. Standardalternativet ble som angav tidligere5, brukt til å få representativt resultatene nedenfor.
  7. Kjøre koden. Bruker valgte funksjoner av treningen sett, koden tog en klassifiserer med k-nærmeste nabo algoritmen (k -NN, k = 4) og lagrer deretter klassifisereren (som nevnt i trinn 5.5) i mappen angitt i trinn 5.4.
  8. Kontroller på skjermen visualisere klassifiserer ytelsen og kryss-validering nøyaktigheten.
  9. Eventuelt tog flere klassifiserere med forskjellige funksjon kombinasjoner ved å gjenta trinn 5.5-5.7. Velg klassifisereren med høyeste kryss-validering nøyaktighet.
  10. Åpne supplerende filen 3 - Test (skrevet for en bildebehandling).
  11. Rediger linjene 14-15 angi utdannet klassifisereren som skal testes.
  12. Redigere linje 17 for å angi hvilke testen i trinn 5.1.
  13. Kjøre koden. Klassifisereren beskrevet ovenfor identifiserer celletyper personlige lymfocytter i testen settet.
  14. Kontroller på skjermen visualisere identifikasjon ytelsen og test nøyaktigheten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Figur 1 viser skjematisk prosessen med hele protokollen. Ved hjelp av prosedyren som presenteres her, vi isolerte B (n = 149), CD4 + T (n = 95), og CD8 + T (n = 112) lymfocytter. For å få fase og amplitude informasjon i forskjellige vinkler av belysning, ble flere 2D hologrammer av hver lymfocytter målt ved å endre vinkelen på belysning (fra-60 ° til 60 °). Vanligvis 50 hologrammer kan brukes til å rekonstruere en 3D RI tomogram, men antall 2D hologrammer kan justeres vurderer tenkelig hastigheten og kvaliteten. Amplitude og fase informasjon av målt hologrammer hentes ved hjelp av en feltet henting algoritme basert på Fourier transform43,44. Den 3D RI tomogram av hver lymfocytt rekonstruert fra flere 2D Hentet fase og amplitude informasjon i forskjellige vinkler av belysning med optisk Diffraksjon tomografi algoritme. Detaljer bildeprosessen og 3D RI tomogram rekonstruksjon kan finnes andre steder21,45.

Figur 2 A-2_C viser representant 3D gjengitt RI tomograms av B, CD4 + T og CD8 + T-lymfocytter ved å tildele forskjellige fargevalg etter RI verdier via tenkelig programvare. RI verdier, kvantitativ morfologiske (SA, CV og SI) og biokjemiske (PD og DM) funksjoner ble beregnet (figur 2A-2_C). Dette resultatet viser tydelig at 3D RI distribusjon kan kvantitativ analyse morfologiske samt biokjemiske informasjon av lymfocytter.

Veiledet maskinlæring utnyttes for å identifisere lymfocytt typer på en enkeltcelle nivå. De målte 3D RI tomograms ble tilfeldig delt inn i 70% og 30% av trening (B: 104, CD4 + T: 66 og CD8 + T: 77) og test (B: 45, CD4 + T: 29 og CD8 + T: 35) datasett, henholdsvis. Vi optimalisert klassifisererne for å utnytte maksimalt celle spesifikk fingeravtrykk kodet inn funksjonen. Den totale nøyaktighet, følsomhet (sann positiv) og spesifisitet (sant negativ) ble beregnet ved å sammenligne klassifiserer-spådde resultatene og bakken-sannheten celletyper.

For å demonstrere proof-of-concept av foreslåtte protokollen, vi utført veiledet maskinlæring på tre ulike tilfeller: binær klassifisering av (i) B og T-lymfocytter og (ii) to T lymfocytt undertyper (CD4 + og CD8 +) og (iii) multiclass klassifisering av alle lymfocytt typer.

Figur 3 viser identifikasjon ytelse av optimalisert klassifiserere for trening og test stadier. Nøyaktigheten av T- og B-lymfocytt klassifiseringen ble 93.15% og 89.81% for trening og test tilfeller, henholdsvis. CD4 + og CD8 + T-lymfocytter ble statistisk klassifisert, og nøyaktigheten var 87.41% og 84.38% for trening og test apparater, henholdsvis. Til slutt, nøyaktigheten av multiclass celle type klassifisereren var 80.65% og 75.93% til trening og test stadier, henholdsvis.

Figure 1
Figur 1 : Skjematisk diagrammer av etiketten-fri identifikasjon av lymfocytt utnytte 3 D kvantitative fase bildebehandling og maskinlæring. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Representant 3 D gjengitt RI tomograms av hver lymfocytt cellen med kvantitative morfologiske og biokjemiske. (A) B celle, (B) CD4 + T celle, og (C) CD8 + T celle. Skala bar = 2 µm. SA, areal; CV, mobilnettet volum; SI, sphericity; PD, protein tetthet; DM, tørr masse. Dette tallet er endret med tillatelse5. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : Identifikasjon av personlige lymfocytt typer via overvåkede maskinlæring (A) binære klassifisering av B og T celler, (B) binære klassifisering av CD4 + og CD8 + T celler og (C) multiclass klassifisering av alle tre lymfocytt celletyper; for både trening og test sett. Merk den lille forskjellen mellom trening og test tilfeller tyder fin generalisering etablerte klassifiserer. Antall under navnene hver celle type angir antall celler brukes. Dette tallet er endret med tillatelse5. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Supplementary File 1
Supplerende fil 1: funksjonen utvinning koden. Trekker ut funksjoner (SA, CV, SI, PD og DM) etter RI terskel-basert segmentering av hver tomogram. Implementert i en bildebehandling. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplementary File 2
Supplerende fil 2: trening koden. Trening en k -NN klassifiserer trening basert på valgte funksjoner. Implementert i en bildebehandling. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplementary File 3
Supplerende filen 3: teste koden. Teste en utdannet k- NN klassifiserer for nye dataset (dvs., testsett). Implementert i en bildebehandling. Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Vi presenterer en protokoll som etikett-fri identifikasjon av lymfocytt utnytte 3D kvantitative fase bildebehandling og maskinlæring. Avgjørende skritt i denne protokollen er kvantitative fase bildebehandling og funksjonen utvalg. For optimal holografiske avbilding, bør tetthet av celler kontrolleres som beskrevet ovenfor. Mekanisk stabilitet av cellene er også viktig å få en nøyaktig 3D RI distribusjon fordi flytende eller vibrasjonsmedisin mobilnettet bevegelser vil forstyrre hologrammet målinger på belysning vinkel endringer. Vi ventet derfor flere minutter til prøven ble stabil og statisk i tenkelig kammeret før måling hologrammer. Til slutt, bobler inne i tenkelig kammeret er problematisk når du måler hologrammer skyldes RI forskjeller mellom luft og prøven; Dermed skal utvalget nøye lastes til tenkelig kammeret.

Egenskapsuttrekking og valg å bestemme identifikasjon ytelsen for klassifisereren. Vi beregnet 5 kvantitative morfologiske (CV, SA, SI) og biokjemiske (PD, DM) funksjoner fra 3D RI distribusjonen på 20 forskjellige RI terskelverdier. Derfor Hentet vi totalt 100 funksjoner. Vi søkte grundig optimal funksjonen og klassifiserer kombinasjoner, som viser at beste kryss-validering nøyaktigheten ble valgt. Vi testet 6 forskjellige maskinlæring algoritmer, inkludert k -NN (k = 4 og k = 6), lineær diskriminering analyse, kvadratisk diskriminering analyse, naive Bayes, og beslutningstreet og vi fant at k -NN (k = 4 ) viste best identifikasjon ytelse. Men er det en sjanse å bedre identifikasjon nøyaktighet ved hjelp av andre maskin lære metoder, inkludert støtte vektor maskin og nevrale nettverk.

Denne protokollen måler iboende optiske egenskaper via 3D kvantitative fase imaging for å identifisere lymfocytt typer; Således, den ikke krever en merking prosess basert på antigen-antistoff reaksjoner i fluorescens eller magnetiske perle-baserte celle-sortering teknikker, som har risiko for å endre cellulære funksjoner ved å endre membran proteinstrukturer. Videre metoden finnes måler 3D RI distribusjon og gir 3D morfologiske og biokjemiske informasjon om cellen, som kan oppnås ved en single-shot holography metoden46; Identifikasjon ytelsen til protokollen er derfor mer nøyaktig på grunn av høy-dimensjonale informasjon.

En mindre begrensning av denne protokollen er manuell justering av prøven scenen og nødvendig merking prosessen for tilsyn maskinlæring. Vi søkte en lymfocytt ved å justere manuell translasjonsforskning scenen og målt hologrammer, som er mest tidkrevende trinnene. Denne begrensningen vil bli bedre ved å bruke en automatisert motorisert stadium eller microfluidic kanalen enhetene. Om tilsyn læring er hvilke kjent lymfocytt nødvendig for å etablere optimal klassifisereren; Derfor vi måtte første isolere og identifisere lymfocytt celletyper basert på antigen-antistoff-basert sortering teknikken. Likevel, denne protokollen bruker fortsatt innebygd optisk kontrasten av lymfocytter, og merking agenter brukes til å angi antistoffer har ubetydelige effekt på målt 3D RI signalet. Derfor kan etablerte klassifisereren brukes til å identifisere lymfocytter i en etikett-fri måte.

Selv om denne protokollen utnytter hovedsakelig fenotyper av lymfocytter ved å måle 3D RI tomograms individuelle celler, kan disse 3D RI-data også brukes i kombinasjon med andre modaliteter adressering genotyper eller proteomic informasjon for bedre klassifisering av undertyper. Nylig har correlative mikroskopi teknikker fluorescens bildebehandling og QPI vært introdusert47,48,49. Tilnærmingen presentert i denne protokollen kan også utvides til disse correlative tenkelig metoder.

Etikett-fri identifikasjon av lymfocytt typer kan brukes å studere patofysiologi eller diagnostisere sykdom ved å registrere unormal lymfocytter eller prosenter blant lymfocytt typer. Videre kan denne protokollen brukes på hele blod analyse ved å identifisere ulike cellene røde blodlegemer og blodplater hvite blodlegemer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Prof Y. Park, Y. Jo, Y. S. Kim og S. Lee har økonomiske interesser i Tomocube, Inc., et selskap som kommersialiserer optisk Diffraksjon tomografi og kvantitative fasen imaging instrumenter og er blant sponsorene av arbeidet.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av den arbeider nå som forsker BK21 + Program, Tomocube, Inc., og den nasjonale Research Foundation Korea (2015R1A3A2066550, 2017M3C1A3013923, 2018K 000396). Y. Jo anerkjenner støtte fra KAIST presidentvalget fellesskap og Asan Foundation biomedisinsk vitenskap stipend.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mouse Daehan Biolink C57BL/6J mice  gender and age-matched, 6 – 8 weeks
Falcon conical centrifuge tube ThermoFisher Scientific 14-959-53A 15 mL
Phosphate-buffered saline  Sigma-Aldrich 806544-500ML
Ammonium-chloride-potassium lysing buffer  ThermoFisher Scientific A1049201
RPMI-1640 medium Sigma-Aldrich R8758
Fetal bovine serum ThermoFisher Scientific 10438018
Antibody BD Biosciences 553140 (RRID:AB_394655) CD16/32 (clone 2.4G2)
Antibody BD Biosciences 555275 (RRID:AB_395699) CD3ε (clone 17A2)
Antibody Biolegnd 100734 (RRID:AB_2075238) CD8α (clone 53-6.7)
Antibody BD Biosciences 557655 (RRID:AB_396770) CD19 (clone 1D3)
Antibody BD Biosciences 557683 (RRID:AB_396793) CD45R/B220 (clone RA3-6B2)
Antibody BD Biosciences 552878 (RRID:AB_394507) NK1.1 (clone PK136)
Antibody eBioscience 11-0041-85 (RRID:AB_464893) CD4 (clone GK1.5)
DAPI  Roche 10236276001 4,6-diamidino-2-phenylindole
Flow cytometry  BD Biosciences Aria II or III 
Imaging chamber Tomocube, Inc. TomoDish
Holotomography Tomocube, Inc. HT-1H
Holotomography imaging software Tomocube, Inc. TomoStudio
Image professing software MathWorks Matlab R2017b

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alizadeh, A. A., et al. Distinct types of diffuse large B-cell lymphoma identified by gene expression profiling. Nature. 403, (6769), 503 (2000).
  2. Von Boehmer, H., Melchers, F. Checkpoints in lymphocyte development and autoimmune disease. Nature Immunology. 11, (1), 14 (2010).
  3. Sáez-Cirión, A., et al. HIV controllers exhibit potent CD8 T cell capacity to suppress HIV infection ex vivo and peculiar cytotoxic T lymphocyte activation phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, (16), 6776-6781 (2007).
  4. Fischer, K., et al. Isolation and characterization of human antigen-specific TCRαβ+ CD4-CD8-double-negative regulatory T cells. Blood. 105, (7), 2828-2835 (2005).
  5. Yoon, J., et al. Identification of non-activated lymphocytes using three-dimensional refractive index tomography and machine learning. Scientific Reports. 7, (1), 6654 (2017).
  6. Popescu, G. Quantitative phase imaging of cells and tissues. McGraw Hill Professional. (2011).
  7. Lee, K., et al. Quantitative phase imaging techniques for the study of cell pathophysiology: from principles to applications. Sensors. 13, (4), 4170-4191 (2013).
  8. Kim, D., et al. Refractive index as an intrinsic imaging contrast for 3-D label-free live cell imaging. bioRxiv. 106328 (2017).
  9. Kim, K., et al. Optical diffraction tomography techniques for the study of cell pathophysiology. Journal of Biomedical Photonics & Engineering. 2, (2), (2016).
  10. Wolf, E. Three-dimensional structure determination of semi-transparent objects from holographic data. Optics Communications. 1, (4), 153-156 (1969).
  11. Kus, A., Dudek, M., Kemper, B., Kujawinska, M., Vollmer, A. Tomographic phase microscopy of living three-dimensional cell cultures. Journal of Biomedical Optics. 19, (4), 046009 (2014).
  12. Kim, T., et al. White-light diffraction tomography of unlabelled live cells. Nature Photonics. 8, (3), 256 (2014).
  13. Simon, B., et al. Tomographic diffractive microscopy with isotropic resolution. Optica. 4, (4), 460-463 (2017).
  14. Kim, Y., et al. Profiling individual human red blood cells using common-path diffraction optical tomography. Scientific Reports. 4, (2014).
  15. Park, H., et al. Measuring cell surface area and deformability of individual human red blood cells over blood storage using quantitative phase imaging. Scientific Reports. 6, (2016).
  16. Lee, S., et al. Refractive index tomograms and dynamic membrane fluctuations of red blood cells from patients with diabetes mellitus. Scientific Reports. 7, (2017).
  17. Merola, F., et al. Tomographic flow cytometry by digital holography. Light-Science & Applications. 6, (2017).
  18. Park, Y., et al. Refractive index maps and membrane dynamics of human red blood cells parasitized by Plasmodium falciparum. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 13730-13735 (2008).
  19. Park, H., et al. Characterizations of individual mouse red blood cells parasitized by Babesia microti using 3-D holographic microscopy. Scientific Reports. 5, 10827 (2015).
  20. Chandramohanadas, R., et al. Biophysics of malarial parasite exit from infected erythrocytes. Public Library of Science ONE. 6, (6), 20869 (2011).
  21. Yoon, J., et al. Label-free characterization of white blood cells by measuring 3D refractive index maps. Biomedical Optics Express. 6, (10), 3865-3875 (2015).
  22. Kim, K., et al. Three-dimensional label-free imaging and quantification of lipid droplets in live hepatocytes. Scientific Reports. 6, 36815 (2016).
  23. Kim, D., et al. Label-free high-resolution 3-D imaging of gold nanoparticles inside live cells using optical diffraction tomography. Methods. (2017).
  24. Lenz, P., et al. Multimodal Quantitative Phase Imaging with Digital Holographic Microscopy Accurately Assesses Intestinal Inflammation and Epithelial Wound Healing. Journal of Visualized Experiments. (115), (2016).
  25. Huang, J., Guo, P., Moses, M. A. A Time-lapse, Label-free, Quantitative Phase Imaging Study of Dormant and Active Human Cancer Cells. Journal of Visualized Experiments. (132), (2018).
  26. Yang, S. A., Yoon, J., Kim, K., Park, Y. Measurements of morphological and biochemical alterations in individual neuron cells associated with early neurotoxic effects in Parkinson's disease. Cytometry Part A. 91, (5), 510-518 (2017).
  27. Cotte, Y., et al. Marker-free phase nanoscopy. Nature Photonics. 7, (2), 113-117 (2013).
  28. Nguyen, T. H., Kandel, M. E., Rubessa, M., Wheeler, M. B., Popescu, G. Gradient light interference microscopy for 3D imaging of unlabeled specimens. Nature Communications. 8, (1), 210 (2017).
  29. Kwon, S., et al. Mitochondria-targeting indolizino [3, 2-c] quinolines as novel class of photosensitizers for photodynamic anticancer activity. European Journal of Medicinal Chemistry. 148, 116-127 (2018).
  30. Bennet, M., Gur, D., Yoon, J., Park, Y., Faivre, D. A Bacteria-Based Remotely Tunable Photonic Device. Advanced Optical Materials. (2016).
  31. Kim, T. I., et al. Antibacterial Activities of Graphene Oxide-Molybdenum Disulfide Nanocomposite Films. ACS Applied Materials & Interfaces. 9, (9), 7908-7917 (2017).
  32. Bedrossian, M., Barr, C., Lindensmith, C. A., Nealson, K., Nadeau, J. L. Quantifying Microorganisms at Low Concentrations Using Digital Holographic Microscopy (DHM). Journal of Visualized Experiments. (129), (2017).
  33. Jo, Y., et al. Quantitative Phase Imaging and Artificial Intelligence: A Review. arXiv preprint. arXiv:1806.03982 (2018).
  34. Javidi, B., Moon, I., Yeom, S., Carapezza, E. Three-dimensional imaging and recognition of microorganism using single-exposure on-line (SEOL) digital holography. Optics Express. 13, (12), 4492-4506 (2005).
  35. Jo, Y., et al. Label-free identification of individual bacteria using Fourier transform light scattering. Optics Express. 23, (12), 15792-15805 (2015).
  36. Jo, Y., et al. Angle-resolved light scattering of individual rod-shaped bacteria based on Fourier transform light scattering. Scientific Reports. 4, 5090 (2014).
  37. Jo, Y., et al. Holographic deep learning for rapid optical screening of anthrax spores. Science Advances. 3, (8), 1700606 (2017).
  38. Mirsky, S. K., Barnea, I., Levi, M., Greenspan, H., Shaked, N. T. Automated analysis of individual sperm cells using stain-free interferometric phase microscopy and machine learning. Cytometry Part A. 91, (9), 893-900 (2017).
  39. Roitshtain, D., et al. Quantitative phase microscopy spatial signatures of cancer cells. Cytometry Part A. 91, (5), 482-493 (2017).
  40. Lam, V. K., Nguyen, T. C., Chung, B. M., Nehmetallah, G., Raub, C. B. Quantitative assessment of cancer cell morphology and motility using telecentric digital holographic microscopy and machine learning. Cytometry Part A. (2017).
  41. Pavillon, N., Hobro, A. J., Akira, S., Smith, N. I. Noninvasive detection of macrophage activation with single-cell resolution through machine learning. Proceedings of the National Academy of Sciences. (2018).
  42. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). Journal of Visualized Experiments. (41), e1546 (2010).
  43. Takeda, M., Ina, H., Kobayashi, S. Fourier-transform method of fringe-pattern analysis for computer-based topography and interferometry. Journal of the Optical Society of America. 72, (1), 156-160 (1982).
  44. Debnath, S. K., Park, Y. Real-time quantitative phase imaging with a spatial phase-shifting algorithm. Optics Letters. 36, (23), 4677-4679 (2011).
  45. Kim, K., et al. High-resolution three-dimensional imaging of red blood cells parasitized by Plasmodium falciparum and in situ hemozoin crystals using optical diffraction tomography. Journal of Biomedical Optics. 19, (1), 011005 (2013).
  46. Vercruysse, D., et al. Three-part differential of unlabeled leukocytes with a compact lens-free imaging flow cytometer. Lab on a Chip. 15, (4), 1123-1132 (2015).
  47. Kim, K., et al. Correlative three-dimensional fluorescence and refractive index tomography: bridging the gap between molecular specificity and quantitative bioimaging. Biomedical Optics Express. 8, (12), 5688-5697 (2017).
  48. Shin, S., Kim, D., Kim, K., Park, Y. Super-resolution three-dimensional fluorescence and optical diffraction tomography of live cells using structured illumination generated by a digital micromirror device. arXiv preprint. arXiv:1801.00854 (2018).
  49. Chowdhury, S., Eldridge, W. J., Wax, A., Izatt, J. A. Structured illumination multimodal 3D-resolved quantitative phase and fluorescence sub-diffraction microscopy. Biomedical Optics Express. 8, (5), 2496-2518 (2017).
Etikett-fri identifikasjon av lymfocytt subtyper med tredimensjonale kvantitative fase Imaging og maskin læring
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yoon, J., Jo, Y., Kim, Y. S., Yu, Y., Park, J., Lee, S., Park, W. S., Park, Y. Label-Free Identification of Lymphocyte Subtypes Using Three-Dimensional Quantitative Phase Imaging and Machine Learning. J. Vis. Exp. (141), e58305, doi:10.3791/58305 (2018).More

Yoon, J., Jo, Y., Kim, Y. S., Yu, Y., Park, J., Lee, S., Park, W. S., Park, Y. Label-Free Identification of Lymphocyte Subtypes Using Three-Dimensional Quantitative Phase Imaging and Machine Learning. J. Vis. Exp. (141), e58305, doi:10.3791/58305 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter