Summary
La placa notocordal y nodo son transitorios los organizadores en el desarrollo de embriones de ratón que pueden visualizarse mediante varias técnicas de señalización. Aquí, describimos en detalle cómo realizar dos de las técnicas para estudiar su estructura y morfogénesis: 1) microscopía electrónica de barrido (SEM); y 2) todo Monte inmunofluorescencia (WMIF).
Abstract
El embrión de ratón tras el implante sufre cambios de forma importante tras el inicio de la gastrulación y la morfogénesis. Un rasgo distintivo de la morfogénesis es la formación de los organizadores transitorias, el nodo y la placa notocordal, de células que han pasado a través de la línea primitiva. La adecuada formación de estos centros de señalización es esencial para el desarrollo del plan corporal y técnicas para visualizarlos son de gran interés para los biólogos del desarrollo del ratón. El nodo y la placa notocordal se encuentran en la superficie ventral de embriones gastrulating de ratón embrionario día 7.5 (E) de desarrollo. El nodo es una estructura en forma de Copa, cuyas células poseen un cilio delgado solo cada. La adecuada localización subcelular y la rotación de los cilios en el hoyo de nodo determina la asimetría izquierda-derecha. Las células de la placa notocordal también poseen cilios sola aunque más cortas que las de las células del nodo. La placa notocordal forma la notocorda, que actúa como un organizador de señalización importante para somitogenesis y patrones neuronales. Porque las células de la placa notocordal y nodo transitoriamente presentes en la superficie y poseen cilios, ellos pueden ser visualizados mediante microscopía electrónica (SEM). Entre otras técnicas utilizadas para visualizar estas estructuras a nivel celular es todo montaje inmunofluorescencia (WMIF) usando los anticuerpos contra las proteínas que se expresaron altamente en el nodo y la placa notocordal. En este informe, describimos a nuestros protocolos optimizados para llevar a cabo la SEM y WMIF de la placa notocordal y nodo en embriones de ratón en desarrollo para ayudar en la evaluación de la forma de tejido y organización celular de tipo salvaje y mutante embriones de gastrulación.
Introduction
Gastrulación y los movimientos morfogenéticos que son cruciales para formar el embrión de ratón1. Los cambios en la forma celular y organización durante la morfogénesis dictan información posicional para regular el destino celular y también permitir que las vías de señalización subsiguientes precisamente desempeñar sus funciones para diversificar el recién formado capas germinales1. La formación de estructuras de organización transitoria y señalización de centros como el nodo y el notocordio es esencial para la ejecución del programa de desarrollo2. Biólogos del desarrollo han utilizado una variedad de técnicas para el estudio de la morfogénesis de estas estructuras, más notables de los cuales es el uso de celulares y de los reporteros vivo ex vivo la proyección de imagen para seguir la dinámica en el comportamiento celular y subcelular2 ,3,4. En este informe, nos centramos en describir los detalles de nuestros protocolos optimizados para dos de estas técnicas: Análisis de microscopía electrónica (SEM) y todo Monte inmunofluorescencia (WMIF), que fueron y son todavía instrumentales en el estudio de la morfogénesis del nodo y la placa notocordal, el precursor de la notocorda.
El nodo embrionario de ratón es una taza de las células en forma de lágrima que se encuentra en la superficie ventral del embrión del ratón en el temprano a últimas etapas de la doble cabeza durante gastrulation y morfogénesis (día embrionario, E7.5-E8)2,5, 6,7. La placa notocordal morfológicamente emana anterior el nodo3. Cada célula en el nodo y la placa notocordal se caracteriza por un cilio único que sobresale hacia el exterior, que es mayor en las células del nodo pero cuya longitud varía con la etapa de desarrollo2. La rotación de los cilios en el hoyo de nodo se ha demostrado para ser importantes para la señalización que determina asimetría izquierda-derecha4. La placa notocordal es el precursor de la notocorda, el centro de señalización que es importante para el diseño de los somitas adyacentes y el tubo neural que3.
Debido a los atributos del lugar (superficie), forma (Copa) y que poseen distintas estructuras celulares exteriores (cilios), el SEM se ha utilizado tradicionalmente para visualizar el nodo y la placa notocordal y estudiar su formación y estructura de2, 7. SEM también se utiliza para estudiar los cambios en la estructura del nodo sí mismo o los cilios de sus células en las mutaciones que afectan la gastrulación, morfogénesis, así como la formación de cilios8,9,10. SEM es una técnica que utiliza un haz enfocado de electrones para interrogar la ultraestructura topológica de la superficie externa de materiales tales como muestras biológicas11. La muestra es generalmente fijo, secada y luego Farfulle-recubierta con metales para la observación bajo un microscopio electrónico de barrido como se describe en el paso 1.
WMIF es una técnica de tinción para visualizar productos del gen como las proteínas, en tres dimensiones (3D). WMIF de tejidos, órganos u organismos incluso enteros proporciona información espacial sobre la distribución de la señal y la forma de la estructura resultante en 3D. La técnica se basa en la fijación de la muestra entonces la coloración con los conjugados fluorescentes. Embriones de ratón ~ E7.5 son pequeñas y transparentes y por lo tanto ideal para protocolos WMIF visualizar el nodo y la placa notocordal. Por ejemplo, el factor de transcripción Barchyury (T) se expresa en los núcleos de la placa notocordal y el nodo y en menor medida en la línea primitiva, alrededor E7.5-E8 de desarrollo embrionario y buen trabajo anticuerpos contra T por WMIF son comercialmente disponibles y hacer posible el procedimiento de tinción. Las células de la placa notocordal y nodo también se caracterizan por las superficies apicales estrechas, cara el exterior y así pueden ser manchadas con Phalloidin conjugado fluorescencia marca F-actina en la constricción apical. Usando estos reactivos como ejemplos, la combinación de T y F-actina de tinción por WMIF proporciona una representación de la placa notocordal en 3D en embriones gastrulating de ratón y de nodo como se demuestra en el paso 2 8. Sin embargo, también pueden utilizarse marcadores de cilios, como ARL13B o tubulina acetilada, así como otros marcadores de la placa notocordal, como FOXA2 y nodo para realizar WMIF de ratón en desarrollo embriones de3,4.
Hemos demostrado que la proteína de interacción con striatin 1 (STRIP1) es esencial para gastrulation normal y morfogénesis en el embrión de ratón8. STRIP1 es un componente esencial de la interacción con striatin fosfatasas y complejos de cinasas (STRIPAK), que nosotros y otros han implicado en la actinia citoesqueleto organización8,12. Principales defectos en embriones mutantes Strip1 es en la formación del mesodermo axial (nodo y placa notocordal) y extensión del eje corporal antero-posterior. Hemos utilizado SEM y WMIF para analizar el nodo y la placa notocordal en wild-type (WT) y embriones mutantes Strip1 como se muestra en los Resultados de representante y cifras correspondientes.
Protocol
Todos los experimentos que involucran animales de experimentación fueron aprobados por las autoridades responsables en Westfalia Rhein (LANUV-NRW).
1. microscopía electrónica del nodo embrionario de ratón
- Sacrificar el ratón hembra embarazado en ~ E7.5 (2-4 etapa de somite) por dislocación cervical. Una explicación detallada con los diagramas de pasos 1.1 - 1.7 está disponible en embrión de ratón laboratorio manuales13.
- Abrir el abdomen a través de la piel y entresijos y extirpar el útero, usando tijeras y pinzas finas.
- Enjuague el útero brevemente en agua destilada y colóquelo en un plato pequeño de Petri limpia (6 cm) que contiene 1 x solución salina tamponada con fosfato (PBS).
- Bajo un microscopio de disección y con unas pinzas finas, retire los músculos uterinos para los sitios de implantación o deciduae individuales.
- Sujete cada decidua con un par de pinzas y usar el otro par para hacer una incisión longitudinal de espesor total entre la parte roja (futura placenta) y la parte blanca (donde se encuentra el embrión). Hacer perforaciones superficiales verticalmente a lo largo de la parte blanca de la decidua contiguo con la incisión. Separe la decidua horizontalmente en dos mitades y con cuidado sacar el embrión en la parte blanca de la decidua.
- Transferir el embrión a una nueva placa de Petri (35 mm) con PBS estéril filtrada fresca. Repita para todos deciduae embriones.
- Membrana de Reichert, una membrana relativamente opaca que envuelve el embrión, de cada embrión de burlas como un calcetín a partir del cono de ectoplacental (sitio de la implantación de color rojizo). Por genotipificación, tome un pedazo pequeño (~ 0,1 mm2) de la vesícula vitelina en esta etapa.
- Bajo una campana química y usar protección adecuada (guantes), transferir los embriones a EM grado fijador compuesto por glutaraldehído al 2.5% en PBS estéril filtrado en un tubo de microcentrífuga (1.5 mL) a temperatura ambiente. Fijar los embriones durante la noche a 4 ° C.
- Retirar el fijador de glutaraldehido del tubo sin tocar los embriones cuidadosamente y deseche en un contenedor de residuos adecuado. Lavar los embriones tres veces en PBS estéril filtrada, durante 15 min a temperatura ambiente.
- Deshidratar los embriones en una serie de etanol de 5 minutos cada uno: 50%, 70%, 85% y tres veces en 100% o etanol absoluto. Almacenar los embriones a −20 ° C en etanol o vaya directamente al paso siguiente.
- Transferencia de los embriones en etanol a cestas para punto crítico (CPD) de secado en una secadora de punto crítico. Llene la cámara con etanol para cubrir completamente las cestas.
- Intercambiar el etanol por cuidadosamente lavado con líquido de CO2 por diez veces a 10 ° C. Drena líquido CO2 después el último paso hasta que la cámara está medio llena. Calentar hasta 40 ° C hasta que la presión alcanza 80 bares (el punto crítico) y el líquido CO2 cambia a gas. Espere 10 minutos y luego lentamente soplar el gas por aproximadamente 45 minutos.
- Como una alternativa más fácil para CPD para secar, añadir hexamethyldisilazane (HMDS) en una proporción de 1:1 a los embriones en etanol durante 30 minutos. Luego transferir los embriones a HMDS puro durante 30 minutos retirar los embriones en el líquido con una pipeta y dejarlos secar durante 30 minutos.
Nota: Ambos métodos de secado trabajaban igualmente bien en nuestras manos. - Use un pincel fino para montar los embriones secos con el lado ventral (nodo) para arriba en un trozo de SEM con cinta de doble cara.
- Inserte los talonarios con los embriones en una máquina de recubrimiento sputter para la capa de la partícula del oro, que es preferida para cargar los cilios largo y finos. Aplicar una capa de 120-150 Å; el tiempo depende de la corriente, que variará con cada muestra.
- Coloque los talones revestidos con los embriones en un microscopio SEM, aplicar vacío y observe el nodo embrionario y las células de la placa notocordal con cilios con aumentos que van desde 1000 X hasta 15, 000 X.
2. todo inmunofluorescencia de montaje de la placa notocordal y nodo de ratón
- Con PBS helado con 0,05% Tween 20 (PBSTw), siga los pasos 1.1-1.7 arriba para sacar los embriones en E7.75 y en PBSTw en una placa de Petri en el hielo de 35 mm.
- Bajo una campana química y usar protección adecuada (guantes), transferencia de los embriones en una solución fijadora de paraformaldehído al 4% en PBS en un tubo de microcentrífuga. Fijar los embriones durante la noche a 4 ° C.
- Retirar el fijador de paraformaldehido del tubo sin tocar los embriones cuidadosamente y deseche en un contenedor de residuos adecuado. Lavar los embriones tres veces en PBS que contenía 0,2% Tritón X-100 (PBSTr) por 5 min a temperatura ambiente. Realizar el lavado y pasos de incubación en un agitador oscilante.
- Retirar el último lavado y añadir solución de bloqueo que contiene PBSTr con 10% de suero inactivado con calor (de la especie del anticuerpo secundario). Bloque de 2 h durante la noche (o más) en un nutator a 4 ° C.
- Retirar el bloqueo y añadir ~ 1 mL del anticuerpo primario diluido en solución, por ejemplo, un anticuerpo anti-T en dilución 1: 500 de bloqueo. Incubar durante la noche (o más) en un nutator a 4 ° C.
- Quitar el anticuerpo primario y guardarlo para utilizarlo más adelante agregando azida sódica a una concentración final de 0,02% (1 μl del stock de 20% a 1 mL de solución de anticuerpo). El anticuerpo puede ser reutilizado ~ 10 veces. Enjuague los embriones dos veces con PBSTr y luego lavarlos tres veces durante 30 minutos cada uno en un nutator a 4 ° C.
- Sustituir el lavado con un anticuerpo secundario conjugado con fluorescencia, contra la especie primaria del anticuerpo, diluido en ~ 1: 1000 durante la noche (o más) en un nutator a 4 ° C.
- Quite el anticuerpo secundario y enjuague dos veces con PBSTr, a continuación, lave tres veces durante 30 minutos con PBSTr.
- Vuelva a colocar el último lavado con PBSTr que contienen phalloidin conjugado fluorescencia de 1: 500, a la mancha F-actina y 1: 1000 DAPI, para teñir los núcleos, por 1 h a temperatura ambiente.
- Enjuague dos veces en PBSTr y lavar una vez con PBSTr por 30 min a temperatura ambiente.
- Reemplace PBSTr con PBS y dejar los embriones en el hielo. Preparar portaobjetos limpio cargado positivamente (60 x 24 mm) y cubreobjetos (24 x 24 mm) y los medios de medio de montaje acuoso basados en glicerol, por ejemplo, 90% de glicerol en 1xPBS y un reactivo antifade, montar los embriones.
- Poner dos trozos de cinta adhesiva transparente a una distancia de ~ 15 mm uno del otro en la parte clara de la diapositiva. Esto creará suficiente espacio 3D (en la dimensión Z) que permita acoplar los embriones pero no totalmente exprimirlos.
- Con un microscopio de disección, mueva cuidadosamente los embriones utilizando una pipeta de P200 corte (para permitir suficiente espacio para que el embrión a transferir y no dañado) a la diapositiva.
- Con unas pinzas finas, hacer dos cortes completos en los laterales de la vesícula vitelina a desarrollarse el embrión. Coloque el embrión con el lado ventral (nodo y placa notocordal) para arriba (dorsal del tubo neural en la diapositiva).
- Añadir 50 μl de medio de montaje sobre el embrión. Coloque los embriones de 4-5 por diapositiva. Añadir un poco de montaje de los medios de comunicación al lado del cubreobjetos que primero toque la corredera (lado superior o inferior), luego coloque a caballo entre los dos trozos de cinta y bájela lentamente hasta los embriones con pinzas finas o una aguja fina doblada evitando crear burbujas de aire.
- Limpiar los medios de montaje exceso utilizando un paño absorbente. Tenga cuidado de no mover el cubreobjetos en el proceso.
- Con una generosa cantidad de esmalte de uñas, sella los lados del cubreobjetos sin moverla.
- Observar bajo un microscopio de barrido confocal.
Representative Results
Para examinar la formación del nodo en embriones mutantes WT y Strip1 en ~ E7.5, utilizamos SEM como se describe en el paso 1 y se muestra en la figura 18. Los detalles ultraestructurales de la topología exterior mediante SEM fueron bastante informativos y fue inmediatamente claro que a diferencia del nodo en forma de hoyo en embriones de WT, los embriones mutantes un nodo aplanado e irregular. Aumento mayor de los embriones mostró los característica cilios en las células del nodo que identificaron inequívocamente. La densidad aparente menor de cilios en el mutante podría ser atribuible a la pérdida de estructura del nodo hoyo y curvatura o un menor número de las células del nodo. La placa notocordal que aparece protección del nodo también fue irregular en los embriones mutantes. Eran identificables con sus cilios más cortos. Por lo tanto, era importante para revelar los defectos de la morfogénesis de nodo en Strip1 mutantes8SEM. También hemos utilizado SEM en estudios anteriores para demostrar la ausencia de cilios en el nodo embrionario de mutantes que carecen de centriolos, que proporciona la plantilla para cilios9.
Para estudiar los defectos de formación del mesodermo axial en embriones mutantes Strip1 a nivel celular, utiliza WMIF como se describe en el paso 2 como se muestra en la figura 2. Usando esta técnica, el nodo y la placa notocordal se identificaron fácilmente F-actina y T la coloración. Nodo de peso y las células de la placa notocordal han limitado dominios apicales donde F-actina se enriqueció, y tinción nuclear de T era evidente. La placa notocordal extendido rostral en el WT pero fue corto e irregular en el mutante. Los datos mostraron que la organización de la F-actina es anormal en las diferentes capas germinales de los embriones mutantes como el mesodermo axial8. Así, fue instrumental para el estudio de los defectos en el nodo y la formación de la placa notocordal en embriones mutantes de Strip1 WMIF.
Figura 1 . Microscopía electrónica de barrido revela los defectos en la morfogénesis del nodo en embriones de ratón mutante de Strip1 . (Top) Análisis de SEM de la WT y Strip1 mutante ventral embrionaria los nodos y placas notocordal (Noto)8. La izquierda se muestra un ejemplo de una imagen de bajo aumento de un embrión WT. (Parte inferior) Aumentos más altos del centro de los nodos que se muestra en la parte superior revela la larga monocilia que proyecta desde las células del nodo. Anterior es en todos los paneles. Barras de escala: 30 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 . Todo Monte inmunofluorescencia muestra el nodo anormal y placa notocordal a nivel celular en embriones mutantes Strip1 . (Top) Ventral Render 3D (software de Volocity) de WMIF en embriones mutantes WT y Strip1 usando una combinación de conjugado fluorescencia phalloidin (F-actina, rojo) y tinción de anticuerpos (verde) T. (Parte inferior) Más ejemplos de la tinción se muestra sobretodo centrándose en el nodo con mayor zoom e incluyendo DAPI. Anterior es en todos los paneles. Barras de escala: 30 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
En este trabajo demostramos cómo hacer SEM y WMIF para visualizar la placa notocordal y nodo embrionario de ratón. El pequeño tamaño de los embriones gastrulating de ratón ~ E7.5 y la presencia de estas estructuras en la superficie los hacen ideales para el estudio mediante las técnicas descritas2,7,8. La disponibilidad de Buenos anticuerpos como marcadores T y cilios, da excelente información 3D usando WMIF en la estructura, organización y formación de estos organizadores embrionarios fundamentales8.
Porque el desarrollo embrionario del ratón avanza a un ritmo muy rápido y el nodo y la placa notocordal sólo transitoriamente presentes en la superficie del embrión, es esencial para el éxito de estos experimentos2,3. Por ejemplo, 2-4 embriones de somite son buenos para el análisis de SEM de un hoyo del nodo maduro con cilios largos. En embriones mucho antes o después (por ejemplo, 12 h antes o después), el nodo puede no ser presente en la superficie. WMIF es un poco más flexible en este sentido, pero las estructuras ellos mismos también son transitorias durante el desarrollo y el momento en este caso depende de los intereses de los investigadores.
La pureza de los reactivos es también esencial para el éxito de estas técnicas, especialmente en la ultraestructura de sondeo por SEM. Tiny las impurezas que se adhieren a los embriones generalmente resulta en enormes artefactos.
Hemos probado dos métodos de fijación de embriones para SEM uno con fijador de Karnovsky media (glutaraldehído al 2.5%, 2% paraformaldehído y 0.1 M tampón cacodilato) y un más simple glutaraldehído 2.5% en PBS 1 x. Preferimos utilizar el glutaraldehido y PBS fijador como se describe en el paso 1, sin embargo, nosotros y otros han también utilizado fijador de Karnovsky media con éxito para SEM.
También hemos comparado dos métodos de secado de los embriones para SEM y no encontró diferencias en la calidad de la muestra utilizando un secador de punto crítico o HMDS como se describe en el paso 1 y divulgado a otra parte14.
Para el paso 2, probamos incrustar los embriones después de los pasos de lavado final de 1% agarosa de fusión baja montado en un plato de fondo de cristal de 35 mm y luego rematar con ~ 10 μl de medio de montaje. Este método de empotrar funciona y conserva la original estructura 3D del embrión y las estructuras asociadas; sin embargo, un microscopio multifotón es necesaria para la muestra de la imagen porque un microscopio confocal regular no puede llegar tan profundo en los embriones intactos (~ 1 mm).
Creemos que con estas dos técnicas da información complementaria sobre la estructura del nodo y la placa notocordal durante el desarrollo normal como en mutantes que muestran defectos en la formación de estas estructuras.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
M.P. es apoyado por financiación de puesta en marcha de la Facultad de medicina y SFB829 de la Universidad de Colonia. C.X es apoyado por DFG concesión BA 5810/1-1. Nos gustaría dar las gracias a las instalaciones de la proyección de imagen en el centro de investigación CECAD y el Memorial Sloan Kettering Cancer Center (Nueva York, Estados Unidos). Agradecemos a Grego-Bessa de Joaquín (Centro Nacional de Investigación Cardiovascular, Madrid, España) por su penetración en los embriones de montaje para WMIF.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,1,1,3,3,3 Hexamethyldisilazane (HMDS) | Carl Roth | 3840 | |
| Anti-T antibody | R&D Systems | AF2058 | |
| Critical Point Dryer | Blazers Union | CPD 020 | |
| DAPI | AppliChem | A4099,0005 | |
| Glutardialdehyde solution 25% | Merck | 1042390250 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-100ML | |
| Tween 20 | AppliChem | A4974,0500 | |
| SEM coating unit PS3 | Agar Aids for Electron Microscopy | PS3 | |
| SEM microscope Quantum FEG 250 | ThermoFisher Scientific (FEI) | Quantum FEG 250 |
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