Vi præsenterer her, en protokol til isolering af sunde og funktionelle primære mus hepatocytter. Instruktioner til påvisning af hepatisk spirende proteinsyntese af ikke-radioaktive mærkning substrat blev givet til at hjælpe med at forstå de mekanismer, der ligger til grund proteinsyntesen i forbindelse med energi-stofskifte homøostase i leveren.
Hepatocytter er parenkymalt celler i leveren og engagere flere metaboliske funktioner, herunder syntese og sekretion af proteiner afgørende for systemisk energi homøostase. Primære hepatocytter isoleret fra murine leveren udgør et værdifuldt biologiske redskab for at forstå de funktionelle egenskaber eller forandringer opstår i leveren. Heri vi beskrive en metode til isolering og kultur af primære mus hepatocytter ved at udføre en to-trins collagenase perfusion teknik og diskutere deres udnyttelse for at undersøge protein metabolisme. Lever af en voksen mus er sekventielt perfunderet med ethylenglycol-bis tetraacetic syre (EGTA) og collagenase, efterfulgt af isolering af hepatocytter med tæthed gradient buffer. Disse isolerede hepatocytter er levedygtige på kultur plader og vedligeholder størstedelen af begavet Karakteristik af hepatocytter. Disse hepatocytter kan bruges til vurdering af protein metabolisme herunder spirende proteinsyntese med ikke-radioaktive reagenser. Vi viser, at de isolerede hepatocytter styres let og omfatte en højere kvalitet og volumen stabilitet af proteinsyntesen knyttet til energimetabolisme ved at udnytte kemo-selektiv ligatur reaktionen med en Tetramethylrhodamine (TAMRA) protein metode til påvisning og western blotting analyser. Derfor, denne metode er værdifuld for at undersøge hepatisk spirende proteinsyntesen knyttet til energi homøostase. Følgende protokol skitserer de materialer og metoder til isolering af høj kvalitet primære mus hepatocytter og påvisning af spirende proteinsyntesen.
Protein er et vigtigt element, ernæringsmæssige og ca. 50% af tørvægt af en menneskelige krop er sammensat af proteiner, som har flere biologiske egenskaber og funktioner1. Derfor, proteinsyntesen er en af de mest energi forbrugende begivenheder og en ændring i protein metabolisme er stærkt forbundet med udviklingen af sygdomme, herunder metaboliske sygdomme2,3,4. I leveren, proteinsyntese tegner sig for ca. 20-30% af samlede energi forbrug5,6. Derudover proteiner funktion som ikke kun passiv eller byggeklodser af leveren, men også aktive signal-mægle faktorer intracellulært eller extracellularly at regulere den systemiske stofskifte7. For eksempel, reducerede niveauer af serum albumin, der syntetiseres og udskilles af leveren og de mest rigelige proteiner i plasma8, øger risikoen for type 2 diabetes udvikling9,10, 11, hvorimod en højere koncentration af serum albumin er beskyttende mod udvikle stofskiftesyndrom12. Desuden kan forstyrret eller afbrydelse af sekretoriske eller membran-bundet hepatisk proteiner, som modulerer kolesterol homøostase, herunder lipoproteiner, LDLR og LRP1, føre til udviklingen af insulinresistens, hyperlipidæmi eller åreforkalkning 13. derfor identifikation af molekylære patofysiologiske mekanismer, der er involveret i protein metabolisme forstyrrelse i leveren og dens tilknyttede metaboliske komplikationer kan være nyttig for at opdage roman farmakologiske tilgange for at forsinke starten eller behandling af metaboliske sygdomme som insulinresistens, diabetes og ikke-alkoholiske fedtlever.
Proteinsyntese er tæt knyttet til cellulære energi status (f.eks.dannelse af en peptidbinding under trinnet brudforlængelse af proteinsyntesen kræver 4 phosphodiester obligationer14) og er reguleret af molekylære processer, der fornemmer Inter – og intra cellular næringsstoftilgængelighed15,16. AMP-aktiveret protein kinase (AMPK) er en af de intracellulære energi sensorer, at opretholde energi homøostase17. Når AMPK aktiveres når cellulære energi niveauer bliver lavere, funktion AMPK og sin målrettede substrater til at stimulere kataboliske veje og hæmme anabolske processer, herunder protein syntese18,19. Regulering af proteinsyntesen er medieret af fosforylering af flere oversættelse faktorer og ribosomale proteiner20. Af note er pattedyr målet på rapamycin komplekse 1 (mTORC1), en vigtig drivkraft i proteinsyntesen, en af de vigtigste mål i AMPK21. Aktivering af mTORC1 pathway øger cellevækst og spredning af stimulerende proteiner oversættelse og autophagy20,21. Derfor er det logisk, at aktivering af AMPK kan hæmme mTORC1-medieret protein syntese22. Aktivering af AMPK modvirker og direkte phosphorylates mTORC1 på Threonin rester 2446 (Thr2446) fører til dets inaktivering23 og undertrykkelse af protein biosyntesen24. Desuden kan AMPK indirekte hæmme mTORC1 funktionen ved fosforylering og aktivering af knolde sklerose komplekse 2 (TSC2)25 , som er opstrøms af mTORC1 signaling kaskade. Kort sagt, dysregulering af disse veje i leveren er ofte knyttet til udviklingen af metaboliske sygdomme og der er derfor et kritisk behov for at etablere effektive eksperimentelle værktøjer til at undersøge rollen, som disse veje i reguleringen af energi og protein metabolisme i hepatocytter.
Der er en større lighed mellem de funktionelle egenskaber af isolerede primære hepatocytter og i vivo hepatocytter end med in vitro- leveren-afledte celle linjer26,27,28. Det er påvist, at primære humane hepatocytter del 77% lighed med der lever biopsier, hvorimod HepG2 celler, som er godt differentieret hepatisk kræftceller og almindeligt anvendt til at undersøge hepatisk funktioner, vise mindre end 48% i forbindelse med genekspression profiler29. Derfor, udnyttelse af primære hepatocytter, snarere end udødeliggjort kultur celler, er af vital betydning i efterforskningen af leverens funktion og fysiologi, og flere protokoller er tilgængelige for isolation og kultur af primære hepatocytter især fra rotter30,31. Mens rotte hepatocytter er nyttigt med et relativt højere udbytte af celler, har mus hepatocytter et større potentiale i mange videnskabelige aspekter på grund af den store tilgængelighed af genetisk moduleret mus. Der er dog flere tekniske udfordringer i isolere sund og rigelige primære hepatocytter fra mus for Cellulær og molekylær-baserede vurderinger: første kanyle indsættelse til perfuse leveren med buffer reagenser er meget vanskeligt at håndtere på grund af den lille og tynd mus portal vene eller ringere vena cava; for det andet kan længere manipulation af celler under isolation medføre reduktion i celle kvantitet og kvalitet; tredje, ikke-enzymatisk mekanisk separation metoder kan resultere i alvorlige skader og producere et lavt udbytte af levedygtige isolerede primære hepatocytter32,33. I 1980 ‘ erne, blev collagenase perfusion teknik introduceret til isolering af hepatocytter fra lever af dyr34. Denne metode er baseret på collagenase perfusion af lever35,36,37, infusion af leveren med calcium chelator løsning38,39, enzymatisk fordøjelse og mekanisk dissociation af hepatisk parenkym35. I det første skridt, er en mus lever perfunderet med en calcium [Ca2 +] gratis buffer indeholdende en [Ca2 +] chelator (ethylendiamin tetraacetic acid, EDTA). I andet trin af er musen leveren perfunderet med en collagenase-holdige buffer at hydrolysere cellulære-ekstracellulære matrix interaktioner. I modsætning til den buffer, der bruges i trin et, tilstedeværelsen af [Ca2 +] ioner i buffer på det andet trin er nødvendige for effektiv collagenase aktivitet, hvorefter fordøjet leveren har yderligere forsigtigt og mekanisk adskilles ved hjælp af pincet mellem den hepatisk kapsel og parenkyme væv. Endelig, bindevæv er fjernet ved filtrering, og efterfølgende centrifugering adskiller levedygtige hepatocytter fra både ikke-parenkymalt celler og ikke-levende hepatocyt med brug af tæthed gradient buffer40,41 ,42. I den foreliggende undersøgelse viser vi en modificeret totrins collagenase perfusion teknik til at isolere primære hepatocytter fra en mus lever til analyse af proteinsyntesen.
Radiolabeling af proteiner er meget udbredt at kvantificere niveauerne for udtryk, omsætning satser, og fastlægge biologiske fordelingen af proteiner43 som følge af den høje følsomhed påvisning af radioaktivitet44. Anvendelse af radioaktive isotoper kræver imidlertid meget kontrolleret forskning omstændigheder og procedurer45. Alternative ikke-radioaktive metoder er blevet udviklet og har i stigende grad vundet i popularitet. Kemo-selektiv ligatur reaktion med en Tetramethylrhodamine (TAMRA) protein påvisningsmetode er en af dem og er baseret på den kemo-selektiv reaktion mellem et indeholder og alkyn grupper46, som kan udnyttes til at analysere cellulære begivenheder såsom påvisning af spirende proteinsyntesen og underklasser af glykoproteiner modificeret med en indeholder gruppen. For spirende proteinsyntese, kan L-Azidohomoalanine (L-AHA, en indeholder-ændret aminosyre) metabolisk indarbejdet i proteiner og påvises ved hjælp af TAMRA protein opdagelse metode47. Ved hjælp af denne analyse i primære mus hepatocytter, vi viser, den spirende proteinsyntese sats er tæt knyttet til tilgængeligheden af ATP fra mitokondrie og AMPK aktivering (figur 1).
I Resumé, udnyttelse af primære mus hepatocytter er afgørende at undersøge protein og energi metabolisme og kvantificere spirende proteinsyntesen er værdifulde for at få indsigt i den fysiologiske rolle af veje, der er relevante for udviklingen og helbredelse af hepatocyt-relaterede sygdomme.
Selv om flere udødeliggjort hepatisk cellelinjer har været foreslået og brugt til at undersøge leveren fungerer49,50,51,52, mangler disse celler generelt den vigtige og grundlæggende funktioner af normale hepatocytter, som udtryk for albumin (figur 3). Det er derfor almindeligt anerkendt, at udnytte primære hepatocytter er en værdifuld mulighed for at behand…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Drs. Joonbae Seo og Vivian Hwa for deres videnskabelige input og drøftelser. Dette arbejde blev støttet af National Institute of Health (NIH) (R01DK107530). T.N. blev støttet af PRESTO fra Japan videnskab og teknologi agentur. En del af denne undersøgelse blev støttet af en bevilling fra NIH (P30DK078392) for mave sygdom forskning Core Center i Cincinnati.
HEPES buffer | Fisher Scientific | BP310-500 | |
D-glucose | Fisher Scientific | D16-500 | |
Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-tetraacetic acid | AmericanBio | AB00505-00025 | |
Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240-062 | |
HBSS (10X) no calcium, magnesium, phenol red | Gibco | 14185-052 | |
Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2.2H2O) | Fisher Scientific | C79-500 | |
Density gradient buffer | GE Healthcare | 17-0891-02 | |
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) low glucose, pyruvate | Gibco | 11885-084 | |
Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30910.03 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) (1X) | Gibco | 1897141 | |
Williams medium E, no glutamine | Gibco | 12551-032 | |
L-alanyl-L-glutamine dipeptide supplement | Gibco | 35050-061 | |
Collagenase Type X | Wako Pure Chemical Industries | 039-17864 | |
Perfusion pump | Cole-Parmer | Masterflex L/S | Equipment |
IV administration set | EXELINT | 29081 | Equipment |
A water bath | REVSCI | RS-PB-200 | Equipment |
Tube heater | Fisher Scientific | Isotemp | Equipment |
Ethanol | Decon Lab, Inc | 0-39613 | |
Isoflurane | PHOENIX | 10250 | |
Autoclaved Cotton Tips | Fisherbrand | 23-400-124 | |
100 mm Petri Dish | TPP | 93100 | |
Connector (Male Luer Lock Ring) | Cole-Parmer instrument | EW-4551807 | |
24G catheters | TERUMO | Surflo 24Gx3/4' | |
100 μm Filter (CELL STRAINERS) | VWR | 10199-658 | |
15 ml conical-bottom centrifuge tubes | VWR | 89039-666 | |
50 ml conical-bottom centrifuge tubes | VWR | 89039-658 | |
Chemoselective ligation reaction PROTEIN ANALYSIS DETECTION KIT, TAMRA ALKYNE | Invitrogen | C33370 | |
AHA (L-azidohomoalanine) | Invitrogen | C10102 | |
DMEM (methionine free) | Gibco | 21013024 | |
L-Cystine Dihydrochloride | SIGMA | C2526 | |
Laemmli sample buffer | BioRad | 161-0737 | |
Protease Inhibitor Cocktail | SIGMA | P9599 | |
SDS solution (20%) | BioRad | 161-0418 | |
Tris-HCL (1M) | American Bioanalytical | AB14044-01000 | |
Phosphatase Inhibitor Cocktail | SIGMA | P5726 | |
Protein concentration measuring Kit (Bovin Serum Albumin-BSA) | BioRad | 500-0207 | |
6-well tissue culture plate | TPP | 92006 | |
Digital Heatblock | VWR | 12621-092 | Equipment |
Multi-Rotator | Grant-bio | PTR-60 | Equipment |
Ultrasonic Sonicator | Cole-Parmer | GE130PB | Equipment |
Standard Heavy-Duty Vortex Mixer | VWR | 97043-566 | Equipment |
A variable mode laser scanner | GE Healthcare Life Science | FLA 9500 | Equipment |
Coomassie-dye reagent | Thermo Scientific | 24594 | |
Inverted microscope | Olympus | CKX53 | Equipment |
Western Blotting apparatus | BioRad | 1658004 | Equipment |
Centrifuge | Eppendorf | 5424R | Equipment |
Automated cell counter | BioRad | TC20 | Equipment |
FluorChem R system | proteinsimple | – | Equipment |
p-Ampka (T172) antibody | Cell signaling | 2535 | |
Total-AMPK antibody | Cell signaling | 5832 | |
Albumin antibody | Cell signaling | 4929 | |
beta actin antibody | Santa Cruz | sc-130656 | |
Fine scissors and forceps |