Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Etikett-fri identifiering av lymfocyter undertyper med hjälp av tredimensionell kvantitativ fas Imaging och Machine Learning

doi: 10.3791/58305 Published: November 19, 2018

Summary

Vi beskriver ett protokoll för etikett-fri identifiering av lymfocyter subtyper använder kvantitativa fas imaging och en algoritm för maskininlärning. Mätningar av 3D brytningsindex tomograms av lymfocyter presentera 3D morfologiska och biokemiska information för enskilda celler, som sedan analyseras med en maskininlärning algoritmen för identifiering av celltyper.

Abstract

Här beskriver vi ett protokoll för etikett-fri identifiering av lymfocyter subtyper använder kvantitativa fas imaging och maskininlärning. Identifiering av lymfocyter subtyper är viktigt för studien av immunologi samt diagnos och behandling av olika sjukdomar. För närvarande, lita standardiserade metoder för klassificering av lymfocyter typer på märkning specifika membranproteiner via antigen-antikroppsreaktioner. Dock utföra dessa märkning tekniker de potentiella riskerna med att ändra cellulära funktioner. Protokollet beskrivs här övervinner dessa utmaningar genom att utnyttja inneboende optiska kontraster mätt med 3D kvantitativa fas imaging och en algoritm för maskininlärning. Mätning av 3D brytningsindex (RI) tomograms av lymfocyter ger kvantitativ information om 3D morfologi och fenotyper av enskilda celler. De biofysiska parametrar extraheras från den uppmätta 3D RI tomograms analyseras sedan kvantitativt med en maskin lärande algoritm, möjliggör etikett-fri identifiering av lymfocyter typer på en enskild cell-nivå. Vi mäter den 3D RI tomograms av B, T CD4 + och CD8 + T-lymfocyter och identifierat deras celltyper med över 80% noggrannhet. I detta protokoll beskriver vi de detaljerade anvisningarna för lymfocyter isolering, 3D kvantitativa fas imaging och maskininlärning för att identifiera lymfocyter typer.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Lymfocyter kan delas in i olika subtyper inklusive B, helper (CD4 +) T, cytotoxiska (CD8 +) T och regulatoriska T celler. Varje typ av lymfocyter har en annan roll i det adaptiva immunsystemet; till exempel producerar B-lymfocyter antikroppar, medan T-lymfocyter upptäcka specifika antigener, eliminera onormala celler och reglera B-lymfocyter. Lymfocyter funktion och reglering är tätt kontrolleras av och relaterade till olika sjukdomar inklusive cancer1, autoimmuna sjukdomar2och virusinfektioner3. Identifiering av lymfocyter typer är därför viktigt att förstå deras patofysiologiska roller i sådana sjukdomar och för immunterapi i kliniker.

För närvarande beroende metoder för klassificering av lymfocyter typer antigen-antikroppsreaktioner genom att rikta specifika ytan membranproteiner eller yta markörer4. Inriktning yta markörer är en exakt och noggrann metod för att bestämma lymfocyter typer. Det kräver dock dyra reagenser och tidskrävande förfaranden. Dessutom medför det risker för ändring av protein membranstrukturer och förändringen av cellulära funktioner.

För att övervinna dessa utmaningar, införs i protokollet som beskrivs här etikett-fri identifiering av lymfocyter typer som använder 3D kvantitativa fas imaging (QPI) och machine learning-5. Denna metod möjliggör klassificering av lymfocyter typer på en enskild cell nivå baserat på morfologiska informationsutdrag från etikett-gratis 3D imaging av enskilda lymfocyter. Till skillnad från konventionella fluorescence mikroskopi tekniker använder QPI brytningsindex (RI) distributioner (inneboende optiska egenskaper av levande celler och vävnader) som optiska kontrast6,7. De RI tomograms av enskilda lymfocyter utgör fenotypiska information specifik för subtyper av lymfocyter. I det här fallet för att systemiskt utnyttja 3D RI tomograms av enskilda lymfocyter, utnyttjades en övervakad dator lärande algoritm.

Använda olika QPI tekniker, de 3D RI tomograms celler har aktivt använts för studier av cell patofysiologi eftersom de ger en etikett-fri, kvantitativa imaging kapacitet8,9,10, 11,12,13. Också, de 3D RI-distributionerna av enskilda celler kan ge morfologiska, biokemiska och biomekaniska information om celler. 3D RI tomograms använts tidigare inom hematologi14,15,16,17, infektionssjukdomar18,19, 20, immunologi21, cellbiologi22,23, inflammation24, cancer25, neurovetenskap26,27, utvecklingsbiologi28, toxikologi 29och mikrobiologi12,30,31,32.

Även om 3D RI tomograms ger detaljerad information om morfologiska och biokemiska celler, är klassificering av lymfocyter subtyper svårt att uppnå genom att helt enkelt imaging 3D RI tomograms5. Kvantitativt och systematiskt utnyttja den uppmätta 3D RI tomograms för klassificeringen av cellen, utnyttjade vi en maskin lärande algoritm. Nyligen, flera verk har rapporterats i vilka kvantitativa fasen analyserades bilder av celler med olika maskininlärning algoritmer33, inklusive upptäckt av mikroorganismer34, klassificering av bakteriesläkte35 , 36, etikett-gratis och snabb påvisande av mjältbrand sporer37, automatiserad analys av spermacellerna38, analys av cancer celler39,40, och upptäckt av makrofag aktiveringen41.

Detta protokoll ger detaljerade steg för att utföra etikett-fri identifiering av lymfocyter typer på enskild cellnivå använder 3D QPI och maskininlärning. Detta omfattar: (1) lymfocyter isolering från mus blod, 2) lymfocyter sortering via flöde flödescytometri, 3) 3D QPI, 4) kvantitativa funktionen utvinning från 3D RI tomograms och 5) övervakade lärande för att identifiera lymfocyter typer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Djurvård och experimentella rutiner utfördes under godkännande av institutionella djur vård och användning kommittén för KAIST (KA2010-21 KA2014-01 och KA2015-03). Alla experimenten i denna studie genomfördes i enlighet med de godkända riktlinjerna.

1. lymfocyter isolering från mus blod

  1. När en C57BL/6J mus är euthanized via CO2 inandning, infoga en 26-G nål in i musen hjärtat och samla 0,3 mL blod. Direkt sätta blod i en tub med 100 U/mL heparin lösning späds med 1 mL fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS).
    Obs: Alternativt lymfocyter från mjälten kan isoleras.
  2. Centrifugera röret vid 400 x g under 5 minuter vid 4 ° C.
  3. Tillsätt 0,5 mL av ammonium-klorid-kalium lyseringslösning buffert till röret och vänd den försiktigt några gånger för att blanda lösningen.
  4. Inkubera röret i rumstemperatur (RT) i 5 min.
  5. Tvätta cellerna genom att lägga till 4,5 mL PBS och centrifugering vid 400 x g under 5 minuter vid 4 ° C, två gånger.
  6. Avlägsna supernatanten och återsuspendera cellpelleten i 100 µL av färska RPMI-1640 medium med 10% fetalt bovint serum (FBS).
  7. Tillsätt 0,1 µg CD16/32 (2.4G2) antikroppar till röret för att blockera.
  8. Håll röret på is.

2. flöde flödescytometri och sortering av lymfocyter undertyper

Obs: Sortering lymfocyter beroende på celltyp är väsentliga för att fastställa cellen marken-sanningen (dvs. rätt) skriver etiketter att träna och testa en cell typ klassificerare i övervakad lärande. Flödescytometri, en guldmyntfot metod, används för att identifiera och avgränsa lymfocyter42.

  1. Gör en blandning av surface markör färgning antikroppar i 100 µL av färska RPMI-1640 medium [med 10% FBS, 0.1 µg av CD3e (17A2), CD8a (53-6,7), CD19 (1D 3), CD45R (B220, RA3-6B2) och NK1.1 (PK136)] och 0,25 µg av CD4 (GK1.5) antikroppar mot mål B, T CD4 + och CD8 + T lymfocyter.
  2. Tillsätt 100 µL av antikropp blandningen att cellsuspensionen (erhålls i steg 1,8).
  3. Inkubera i 25 min på is.
  4. Tvätta cellerna genom att tillsätta 5 mL PBS och centrifugering vid 400 x g under 5 minuter vid 4 ° C, två gånger.
  5. Återsuspendera cellpelleten i 5 mL färsk RPMI-1640 medium med 10% FBS och 2,5 µg DAPI (4', 6-diamidin-2-fenylindol).
  6. Samla in varje lymfocyter typ separat med flödescytometri med fluorescens nivåerna av de markörer som beskrivs ovan. Samtidigt utesluta döda celler med hjälp av DAPI.
    Obs: Detaljerade protokoll angående flöde flödescytometri-baserade cell sortering har tidigare beskrivits42.

3. 3D kvantitativa fas Imaging

  1. Hålla de sorterade lymfocyterna på is i hela imaging förfaranden, som ska vara klart inom 5 h (sedan lymfocyter isolering från mus) för att undvika cellskador och biokemiska förändringar.
  2. Välj en sorterad celltyp (bland B, T CD4 + och CD8 + T-lymfocyter) och späd provet (erhålls i steg 2,6) 180 celler/µL med RPMI medium för optimal bildåtergivning kondition (dvs. en cell per enda field-of-view).
  3. Läsa in 120 μL av det utspädda provet i en tänkbar kammare genom långsam injektion. Noggrant kontrollera på bubblor i imaging kammaren med provet. Om det finns bubblor, ta försiktigt bort dem, eftersom de kommer att kompromissa kvaliteten på mätningarna.
  4. Förvärva 3D RI tomograms använder kommersiella 3D kvantitativa fas Mikroskop, eller holotomography, och dess avbildningsprogrammet.
    Obs: Detaljerad information om de experimentella inställningar kan hittas i den ursprungliga manuskript5.
    1. Placera en droppe destillerat vatten ovanpå mål linsen av mikroskopet.
    2. Placera imaging kammaren med provet på översättning scenen av Mikroskop och justera dess läge så att provet överensstämmer med objektivet.
    3. Justera de axiella positionerna av mål och kondensorn objektiv genom att klicka på fokus och yta, respektive, på fliken ”kalibrering” av det ”Mikroskop” perspektivet på avbildningsprogrammet.
    4. Anpassa mål och kondensor linser genom att klicka på Auto-läge. Alternativt använda Skanning läge och manuellt justera linserna så att belysning mönster är lokaliserade på de centrala delarna av den field-of-view.
    5. Återgå till Normalläge och justera översättning scenen för att hitta en cell i det fält-of-view.
    6. Hitta fokalplanet genom att justera objektivet axiella ställning. Perfekt fokusering gör provet gränsen visualiseras i skärmen nästan osynlig.
    7. Justera översättning scenen för att hitta en plats utan en cell.
    8. Klicka på kalibrera för att mäta flera 2D hologram med varierande belysning vinklar.
    9. Justera översättning scenen för att leta upp en cell i mitten av den field-of-view.
    10. Gå till fliken ”förvärv” och klicka på 3D ögonblicksbild för att mäta hologram av cellen med identiska belysning vinklar som gjort steg 3.4.8.
    11. När förvärvade data presenteras på panelen ”Data Management”, högerklicka på förvärvade data och klicka på processen för att rekonstruera en 3D RI tomogram från hologram mätt i steg 3.4.8 och 3.4.10, med diffraktion tomografi algoritm 9 , 10 genomförs i avbildningsprogrammet.
    12. Upprepa steg 3.4.5-3.4.11 för att mäta mer än 100 celler för att säkerställa statistisk power för maskininlärning.
    13. Alla bilder som bearbetas genom steget 3.4.11. kan visualiseras. På panelen ”Data Management”, högerklicka på data och klicka på öppna för att visualisera data. Klicka RI Tomogram på panelen ”Data Manager”. På fliken ”Preset”, klicka på Läs in och dubbelklicka på ”lymphocyte.xml”, som är en fördefinierad överföringsfunktion som tillhandahålls av avbildningsprogrammet att visualisera tomogram enligt den 3D RI-distributioner.
  5. Upprepa steg 3.2-3.4 att mäta 3D RI tomograms av alla lymfocyter undertyper.

4. kvantitativa morfologiska och biokemiska funktion utvinning från 3D RI Tomograms

  1. Placera alla tomografiska data mätt över i en enda mapp. Dela celltyper i undermappar i mappen. Förbereda varje tomogram vara en enda .mat fil.
  2. Öppna kompletterande fil 1 - funktionen extraktion (skriven för ett bildbehandlingsprogram).
  3. Redigera linje 14 att utse mappen tomogram bereddes i steg 4.1.
  4. Redigera rad 15 att utse en mapp att spara extraherade funktionen data.
  5. Du kan också redigera linje 17 att justera parametrarna RI tröskelvärdet för funktionen extraktion. Standardalternativet är 20 RI tröskelvärden från 1,340-1,378, med en ökning på 0,002 som tidigare beskrivits5.
  6. Köra koden. För varje tomogram i datamängden, koden beräknar fem funktioner: yta (SA), cellulär volym (CV), sfärisk (SI), protein densitet (PD), och torrvikt (DM), per RI tröskel. De detaljerade algoritmerna för funktionen utvinning beskrivs någon annanstans5.
  7. För att övervaka funktionen utvinning, under utförandet kontrollera på skärmen visualisera RI tröskel-baserade cell segmentering.
  8. Kolla på extraherade funktionen data, som .mat fil per tomogram, sparas i den mapp som angetts i steg 4,4.

5. handlett lärande och identifiering

  1. Slumpmässigt split funktion uppgifterna i steg 4,8 till utbildning (70%) och test (30%) uppsättningar med separata mappar.
  2. Öppna kompletterande fil 2 - tåg (skriven för ett bildbehandlingsprogram).
  3. Redigera linje 14 att utse den utbildning som bereddes i steg 5.1.
  4. Redigera linje 16 att utse en mapp att spara den utbildad klassificeraren.
  5. Redigera linje 17 Ange ett filnamn för klassificeraren.
  6. Du kan också redigera linje 19 till Välj funktioner för utbildning. Standardalternativet för som angetts tidigare5, att få fram representativa resultat nedan.
  7. Köra koden. Koden använder valda funktioner av utbildning, och tränar en klassificerare med k-närmaste granne algoritm (k -NN; k = 4) och sedan sparar klassificeraren (som heter i steg 5,5) i den mapp som angetts i steg 5,4.
  8. Kontrollera på skärmen visualisera klassificerare prestanda och cross-validering är korrekta.
  9. Du kan också träna flera klassificerare med olika funktion kombinationer genom att upprepa steg 5.5-5.7. Välj sedan klassificeraren med den högsta noggrannheten som cross-validering.
  10. Öppna kompletterande fil 3 - Test (skriven för ett bildbehandlingsprogram).
  11. Redigera rader 14-15 att utse utbildad klassificeraren ska testas.
  12. Redigera linje 17 att utse den test som bereddes i steg 5.1.
  13. Köra koden. Den klassificerare som beskrivs ovan identifierar celltyper i enskilda lymfocyterna i test set.
  14. Kontrollera på skärmen visualisera identifiering prestanda och testa riktigheten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Figur 1 visar schematiskt processen i hela protokollet. Använda proceduren presenteras här, vi isolerat B (n = 149), CD4 + T (n = 95), och CD8 + T (n = 112) lymfocyter. För att få informationen om huvudaktivitet och amplitud i olika vinklar av belysning, mättes flera 2D hologram av varje lymfocyter genom att ändra vinkeln på belysningen (från-60 ° till 60 °). Vanligtvis, 50 hologram kan användas för att rekonstruera en 3D RI-tomogram, men antalet 2D hologram kan justeras med tanke på imaging hastighet och kvalitet. Amplitud och fas information av uppmätta hologram hämtas med en algoritm för hämtning av fält baserat på Fourier transform43,44. Den 3D RI tomogram av varje lymfocyter rekonstruerades från flera 2D Hämtad fas och amplitud information i olika vinklar av belysning med optisk diffraktion tomografi algoritm. Detaljer för avbildningen och 3D RI tomogram återuppbyggnad metod kan hittas någon annanstans21,45.

Figur 2 A-2_C visar representativa 3D utsmält RI tomograms av B, T CD4 + och CD8 + T-lymfocyter genom att fördela olika färgscheman enligt RI värden via avbildningsprogrammet. Från RI värdena och kvantitativa morfologiska (SA, CV och SI) och biokemiska (PD och DM) funktioner beräknades (figur 2A-2_C). Detta resultat visar tydligt att 3D RI distribution möjliggör kvantitativ analys av morfologiska samt biokemiska information av lymfocyter.

Övervakade maskininlärning var utnyttjas för att identifiera lymfocyter typer på en enskild cell-nivå. De uppmätta 3D RI tomograms delades slumpmässigt i 70% och 30% av utbildning (B: 104, T: 66 CD4 + och CD8 + T: 77) och test (B: 45, T: 29 CD4 + och CD8 + T: 35) datamängder, respektive. Vi har optimerat klassificerarna för att maximalt utnyttja cell-typ-specifika fingeravtryck kodade i funktionen utrymmet. Den totala noggrannheten känslighet (sant positiva) och specificitet (sant negativa) beräknades genom att jämföra klassificerare-förutspådde resultat och marken-sanningen celltyper.

För att demonstrera proof-of-concept av föreslagna protokollet, vi utförde övervakad maskininlärning på tre olika fall: binär klassificering av a B och T-lymfocyter och (ii) två T-lymfocyter subtyper (CD4 + och CD8 +) och (iii) multiclass klassificeringen av alla lymfocyter.

Figur 3 visar identifiering prestanda optimerad klassificerare för utbildning och test stadier. Riktigheten av T- och B-lymfocyter klassificering var 93.15% respektive 89.81% för utbildning och testfall. CD4 + och CD8 + T-lymfocyter klassificerades statistiskt, och precisionen var 87.41 och 84,38% för utbildning och test uppsättningar, respektive. Slutligen var riktigheten av multiclass cell typ klassificeraren 80.65% 75.93% för utbildning och test arrangerar, respektive.

Figure 1
Figur 1 : Schematiskt diagram över etikett-fri identifiering av lymfocyter typer att utnyttja 3 D kvantitativa fas imaging och maskininlärning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 : Representativa 3 D återges RI tomograms av varje lymfocyter celltyp med kvantitativa morfologiska och biokemiska funktioner. A B-celler, b CD4 + T-cell och (C) CD8 + T cell. Skalstapeln = 2 µm. SA, yta; CV, cellulära volym; SI, sfärisk; PD, protein täthet; DM, torr massa. Denna siffra är modifierad med tillstånd5. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 : Identifiering av enskilda lymfocyter typer via övervakad maskininlärning (A) binär klassificering av B och T-celler, b binär klassificering av CD4 + och CD8 + T celler och (C) multiclass klassificering av alla tre lymfocyter celltyper; för både träning och test uppsättningar. Observera den lilla skillnaden mellan utbildning och testfall, tyder på fin generalisering etablerade klassificerare. Siffrorna nedan namnen av varje celltyp anger antalet celler används. Denna siffra är modifierad med tillstånd5. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Supplementary File 1
Kompletterande fil 1: har extraheringskod. Utvinna funktioner (SA, CV, SI, PD och DM) efter RI tröskel-baserade segmentering av varje tomogram. Genomfört i ett bildbehandlingsprogram. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.

Supplementary File 2
Kompletterande fil 2: utbildning kod. Utbildning en k -NN klassificerare utbildning baserat på valda funktioner. Genomfört i ett bildbehandlingsprogram. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.

Supplementary File 3
Kompletterande fil 3: testa kod. Testa en utbildad k- NN klassificerare för en ny datamängd (dvs., testa). Genomfört i ett bildbehandlingsprogram. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Vi presenterar ett protokoll som möjliggör etikett-fri identifiering av lymfocyter typer att utnyttja 3D kvantitativa fas imaging och maskininlärning. Kritiska steg i detta protokoll är kvantitativa fas imaging och funktionen urval. För den optimala holographic imaging kontrolleras tätheten av celler enligt ovan. Mekanisk stabilitet av cellerna är också viktigt att få en exakt 3D RI distribution eftersom flytande eller vibrerande cellulära motioner kommer att störa hologram mätningar vid belysning vinkel förändringar. Därför väntade vi, flera minuter tills provet blev stabil och statiska i imaging kammaren innan du mäter hologram. Slutligen, bubblor inne i imaging kammaren är problematiska vid mätning hologram på RI skillnader mellan luft och provet; Således, provet bör noggrant läsas imaging kammaren.

Funktionen utvinning och urval hjälper bestämma identifiering prestanda för klassificeraren. Vi beräknas 5 kvantitativa morfologiska (CV, SA, SI) och biokemiska (PD, DM) funktioner från 3D RI distribution på 20 olika RI tröskelvärden. således extraherade vi sammanlagt 100 funktioner. Vi sökte uttömmande optimal funktion och klassificerare kombinationer, som visar att den bästa cross-validering noggrannheten markerades. Vi har testat 6 olika maskin-algoritmer, inklusive k -NN (k = 4 och k = 6), linjära diskriminering analys, kvadratisk diskriminering analys, naiva Bayes, och beslutsträd, och vi fann att k -NN (k = 4 ) visade bästa identifiering prestanda. Dock finns det en chans att förbättra identifiering noggrannhet med hjälp av andra metoder, inklusive stöd vektor maskin och neuronala nätverk för maskininlärning.

Detta protokoll mäter inneboende optiska egenskaper via 3D kvantitativa fas imaging för att identifiera lymfocyter typer; Således, det kräver inte en märkning process baserat på antigen-antikroppsreaktioner används i fluorescens eller magnetiska pärla-baserade cell-sortering tekniker, som har riskerna för att ändra cellulär funktion genom att ändra protein membranstrukturer. Dessutom denna metod mäter 3D RI distribution och ger 3D morfologiska och biokemiska information om cellen, som inte kan uppnås genom en enkel-shot holografi metod46; identifiering prestanda i protokollet är därför mer korrekt på grund av hög-dimensionell information.

En mindre begränsning av detta protokoll är manuell justering av provet scenen och krävs märkning processen för övervakade maskininlärning. Vi sökte en lymfocyter genom att justera manuell translationell scenen och uppmätta hologram, som är mest tidskrävande stegen. Denna begränsning skulle förbättras genom att anställa en automatiserad motoriserad scenen eller mikroflödessystem channel-enheter. Angående övervakad lärande är de kända lymfocyter typerna skyldiga att upprätta optimala klassificeraren; Således, vi fick första isolera och identifiera lymfocyter celltyper bygger på antigen-antikropp-baserade sortering teknik. Trots detta protokoll använder fortfarande den inneboende optiska kontrasten av lymfocyter, och märkning ämnen används för att ange antikroppar har försumbar effekt på den uppmätta 3D RI-signalen. Därför kan etablerade klassificeraren användas för att identifiera lymfocyter i ett etikett-fri sätt.

Även om detta protokoll använder främst fenotyper av lymfocyter genom att mäta 3D RI tomograms av enskilda celler, kan dessa 3D RI-data också användas i kombination med andra modaliteter adressering genotyper eller proteomiska information för bättre klassificering av subtyper. Korrelat mikroskopi tekniker kombinerar fluorescens imaging och QPI har nyligen varit introducerade47,48,49. Metoden presenteras i detta protokoll kan också utvidgas till dessa korrelat avbildningsmetoder.

Etikett-fri identifiering av lymfocyter typer kan tillämpas på studera patofysiologin eller diagnostisera sjukdomen genom att upptäcka onormala lymfocyter eller nyckeltal bland lymfocyter typer. Detta protokoll kan dessutom tillämpas på helblod analys genom att identifiera olika celler inklusive röda blodkroppar, blodplättar och vita blodkroppar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Prof. Y. Park, Y. Jo, Y. S. Kim och S. Lee har ekonomiska intressen i Tomocube, Inc., ett företag som kommersialiserar optiska diffraktion tomografi och kvantitativa fas imaging instrument och är en av sponsorerna av arbetet.

Acknowledgments

Detta arbete stöds av den KAIST BK21 + Program, Tomocube, Inc., och National Research Foundation Korea (2015R1A3A2066550, 2017M3C1A3013923, 2018K 000396). Y. Jo erkänner stöd från KAIST Presidential gemenskap och Asan Foundation biomedicinsk vetenskap stipendium.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mouse Daehan Biolink C57BL/6J mice  gender and age-matched, 6 – 8 weeks
Falcon conical centrifuge tube ThermoFisher Scientific 14-959-53A 15 mL
Phosphate-buffered saline  Sigma-Aldrich 806544-500ML
Ammonium-chloride-potassium lysing buffer  ThermoFisher Scientific A1049201
RPMI-1640 medium Sigma-Aldrich R8758
Fetal bovine serum ThermoFisher Scientific 10438018
Antibody BD Biosciences 553140 (RRID:AB_394655) CD16/32 (clone 2.4G2)
Antibody BD Biosciences 555275 (RRID:AB_395699) CD3ε (clone 17A2)
Antibody Biolegnd 100734 (RRID:AB_2075238) CD8α (clone 53-6.7)
Antibody BD Biosciences 557655 (RRID:AB_396770) CD19 (clone 1D3)
Antibody BD Biosciences 557683 (RRID:AB_396793) CD45R/B220 (clone RA3-6B2)
Antibody BD Biosciences 552878 (RRID:AB_394507) NK1.1 (clone PK136)
Antibody eBioscience 11-0041-85 (RRID:AB_464893) CD4 (clone GK1.5)
DAPI  Roche 10236276001 4,6-diamidino-2-phenylindole
Flow cytometry  BD Biosciences Aria II or III 
Imaging chamber Tomocube, Inc. TomoDish
Holotomography Tomocube, Inc. HT-1H
Holotomography imaging software Tomocube, Inc. TomoStudio
Image professing software MathWorks Matlab R2017b

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alizadeh, A. A., et al. Distinct types of diffuse large B-cell lymphoma identified by gene expression profiling. Nature. 403, (6769), 503 (2000).
  2. Von Boehmer, H., Melchers, F. Checkpoints in lymphocyte development and autoimmune disease. Nature Immunology. 11, (1), 14 (2010).
  3. Sáez-Cirión, A., et al. HIV controllers exhibit potent CD8 T cell capacity to suppress HIV infection ex vivo and peculiar cytotoxic T lymphocyte activation phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, (16), 6776-6781 (2007).
  4. Fischer, K., et al. Isolation and characterization of human antigen-specific TCRαβ+ CD4-CD8-double-negative regulatory T cells. Blood. 105, (7), 2828-2835 (2005).
  5. Yoon, J., et al. Identification of non-activated lymphocytes using three-dimensional refractive index tomography and machine learning. Scientific Reports. 7, (1), 6654 (2017).
  6. Popescu, G. Quantitative phase imaging of cells and tissues. McGraw Hill Professional. (2011).
  7. Lee, K., et al. Quantitative phase imaging techniques for the study of cell pathophysiology: from principles to applications. Sensors. 13, (4), 4170-4191 (2013).
  8. Kim, D., et al. Refractive index as an intrinsic imaging contrast for 3-D label-free live cell imaging. bioRxiv. 106328 (2017).
  9. Kim, K., et al. Optical diffraction tomography techniques for the study of cell pathophysiology. Journal of Biomedical Photonics & Engineering. 2, (2), (2016).
  10. Wolf, E. Three-dimensional structure determination of semi-transparent objects from holographic data. Optics Communications. 1, (4), 153-156 (1969).
  11. Kus, A., Dudek, M., Kemper, B., Kujawinska, M., Vollmer, A. Tomographic phase microscopy of living three-dimensional cell cultures. Journal of Biomedical Optics. 19, (4), 046009 (2014).
  12. Kim, T., et al. White-light diffraction tomography of unlabelled live cells. Nature Photonics. 8, (3), 256 (2014).
  13. Simon, B., et al. Tomographic diffractive microscopy with isotropic resolution. Optica. 4, (4), 460-463 (2017).
  14. Kim, Y., et al. Profiling individual human red blood cells using common-path diffraction optical tomography. Scientific Reports. 4, (2014).
  15. Park, H., et al. Measuring cell surface area and deformability of individual human red blood cells over blood storage using quantitative phase imaging. Scientific Reports. 6, (2016).
  16. Lee, S., et al. Refractive index tomograms and dynamic membrane fluctuations of red blood cells from patients with diabetes mellitus. Scientific Reports. 7, (2017).
  17. Merola, F., et al. Tomographic flow cytometry by digital holography. Light-Science & Applications. 6, (2017).
  18. Park, Y., et al. Refractive index maps and membrane dynamics of human red blood cells parasitized by Plasmodium falciparum. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 13730-13735 (2008).
  19. Park, H., et al. Characterizations of individual mouse red blood cells parasitized by Babesia microti using 3-D holographic microscopy. Scientific Reports. 5, 10827 (2015).
  20. Chandramohanadas, R., et al. Biophysics of malarial parasite exit from infected erythrocytes. Public Library of Science ONE. 6, (6), 20869 (2011).
  21. Yoon, J., et al. Label-free characterization of white blood cells by measuring 3D refractive index maps. Biomedical Optics Express. 6, (10), 3865-3875 (2015).
  22. Kim, K., et al. Three-dimensional label-free imaging and quantification of lipid droplets in live hepatocytes. Scientific Reports. 6, 36815 (2016).
  23. Kim, D., et al. Label-free high-resolution 3-D imaging of gold nanoparticles inside live cells using optical diffraction tomography. Methods. (2017).
  24. Lenz, P., et al. Multimodal Quantitative Phase Imaging with Digital Holographic Microscopy Accurately Assesses Intestinal Inflammation and Epithelial Wound Healing. Journal of Visualized Experiments. (115), (2016).
  25. Huang, J., Guo, P., Moses, M. A. A Time-lapse, Label-free, Quantitative Phase Imaging Study of Dormant and Active Human Cancer Cells. Journal of Visualized Experiments. (132), (2018).
  26. Yang, S. A., Yoon, J., Kim, K., Park, Y. Measurements of morphological and biochemical alterations in individual neuron cells associated with early neurotoxic effects in Parkinson's disease. Cytometry Part A. 91, (5), 510-518 (2017).
  27. Cotte, Y., et al. Marker-free phase nanoscopy. Nature Photonics. 7, (2), 113-117 (2013).
  28. Nguyen, T. H., Kandel, M. E., Rubessa, M., Wheeler, M. B., Popescu, G. Gradient light interference microscopy for 3D imaging of unlabeled specimens. Nature Communications. 8, (1), 210 (2017).
  29. Kwon, S., et al. Mitochondria-targeting indolizino [3, 2-c] quinolines as novel class of photosensitizers for photodynamic anticancer activity. European Journal of Medicinal Chemistry. 148, 116-127 (2018).
  30. Bennet, M., Gur, D., Yoon, J., Park, Y., Faivre, D. A Bacteria-Based Remotely Tunable Photonic Device. Advanced Optical Materials. (2016).
  31. Kim, T. I., et al. Antibacterial Activities of Graphene Oxide-Molybdenum Disulfide Nanocomposite Films. ACS Applied Materials & Interfaces. 9, (9), 7908-7917 (2017).
  32. Bedrossian, M., Barr, C., Lindensmith, C. A., Nealson, K., Nadeau, J. L. Quantifying Microorganisms at Low Concentrations Using Digital Holographic Microscopy (DHM). Journal of Visualized Experiments. (129), (2017).
  33. Jo, Y., et al. Quantitative Phase Imaging and Artificial Intelligence: A Review. arXiv preprint. arXiv:1806.03982 (2018).
  34. Javidi, B., Moon, I., Yeom, S., Carapezza, E. Three-dimensional imaging and recognition of microorganism using single-exposure on-line (SEOL) digital holography. Optics Express. 13, (12), 4492-4506 (2005).
  35. Jo, Y., et al. Label-free identification of individual bacteria using Fourier transform light scattering. Optics Express. 23, (12), 15792-15805 (2015).
  36. Jo, Y., et al. Angle-resolved light scattering of individual rod-shaped bacteria based on Fourier transform light scattering. Scientific Reports. 4, 5090 (2014).
  37. Jo, Y., et al. Holographic deep learning for rapid optical screening of anthrax spores. Science Advances. 3, (8), 1700606 (2017).
  38. Mirsky, S. K., Barnea, I., Levi, M., Greenspan, H., Shaked, N. T. Automated analysis of individual sperm cells using stain-free interferometric phase microscopy and machine learning. Cytometry Part A. 91, (9), 893-900 (2017).
  39. Roitshtain, D., et al. Quantitative phase microscopy spatial signatures of cancer cells. Cytometry Part A. 91, (5), 482-493 (2017).
  40. Lam, V. K., Nguyen, T. C., Chung, B. M., Nehmetallah, G., Raub, C. B. Quantitative assessment of cancer cell morphology and motility using telecentric digital holographic microscopy and machine learning. Cytometry Part A. (2017).
  41. Pavillon, N., Hobro, A. J., Akira, S., Smith, N. I. Noninvasive detection of macrophage activation with single-cell resolution through machine learning. Proceedings of the National Academy of Sciences. (2018).
  42. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). Journal of Visualized Experiments. (41), e1546 (2010).
  43. Takeda, M., Ina, H., Kobayashi, S. Fourier-transform method of fringe-pattern analysis for computer-based topography and interferometry. Journal of the Optical Society of America. 72, (1), 156-160 (1982).
  44. Debnath, S. K., Park, Y. Real-time quantitative phase imaging with a spatial phase-shifting algorithm. Optics Letters. 36, (23), 4677-4679 (2011).
  45. Kim, K., et al. High-resolution three-dimensional imaging of red blood cells parasitized by Plasmodium falciparum and in situ hemozoin crystals using optical diffraction tomography. Journal of Biomedical Optics. 19, (1), 011005 (2013).
  46. Vercruysse, D., et al. Three-part differential of unlabeled leukocytes with a compact lens-free imaging flow cytometer. Lab on a Chip. 15, (4), 1123-1132 (2015).
  47. Kim, K., et al. Correlative three-dimensional fluorescence and refractive index tomography: bridging the gap between molecular specificity and quantitative bioimaging. Biomedical Optics Express. 8, (12), 5688-5697 (2017).
  48. Shin, S., Kim, D., Kim, K., Park, Y. Super-resolution three-dimensional fluorescence and optical diffraction tomography of live cells using structured illumination generated by a digital micromirror device. arXiv preprint. arXiv:1801.00854 (2018).
  49. Chowdhury, S., Eldridge, W. J., Wax, A., Izatt, J. A. Structured illumination multimodal 3D-resolved quantitative phase and fluorescence sub-diffraction microscopy. Biomedical Optics Express. 8, (5), 2496-2518 (2017).
Etikett-fri identifiering av lymfocyter undertyper med hjälp av tredimensionell kvantitativ fas Imaging och Machine Learning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yoon, J., Jo, Y., Kim, Y. S., Yu, Y., Park, J., Lee, S., Park, W. S., Park, Y. Label-Free Identification of Lymphocyte Subtypes Using Three-Dimensional Quantitative Phase Imaging and Machine Learning. J. Vis. Exp. (141), e58305, doi:10.3791/58305 (2018).More

Yoon, J., Jo, Y., Kim, Y. S., Yu, Y., Park, J., Lee, S., Park, W. S., Park, Y. Label-Free Identification of Lymphocyte Subtypes Using Three-Dimensional Quantitative Phase Imaging and Machine Learning. J. Vis. Exp. (141), e58305, doi:10.3791/58305 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter