Summary
节点和脊索板是小鼠胚胎发育过程中的瞬态信号组织者, 可以使用多种技术进行可视化。在这里, 我们详细地描述了如何执行两种技术来研究它们的结构和形态发生: 1) 扫描电子显微镜 (sem);和 2) 全安装免疫荧光 (wmif)。
Abstract
植入后小鼠胚胎在胃形成和形态发生后发生重大形态变化。形态发生的一个标志是从经过原始条纹的细胞中形成瞬态组织者、节点和脊索板。这些信号中心的适当形成对于身体计划的发展至关重要, 将它们形象化的技术对小鼠发育生物学家来说是非常重要的。在发育的胚胎日 (e) 7.5 周围, 结节和脊索板位于排卵小鼠胚胎的腹侧表面。该节点是一个杯状结构, 其细胞拥有一个单一的纤细纤毛每个。正常的亚细胞定位和旋转的纤毛在节位决定左右不对称。脊索板细胞也拥有单一的纤毛, 尽管比结节细胞短。脊索板块形成脊索, 是体细胞发生和神经模式的重要信号组织者。由于结节和脊索板的细胞在表面瞬时存在并具有纤毛, 因此可以用扫描电镜 (sem) 进行可视化。在细胞水平上用于可视化这些结构的其他技术包括使用对在节点和脊索板中高度表达的蛋白质的抗体的整体安装免疫荧光 (wmif)。在本报告中, 我们描述了我们优化的协议, 以执行 sem 和 wmif 的节点和脊索板在发展小鼠胚胎, 以帮助评估组织形状和细胞组织中的野生类型和造血突变胚胎。
Introduction
胃形成和伴随的形态发生运动是塑造小鼠胚胎1 的关键。形态发生过程中细胞形态和组织的变化决定了位置信息来调节细胞的命运, 也允许随后的信号通路精确地履行其功能, 使新形成的胚芽层 1多样化。节点和脊索等瞬态组织结构和信号中心的形成是发展方案2的关键。发育生物学家使用了各种技术来研究这些结构的形态发生, 其中最值得注意的是利用细胞记者和活体体外成像来跟踪细胞和亚细胞行为的动态2 ,3,4。在本报告中, 我们重点描述了我们针对其中两种技术的优化协议的细节: 扫描电子显微镜 (sem) 和整个安装免疫荧光 (wmif), 它们过去和现在都有助于研究节点的形态发生和脊索板, 脊索的前兆。
小鼠胚胎结节是一种泪滴状的细胞杯, 位于小鼠胚胎腹侧表面, 位于胃形成和形态发生的早期至晚期头褶皱阶段 (胚胎日, e7.5-e8)2,5, 6,7。脊索板形态上从节点3前发。结节和脊索板中的每个细胞的特征都是单个纤毛突出到外部, 在结节细胞中的长度较长, 但其长度随发育阶段2的不同而变化。在节点坑中纤毛的旋转已被证明是重要的信号, 决定左右不对称 4.脊索板是脊索的前兆, 是对相邻体细胞和覆盖神经管3的图案很重要的信号中心。
由于位置 (表面)、形状 (杯) 和具有独特的外部细胞结构 (纤毛) 的属性, sem 传统上被用来可视化节点和脊索板, 并研究它们的形成和结构2,7. 扫描电镜还用于研究影响胃窝、形态发生以及纤毛形成 8、9、10的突变中节点本身或细胞纤毛结构的变化。sem 是一种利用聚焦电子束询问生物标本等材料外表表面超微结构的技术.如我们在步骤1中所述, 样品通常是固定的、干燥的, 然后用金属进行溅包布, 以便在扫描电子显微镜下进行观察。
wmif 是一种染色技术, 用于在三维维度 (3d) 中可视化基因产品, 如蛋白质。组织、器官甚至整个生物体的 wmif 提供有关信号分布和三维生成结构形状的空间信息。该技术是基于固定样品, 然后用荧光共轭染色。小鼠胚胎 ~ e7.5 体积小, 透明, 因此是 wmif 协议可视化节点和脊索板的理想选择。例如, 转录因子 barchyury (t) 在节点和脊索板的细胞核中表达, 在较小程度上表达在原始条纹中, 大约在 e7.5-e8 的胚胎发育和 wmif 对 t 的良好工作抗体中, 这些都是商业上的并使染色程序成为可能。结节和脊索板的细胞也具有收缩的顶端表面, 面对外部, 因此可以用荧光共轭 Phalloidin 染色, 以标记 f-actin 在顶端收缩。如我们在步骤 2 8中所示, 以这些试剂为例, wmif 的 t 和 f-acin 染色的结合为三维中的节点和脊索板提供了一个表达。然而, 纤毛的标记, 如 arl13b 或乙酰化管蛋白, 以及节点和脊索板的其他标记, 如 foxa2, 也可用于执行 wmif 对发展小鼠胚胎3,4。
我们已经证明, 条纹相互作用蛋白 1 (strip1) 是必不可少的正常胃和形态发生的小鼠胚胎 8.strip1 是条纹相互作用的磷酸酶和激酶复合物 (stripak) 的核心组成部分, 我们和其他人在肌动蛋白细胞骨架组织8,12中涉及了这一点。strip1突变体胚胎的一个主要缺陷是轴向中胚层 (节和脊索板) 的形成和前后体轴的延伸。我们用 sem 和 wmif 分析了野生类型 (wt) 和 strip1 突变体胚胎中的节点和脊索板, 并在代表性结果和相应的数字中显示了这一结果。
Protocol
所有涉及动物实验的实验都得到了北莱茵威斯特伐利亚 (lanuv-nrw) 主管当局的批准。
1. 小鼠胚胎结节的扫描电子显微镜
- 在 ~ e7.5 (2-4 至4体细胞期) 通过宫颈脱位产下, 为怀孕的雌性小鼠做出牺牲。小鼠胚胎实验室手册13中提供了带有步骤 1.1-1.7 图表的详细说明。
- 通过皮肤和肠系膜打开腹部, 用剪刀和细钳切除子宫。
- 用蒸馏水将子宫短暂冲洗, 并将其放入含有1x 磷酸盐缓冲盐水 (pbs) 的清洁培养皿 (6 厘米) 中。
- 在解剖显微镜下, 使用精细的钳子, 取出子宫肌肉, 以释放个别的脱落或植入部位。
- 用一对钳子固定每个脚折器, 并使用另一对在红色部分 (未来胎盘) 和白色部分 (胚胎所在的地方) 之间进行纵向全厚度切口。沿决定的白色部分垂直进行浅表穿孔, 与切口相邻。将决策头水平地分开成两半, 并小心地挖出决策条白色部分中的胚胎。
- 用新鲜的消毒 pbs 将胚胎移植到新的培养皿 (35 毫米)。对所有脱落的胚胎重复上述步骤。
- 从每个胚胎中取出 reichert 的膜, 这是一个相对不透明的膜, 吞没胚胎, 它像从胎盘锥 (带红色植入部位) 开始的袜子一样将其游走。对于基因分型, 在这个阶段取一个小片 (~ 0.1 毫米2) 的蛋黄囊。
- 在化学罩下, 佩戴适当的保护 (手套), 在室温下, 将胚胎转移到由2.5% 戊二醛组成的 em 级固定剂, 在室温下, 在经过消毒过滤的 pbs 中, 将胚胎转移到 em 级固定剂中。在4°c 下将胚胎隔夜修复。
- 小心地从试管中取出戊二醛固定剂, 而不接触胚胎, 并丢弃在适当的废物容器中。在经过消毒滤过的 pbs 中清洗胚胎三次, 在室温下每次15分钟。
- 在乙醇系列中使胚胎脱水 5分钟: 50%、70%、85%, 100% 或绝对乙醇3次。将胚胎储存在-20°c 的乙醇中, 或直接进入下一步。
- 将乙醇中的胚胎转移到篮子中, 以便在临界点干燥机中进行临界点干燥 (cpd)。在房间里装满乙醇, 使篮子完全覆盖。
- 在10°c 下, 用液体 co2 仔细冲洗 10次, 将乙醇交换。在最后一步后排出液体co2 , 直到腔内半满。加热至 40°c, 直到压力达到80巴 (临界点), 液体co2变为气体。等待 10分钟, 然后慢慢吹掉气体约45分钟。
- 作为干燥 cpd 的一种更容易替代的方法, 在乙醇中的胚胎中加入1:1 的六甲基二硅烷 (hmds) 30分钟。然后将胚胎转移到纯 hmds 30分钟内, 用移液器将胚胎从液体中取出, 使其干燥30分钟。
注: 两种干燥方法在我们手中同样有效。 - 使用精细的刷子将干燥的胚胎安装在双面胶带的 sem 存根上。
- 将螺柱与胚胎插入用于金颗粒涂层的溅射涂布机中, 该涂布可用于为细长的纤毛充电。应用一层 120-150;时间取决于电流, 这将因每个样本而异。
- 将涂覆的螺柱与胚胎一起放入 sem 显微镜中, 应用真空观察胚胎节和具有纤毛的贵族板细胞, 放大倍率从1000x 到 15, 000x 不等。
2. 小鼠结点和外型板的全贴免疫荧光
- 使用冰凉 pbs 与 0.05% tween 20 (pbstw), 按照上面的步骤 1.1-1.7 去除在 e7.75 的胚胎, 并将它们放在 pbstw 在一个35毫米 petri 菜在冰上。
- 在化学罩下, 佩戴适当的保护 (手套), 将胚胎转移到微离心管中 pbs 中4% 的甲醛的固定溶液中。在4°c 下将胚胎隔夜修复。
- 小心地从试管中取出甲醛固定剂, 而不接触胚胎, 并丢弃在适当的废物容器中。在含有 0.2% triton x-100 (pbstr) 的 pbs 中每次在室温下清洗胚胎 3次5分钟。在一个疯狂的振荡器上执行所有的清洗和下一个孵化步骤。
- 取出最后一次洗涤, 并添加含有 pbstr 的阻滞液与10% 的热灭活血清 (从二级抗体的宿主物种)。在4°c 下, 用坚果从2小时阻挡到过夜 (或更长时间)。
- 去除阻塞性抗体的阻塞, 并在阻断溶液中添加 ~ 1 毫升, 例如在1:500 稀释时的抗 t 抗体。在4°c 下用坚果隔夜 (或更长时间) 孵化。
- 将原发抗体取出, 保存后使用, 方法是将氮化钠添加到0.02% 的最终浓度 (20% 的库存为1毫升的抗体溶液中的 1μl) 中。该抗体可重复使用 ~ 10次。用 pbstr 将胚胎冲洗两次, 然后在4°c 时用坚果每次清洗三次, 每次30分钟。
- 将洗涤替换为荧光共轭二级抗体, 针对主要抗体宿主物种, 在大约1:1000 夜间 (或更长时间) 在4°c 时在坚果上稀释。
- 取出二级抗体, 用 pbstr 冲洗两次, 然后用 pbstr 冲洗三次, 时间为30分钟。
- 将最后一次清洗改为含有 1: 500 荧光共轭吡华定的 pbstr, 以染色 f-actin 和 1:500 dapi, 在室温下染色核1小时。
- 在 pbstr 中冲洗两次, 在室温下用 pbstr 清洗一次, 时间为30分钟。
- 用 pbs 取代 pbstr, 并将胚胎留在冰上。准备干净的正电荷幻灯片 (60 x 24 毫米) 和盖板 (24 x 24 毫米) 和水甘油为基础的安装介质, 例如, 在1xpbs 中的90% 甘油和抗褪色试剂, 以安装胚胎。
- 将两片透明胶带放在幻灯片的透明部分, 距离彼此约15毫米。这将创建足够的3d 空间 (在 z 维度中), 允许扁平的胚胎, 但不会完全压扁它们。
- 在解剖显微镜下, 使用切割的 p200 移液器将胚胎小心地移动到滑梯上 (以便为胚胎转移而不损坏足够的空间)。
- 使用精细的钳子, 在卵黄囊的侧侧进行两次全切, 以展开胚胎。将胚胎与腹侧 (节和脊索板) 向上 (神经管的背侧向下滑动) .
- 在胚胎上加入50μl 的安装介质。每张幻灯片放置4-5 个胚胎。在盖板的一侧添加一个安装介质, 首先接触滑梯 (顶部或底部), 然后将其跨跨两片胶带, 用细钳或弯曲的细针将其慢慢降低到胚胎上, 同时避免产生气泡。
- 使用吸水擦拭清洁多余的安装介质。请注意, 不要在过程中移动盖板。
- 使用大量的指甲油, 在不移动的情况下密封盖板的两侧。
- 在扫描共聚焦显微镜下观察。
Representative Results
为了考察在 ~ e7.5 的 wt 和strip1突变体胚胎中节点的形成, 我们使用了 sem, 如步骤1所示, 如图 18 所示。使用 sem 的外部拓扑的超微结构细节是相当丰富的, 这是很清楚的, 不像坑形节点在 wt 胚胎, 突变的胚胎有一个扁平和不规则的节点。胚胎的较高放大倍率显示出明显识别它们的结节细胞上的特征纤毛。突变体中纤毛密度明显较低, 可能是由于节点坑结构和曲率的丧失或节体细胞数量的减少造成的。从节点上出现的脊索板在突变体胚胎中也是不规则的。它们的纤毛较短, 是可以辨认的。因此, 扫描电镜对揭示条纹1 突变体8的节体形态发生缺陷具有重要意义。我们在以前的研究中也使用了 sem 来显示缺乏中心的突变体的胚胎节点中没有纤毛, 而这些突变体为纤毛9提供了模板。
为了在细胞水平上研究strip1突变体胚胎的轴向中胚层形成缺陷, 我们使用了 wmif, 如步骤2所述, 如图 2所示。利用该技术, f-肌酸和 t 染色可方便地识别结节和脊索板。wt 节和脊索板细胞具有收缩的顶端, 其中 f-actin 丰富, 核 t 染色明显。在 wt 中, 脊索板的正常扩张, 但在突变体中则是短而不规则的。结果表明, 在突变体胚胎的不同胚层中, 包括轴向中胚层 8, f-actin 组织是不正常的。因此, wmif 有助于研究strip1突变体胚胎中节点和脊索板形成的缺陷。
图 1.扫描电镜显示条纹1突变体小鼠胚胎的节体形态发生缺陷.(上图)wt 和条纹 1突变体腹侧胚胎结节和脊索板 (nooto)8的扫描电镜分析。一个 wt 胚胎的低放大倍率图像的例子显示在左边。(底部)较高的放大倍率的节点中心显示在顶部显示从节点细胞突出的长单群。前部是在所有面板。刻度条:30 微米. 请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 2.全安装免疫荧光显示了 strip1突变体胚胎细胞水平上的异常结节和脊索板.(上图)wmif 的中度三维渲染 (速度软件) 在 wt 和strip1突变体胚胎上使用荧光共轭吡蛋白 (f-actin, 红色) 和 t 抗体 (绿色) 染色的组合。(底部)上面显示的更多的染色例子集中在具有更高的变焦的节点上, 并包括 dapi。前部是在所有面板。刻度条:30 微米. 请点击这里查看这个数字的更大版本.
Discussion
在这项工作中, 我们演示了如何执行 sem 和 wmif, 以可视化小鼠胚胎节点和脊索板。消化小鼠胚胎的小尺寸 ~ e7.5 和这些结构在表面的存在使它们成为使用2,7,8所述技术进行研究的理想选择。良好的抗体, 如 t 和纤毛标记的可用性, 提供了优秀的3d 信息使用 wmif 的结构, 组织和形成这些必要的胚胎组织者8。
由于小鼠胚胎发育的速度非常快, 而结节和脊索板只是在胚胎表面瞬时存在, 因此时间安排对这些实验的成功至关重要 2,3。例如, 2-4 体细胞胚胎有利于长纤毛成熟结点坑的 sem 分析。在更早或更晚的胚胎中 (例如, 在之前或之后 12小时), 节点可能不存在于表面。wmif 在这方面的灵活性要大一些, 但结构本身在开发过程中也是短暂的, 在这种情况下的时间取决于研究人员的兴趣。
试剂的纯度对于这些技术的成功也是必不可少的, 特别是在用 sem 探测超微结构时, 粘附在胚胎上的微小杂质通常会产生巨大的伪影。
我们已经测试了两种不同的胚胎固定方法的 sem 一使用半 karnovsky 的固剂 (2.5% 戊二醛, 2% 的甲醛和 0.1 m 的 cacodyyyyyyatyin 缓冲液) 和更简单的2.5% 戊二醛在 1x pbs。我们更喜欢使用步骤1中描述的戊二醛和 pbs 固相剂, 但是, 我们和其他人也成功地使用了半 karnovsky 的固定剂进行 sem。
我们还比较了两种为 sem 干燥胚胎的方法, 并发现使用关键点干燥器或 hmds 在样品质量上没有差异, 如步骤1所述, 并在其他地方第14报告。
对于步骤 2, 我们在安装在35毫米玻璃底盘上的1% 低熔融琼脂糖的最后清洗步骤后, 测试了胚胎的包埋, 然后用 ~ 10μl 的安装介质将其覆盖。这种嵌入方法的工作原理和保留了胚胎和相关结构的原始三维结构;然而, 需要一个多光子显微镜来成像标本, 因为一个规则的共聚焦显微镜不能深入到完整的胚胎 (~ 1 毫米) 深处。
我们认为, 利用这两种技术, 在正常发育过程中, 节点和脊索板的结构以及在表明这些结构形成缺陷的突变体中, 提供了互补的信息。
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
h. b. 由医学院和科隆大学的 sfb829 提供启动资金。c. x. 由 dfg 赠款 ba 5810/1 提供支持。我们要感谢 cecad 研究中心和纪念斯隆·凯特林癌症中心 (美国纽约) 的成像设施。我们感谢华金·格雷戈-贝萨 (西班牙国家心血管研究中心, 西班牙马德里) 在为 wmif 安装胚胎方面的见解。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,1,1,3,3,3 Hexamethyldisilazane (HMDS) | Carl Roth | 3840 | |
| Anti-T antibody | R&D Systems | AF2058 | |
| Critical Point Dryer | Blazers Union | CPD 020 | |
| DAPI | AppliChem | A4099,0005 | |
| Glutardialdehyde solution 25% | Merck | 1042390250 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-100ML | |
| Tween 20 | AppliChem | A4974,0500 | |
| SEM coating unit PS3 | Agar Aids for Electron Microscopy | PS3 | |
| SEM microscope Quantum FEG 250 | ThermoFisher Scientific (FEI) | Quantum FEG 250 |
References
- Rivera-Pérez, J. A., Hadjantonakis, A. K. The dynamics of morphogenesis in the early mouse embryo. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , (2015).
- Lee, J. D., Anderson, K. V. Morphogenesis of the node and notochord: The cellular basis for the establishment and maintenance of left-right asymmetry in the mouse. Developmental Dynamics. 237 (12), 3464-3476 (2008).
- Balmer, S., Nowotschin, S., Hadjantonakis, A. K. Notochord morphogenesis in mice: Current understanding and open questions. Developmental Dynamics. 245 (5), 547-557 (2016).
- Yoshiba, S., et al. Cilia at the node of mouse embryos sense fluid flow for left-right determination via Pkd2. Science. , (2012).
- Jurand, A. Some aspects of the development of the notochord in mouse embryos. Journal of Embryology and Experimental Morpholog. 32 (1), 1-33 (1974).
- Poelmann, R. E. The head-process and the formation of the definitive endoderm in the mouse embryo. Anatomy and Embryology (Berl). , 41-49 (1981).
- Sulik, K., et al. Morphogenesis of the murine node and notochordal plate. Developmental Dynamics. 201 (3), 260-278 (1994).
- Bazzi, H., Soroka, E., Alcorn, H. L., Anderson, K. V. STRIP1, a core component of STRIPAK complexes, is essential for normal mesoderm migration in the mouse embryo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (51), 10928-10936 (2017).
- Bazzi, H., Anderson, K. V. Acentriolar mitosis activates a p53-dependent apoptosis pathway in the mouse embryo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (15), 1491-1500 (2014).
- Huangfu, D., Liu, A., Rakeman, A. S., Murcia, N. S., Niswander, L., Anderson, K. V. Hedgehog signalling in the mouse requires intraflagellar transport proteins. Nature. 426 (6962), 83-87 (2003).
- McMullan, D. Scanning electron microscopy 1928-1965. Scanning. 17 (3), 175-185 (2006).
- Bai, S. W., et al. Identification and characterization of a set of conserved and new regulators of cytoskeletal organization, cell morphology and migration. BMC Biology. 9, (2011).
- Behringer, R., Gertsenstein, M., Vintersen Nagy, K., Nagy, A. Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Fourth Edition. Cold Harb Lab Press. , (2014).
- Braet, F., De Zanger, R., Wisse, E. Drying cells for SEM, AFM and TEM by hexamethyldisilazane: a study on hepatic endothelial cells. Journal of Microscopy. 186, Pt 1 84-87 (1997).
