Summary
Qui, presentiamo un protocollo per l'isolamento degli epatociti primari del topo sano e funzionale. Istruzioni per la rilevazione sintesi epatica delle proteine nascenti dal substrato di etichettatura non radioattivo erano fornite per aiutarvi a comprendere i meccanismi alla base della sintesi proteica nel contesto dell'omeostasi del metabolismo energetico nel fegato.
Abstract
Gli epatociti sono cellule parenchimatiche del fegato e coinvolgere più funzioni metaboliche, tra cui la sintesi e la secrezione di proteine essenziali per l'omeostasi energetica sistemica. Epatociti primari isolati dal fegato murino costituiscono un prezioso strumento biologico per comprendere le proprietà funzionali o le alterazioni che si verificano nel fegato. Qui descriviamo un metodo per l'isolamento e la coltura di epatociti primari del topo eseguendo una tecnica di perfusione in due fasi della collagenosi ed discutere la loro utilizzazione per indagare il metabolismo delle proteine. Il fegato di un topo adulto in sequenza è irrorato con acido tetraacetico di glicole etilenico-bis (EGTA) e la collagenosi, seguita dall'isolamento degli epatociti con il buffer di gradienti di densità. Questi epatociti isolati sono vitali su piastre di coltura e mantengono la maggior parte delle caratteristiche dotate degli epatociti. Questi epatociti possono essere utilizzati per le valutazioni del metabolismo delle proteine tra cui sintesi proteica nascente con reagenti non radioattivo. Indichiamo che gli epatociti isolati sono facilmente controllati e comprendono una maggiore stabilità di qualità e volume di sintesi delle proteine legata al metabolismo energetico utilizzando la reazione di legatura chemo-selettive con una proteina di tetrametilrodamina (TAMRA) Metodo di rilevazione e analisi macchiantesi occidentali. Pertanto, questo metodo è prezioso per lo studio di sintesi epatica della proteina nascente collegata all'omeostasi energetica. Il seguente protocollo descrive i metodi per il rilevamento della sintesi proteica nascente e l'isolamento degli epatociti primari del topo di alta qualità e materiali.
Introduction
La proteina è un elemento nutritivo importante e circa il 50% del peso secco del corpo umano è composto di proteine che hanno diversi tratti biologici e funzioni1. Di conseguenza, la sintesi delle proteine è uno della maggior parte degli eventi che richiede energia e un'alterazione nel metabolismo delle proteine altamente è associata con lo sviluppo di malattie, tra cui malattie metaboliche2,3,4. Nel fegato, biosintesi della proteina rappresenta circa 20 – 30% del consumo totale di energia5,6. Inoltre, la funzione di proteine come non solo passivo o blocchi del fegato, ma attivi anche fattori che mediano segnale intracellulare o extracellularly a regolare il metabolismo sistemico7. Per esempio, la riduzione dei livelli di albumina di siero, che viene sintetizzata e secreta dal fegato e la proteina più abbondante nel plasma8, aumenta il rischio di tipo 2 diabete sviluppo9,10, 11, mentre una maggiore concentrazione di albumina è protettiva contro lo sviluppo di sindrome metabolica12. Inoltre, disturbi o interruzioni delle proteine epatiche secretive o membrana-limita, che modulano l'omeostasi del colesterolo, incluse le lipoproteine e LDLR LRP1, possono portare allo sviluppo di insulino-resistenza, iperlipidemia o aterosclerosi 13. Pertanto, l'identificazione dei meccanismi molecolari patofisiologici che sono coinvolti nella dispersione del metabolismo della proteina nel fegato e delle complicanze metaboliche associate potrebbe essere utile per scoprire romanzo farmacologico si avvicina per ritardare l'insorgenza o trattare malattie metaboliche come l'insulino-resistenza, diabete e steatosi epatica non alcolica.
Sintesi proteica è strettamente legata allo stato di energia cellulare (ad es., la formazione di un legame peptidico durante la fase di allungamento della sintesi proteica richiede di legami fosfodiesterei 414) ed è regolata da meccanismi molecolari che senso Inter - e intra - cellulari disponibilità nutriente15,16. Chinasi proteica AMP-attivata (AMPK) è uno dei sensori di energia intracellulare che mantengono l'omeostasi di energia17. Una volta AMPK attivata quando i livelli energetici cellulari diventano più bassi, AMPK e suoi substrati mirate funzionano per stimolare le vie cataboliche e inibire i processi anabolici compreso proteina sintesi18,19. La regolazione della sintesi proteica è mediata dalla fosforilazione di molteplici fattori di traduzione e proteine ribosomiali20. Di nota, l'obiettivo mammifero della rapamicina complesso 1 (mTORC1), delle principali cause della sintesi proteica, è uno degli obiettivi principali di AMPK21. Attivazione del pathway di mTORC1 migliora la crescita delle cellule e la proliferazione di stimolante proteina traduzione e autofagia20,21. Pertanto, è logico che l'attivazione di AMPK può inibire la sintesi di mTORC1-mediato della proteina22. Infatti, l'attivazione di AMPK contrasta e fosforila direttamente mTORC1 il residuo di treonina 2446 (Thr2446) che conduce alla sua inattivazione23 e la soppressione della proteina biosintesi24. Inoltre, AMPK indirettamente può inibire la funzione di mTORC1 di fosforilazione e l'attivazione della sclerosi tuberosa complessa 2 (TSC2)25 che è il regolatore a Monte della cascata di segnalazione di mTORC1. In breve, disregolazione di queste vie nel fegato è spesso legata allo sviluppo di malattie metaboliche e di conseguenza c'è una necessità critica di stabilire efficaci strumenti sperimentali per studiare il ruolo di queste vie nella regolazione dell'energia e metabolismo delle proteine negli epatociti.
C'è una forte somiglianza tra le proprietà funzionali di epatociti primari isolati e in vivo gli epatociti rispetto con in vitro fegato-derivato delle cellule linee26,27,28. È stato dimostrato che epatociti umani primari condividano 77% somiglianza con quello delle biopsie del fegato, mentre le cellule HepG2, che sono cellule cancerose epatiche ben differenziate e ampiamente utilizzati per indagare le funzioni epatiche, visualizzare inferiore al 48% nel contesto della 29di profili di espressione genica. Pertanto, l'utilizzo di epatociti primari, piuttosto che le cellule immortalizzate cultura, è di vitale importanza nella ricerca di fisiologia e funzione epatica, e diversi protocolli sono disponibili per l'isolamento e la coltura di epatociti primari soprattutto da ratti30,31. Mentre gli epatociti di ratto sono utili con un rendimento relativamente più elevato di cellule, epatociti del topo hanno un potenziale maggiore in molti aspetti scientifici grazie alla vasta disponibilità di topi geneticamente modulati. Tuttavia, ci sono diverse sfide tecniche in isolamento sani e abbondanti epatociti primari dai topi per cellulare e molecolare-valutazioni basate su: in primo luogo, inserimento della cannula per irrorare il fegato con i reagenti buffer è molto difficile da gestire a causa del mouse piccolo e sottile vena portale o la vena cava inferiore; in secondo luogo, un tempo più lungo di manipolazione delle cellule durante l'isolamento può causare riduzione nella cella quantità e qualità; metodi di separazione meccanica in terzo luogo, non-enzimatica possono causare seri danni e produrre un rendimento basso di epatociti primari isolato vitali32,33. Nel 1980, tecnica di aspersione della collagenosi è stato introdotto per isolare gli epatociti dal fegato di animali34. Questo metodo si basa sulla perfusione collagenosi del fegato35,36,37, infusione del fegato con calcio chelante soluzione38,39, digestione enzimatica e dissociazione meccanica del parenchima epatico35. Nel primo passaggio, un fegato di topo è irrorato con un buffer liberi di calcio [Ca2 +] contenente un chelatore [Ca2 +] (etilenediammina acido etilendiamminotetraacetico, EDTA). Nel secondo passaggio, il fegato di topo è irrorato con un buffer contenente collagenasi per idrolizzare le interazioni cellulari-matrice extracellulare. A differenza di buffer utilizzato nella prima fase, la presenza di ioni [Ca2 +] nel buffer del secondo passaggio è necessaria per l'attività della collagenosi efficace, dopo di che il fegato digerito deve essere ulteriormente delicatamente e meccanicamente separati utilizzando forcipe tra il capsula epatica e tessuti parenchimatosi. Infine, tessuto connettivo viene rimosso dal filtro e successiva centrifugazione separa epatociti vitali dalle cellule non parenchimali sia e non-viventi epatociti con l'uso di densità gradiente buffer40,41 ,42. Nello studio presente, vi mostriamo una tecnica di aspersione di collagenasi modificate in due fasi per isolare epatociti primari da un fegato di topo per l'analisi della sintesi proteica.
La radiomarcatura di proteine è ampiamente usato per quantificare i livelli di espressione, tassi di fatturato e determinare la distribuzione biologica delle proteine43 grazie all'elevata sensibilità di rilevazione di radioattività44. Tuttavia, l'uso di isotopi radioattivi richiede circostanze e delle procedure di ricerca altamente controllata45. Metodi alternativi non radioattivo sono stati sviluppati e sempre più hanno guadagnato in popolarità. La reazione di legatura chemo-selettive con un metodo di rilevazione della proteina tetrametilrodamina (TAMRA) è uno di loro e si basa sulla reazione tra un'azide e alchino gruppi46, che può essere utilizzata per analizzare gli eventi cellulari come chemo-selettive rilevamento di sintesi proteica nascente e sottoclassi delle glicoproteine per volta con un gruppo di azide. Per la sintesi proteica nascente, L-Azidohomoalanine (L-AHA, un amminoacido per volta azide) può essere incorporato nelle proteine metabolicamente e rilevato utilizzando il TAMRA proteina rilevamento metodo47. Usando questo test in epatociti primari del topo, indichiamo che il tasso di sintesi proteica nascente è strettamente legato alla disponibilità di ATP da mitocondriale e l'attivazione di AMPK (Figura 1).
In sintesi, l'utilizzo di epatociti primari del topo è fondamentale per indagare il metabolismo proteico ed energetico e quantificare la sintesi proteica nascente è prezioso per ottenere approfondimenti il ruolo fisiologico delle vie rilevanti per lo sviluppo e cura delle malattie relative dell'epatocita.
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Protocol
Questo protocollo contiene l'uso di topi di laboratorio. Cura degli animali e procedure sperimentali sono state eseguite secondo procedure approvate dai comitati di cura degli animali di Cincinnati Children Hospital Medical Center.
1. isolamento degli epatociti primari del topo
- Preparazioni pre-isolamento
- Preparare 450 mL di buffer gradienti di densità 40% come descritto in tabella 1 e conservare a 4 ° C (15 mL/topo).
- Preparare 500 mL di Medium di Williams' come descritto nella tabella 1 e conservare a 4 ° C.
- Preparare 500 mL di DMEM come descritto nella tabella 1 e tenere il ghiaccio (30 mL/topo).
- Preparare 500 mL di Buffer HBSS (-) come descritto in tabella 1 e continuare a 42 ° C nel bagno d'acqua (40 mL/topo).
- Preparare 500 mL di HBSS (+) Buffer con 0,3 mg/mL collagenasi tipo X, come descritto in tabella 1 con 30 min di incubazione a 42 ° C nel bagno d'acqua (40ml/mouse).
- Impostare la pompa di perfusione inserendo il tubo di somministrazione endovenosa (I.V.) attraverso il pedale di bloccaggio e controllando il flusso di risciacquo soluzione senza bolle d'aria.
- Scaldare il riscaldatore del tubo 42° C.
- Raffreddare la macchina centrifuga a 4 ° C.
- Anestesia e perfusione
- Pulire le aree di lavoro e la pompa.
- Sciacquare il tubo IV pompa collegata mediante l'esecuzione di etanolo al 70% accuratamente per 10 min.
- Rimuovere l'etanolo residuo dal tubo pompa-collegata IV risciacquando con DDW interamente per 10 min.
- Pulire le forbici e pinze con etanolo al 70%.
- Posizionare il mouse in un contenitore di plastica con una maglia inferiore e con la garza imbevuta di isoflurane 2 mL sotto la maglia per evitare il contatto diretto.
- Valutare la profondità dell'anestesia di pedale reflex (pizzico di punta costante).
- Rimuovere il mouse quando ha raggiunto la profondità desiderata dell'anestesia.
Nota: Il tempo di induzione dell'anestesia dovrebbe non essere più di 1 min. - Costruire un cono di naso utilizzando un tubo conico da 15 mL con compressa di garza imbevuta isoflurano 1ml spinto fino alla fine del tubo.
- Controllare la profondità dell'anestesia spostando il cono di naso più vicino o lontano dalle narici del mouse.
- Posizionare il mouse sulla piattaforma di lavoro con il lato ventrale rivolto verso l'alto.
- Spruzzo di etanolo al 70% sopra la zona addominale del mouse e quindi aprire la cavità addominale facendo una grande incisione trasversa del derma e peritoneo utilizzando forbici affilate e forcipe dentato.
- Quindi, fare un taglio verticale degli strati addominali fino a quando tutti gli organi addominali sono completamente esposti utilizzando forbici affilate e forcipe dentato.
- Mossa di piccoli e grandi intestini verso il lato sinistro del mouse con punta di cotone sterilizzato nell'autoclave fino al fegato, vena porta e vena cava inferiore (IVC) sono chiaramente esposti.
- Inserire un catetere 24g in IVC solo alla biforcazione con la vena renale di destra con attenzione senza che agitano le mani per evitare la ferita della IVC e sanguinamento.
Nota: Se il sanguinamento si verifica mentre si inserisce il catetere in IVC, quindi è consigliabile inserire il nuovo catetere in vena portale. - Rimuovere l'ago del catetere e controllare la posizione della cannula per evitare di ottenere fuori IVC, quindi collegare la cannula 24 G con tubo di aspersione utilizzando il connettore.
Nota: Evitare la presenza di bolle d'aria prima di iniziare la perfusione. - Iniziare la perfusione del fegato con HBSS caldo (-) con una portata di 4 mL/min e tagliare la vena splenica rapidamente per drenare il sangue interno utilizzando le forbici.
Nota: Se l'inserimento di una canula ha esito positivo, il fegato inizierà a sbiancare a causa della distribuzione di riflusso del buffer da IVC da vene epatiche. La vena è formata dall'Unione delle vene mesenteriche spleniche e superiore; Pertanto, è abbastanza sicuro tagliare la vena splenica poiché è grande e distale dal fegato. - Continuare l'aspersione con 35 mL di caldo HBSS (-).
Nota: Il fegato diventa pallido a colori se la perfusione è adeguata e il mouse ancora vivo nell'ambito dell'anestesia in questa fase.
- Digestione ed estrazione
- Irrorare il fegato di topo con caldo 35 mL di HBSS (+) tra cui collagenasi tipo X con una portata di 4 mL/min.
- Ogni pochi minuti, morsetto vena splenica usando il forcipe per ~ 10 s per consentire l'intero volume di HBSS (+) per diffondere in tutte le parti anatomiche del fegato.
Nota: Il fegato comincia a gonfiarsi dopo la vena splenica a causa di congestione del tampone di bloccaggio. - Versare 5 mL di preparato HBSS caldo (+) con collagenasi tipo X 100 mm alla fine del processo di aspersione di Petri.
- Tagliare il fegato irrorato dal resto del corpo prima di arrestare la pompa per evitare il reflusso di sangue nel fegato, rimuovere la cistifellea dal forcipe e quindi pulire il fegato delicatamente con un tovagliolo di carta per rimuovere il sangue.
- Trasferire il fegato di Petri che contiene 5 mL di preparato HBSS caldo (+) e rimuovere la capsula del fegato delicatamente con la punta dritto forcipe.
Nota: La capsula del fegato è un sottile strato di tessuto connettivo quello che circonda il fegato. - Disperdere il tessuto parenchima con attenzione usando il forcipe. Aggiungere 15 mL freddo DMEM al piatto Petri.
Nota: Il mezzo si trasformerà nuvoloso a causa di cellule parenchimatiche se il fegato è ben digerito. - Agitare il fegato strappato delicatamente per rilasciare le cellule parenchimatiche residuale nel mezzo e aggiungere un altro 15 mL freddo DMEM al piatto Petri per ottenere il resto delle cellule.
- Trasferimento DMEM con il fegato disciolto con 100 μm colino di cella in una provetta conica da 50 mL e tenere in ghiaccio.
- Purificazione
- Centrifugare la sospensione cellulare a 60 x g per 2 min a 4 ° C, con attenzione rimuovere il surnatante tramite aspirazione a vuoto e risospendere il pellet in 10 mL DMEM.
- Aggiungere sedimento risospeso come un sottile strato sulla parte superiore del 40% buffer gradienti di densità e centrifugare a 800 x g per 10 min senza freno a 4° C.
- Rimuovere con cautela il surnatante compreso lo strato superiore (DMEM) e lo strato intermedio (cellule morte o non-parenchimali), ma non lo strato inferiore (Pellet: epatociti primari parenchimatici).
- Risospendere le cellule primarie con medie E di 2 – 3 mL William e trasferire al nuovo tubo 50 mL per evitare la contaminazione di cellule morte sulla parete del tubo.
- Aggiungere media di 7-8 mL William E, mescolare delicatamente e centrifugare a 800 x g per 1 min a 4 ° C.
- Rimuovere con cautela il surnatante tramite aspirazione a vuoto e quindi risospendere il pellet nuovo con 10, 20 o 30 mL di mezzo di William E (secondo la dimensione del pellet).
- Contare le celle utilizzando un contatore di cellule automatizzato.
- Con il mezzo di William E di semi, tenere la piastra in un incubatore a 37° C per 2-3 h, quindi sostituire il medio with10% medio di FBS DMEM con anti-Anti per rimuovere le cellule morte o non collegate e per una notte di incubazione a 37 ° C.
- Giorno successivo, epatociti primari del topo sono pronti per l'uso sperimentale.
2. analisi di reazione a legatura chemo-selettive per la rilevazione della sintesi proteica nascente
- Etichettatura metabolica
- (Pre-trattamento) Lavare due volte epatociti primari con PBS calda di 37 ° C e aggiungere il mezzo DMEM privo di metionina per 30 min vuotare la metionina citoplasmatica si riserva.
Nota: L-Azidohomoalanine, è un aminoacido e analogico a metionina, contiene una frazione azido che può essere incorporato nelle proteine durante la biosintesi delle proteine cellulari affinché lo svuotamento di metionina citoplasmico permetterà di migliorare l'alimentazione e l'incorporazione di L-Azidohomoalanine nelle proteine recentemente sintetizzate di epatociti coltivati primari. - (Trattamento) Epatociti primari wash con 37 ° C caldo PBS due volte e aggiungere il supporto DMEM privo di metionina con 25 μM AHA (L-Azidohomoalanine) per 4-6 h.
- Aggiungere qualsiasi prodotto chimico specifico (cioè 10 rotenone μM) nel medium per 4 – 6 h in presenza di AHA al fine di studiare il suo effetto sui livelli di espressione della proteina nascente.
- Dopo l'incubazione, rimuovere il mezzo tramite aspirazione a vuoto e lavare epatociti primari con PBS freddo tre volte.
- Aggiungere tampone di lisi 200 μL alla piastra e incubare per 15-30 min sul ghiaccio, poi inclinare il piatto e prendere l'intera cellula lisato in provetta 1,7 mL.
Nota: Si dovrebbe osservare che lysate delle cellule è molto appiccicoso durante la raccolta delle cellule. - Sottoporre ad ultrasuoni il lysate delle cellule sul ghiaccio per 5 s tre volte utilizzando un sonicatore sonda per solubilizzare le proteine e il DNA di disperdere.
- Vortice della cella lysata per 5 min, centrifugare la cella lysata a 21.130 x g per 10 min a 4 oC e poi trasferire il sovranatante chiaro in un nuovo tubo. Misurare la concentrazione di proteine due volte.
Nota: In questa fase, proteina campioni possono essere conservati a-20 ° C per due settimane se non vengono utilizzati immediatamente.
- (Pre-trattamento) Lavare due volte epatociti primari con PBS calda di 37 ° C e aggiungere il mezzo DMEM privo di metionina per 30 min vuotare la metionina citoplasmatica si riserva.
- La proteina nascente Azide-modificato di etichettatura
- Preparare i componenti (A + B) con l'aggiunta di 60 μL del componente (A) per componente (B).
Nota: La soluzione diventa di colore rosa brillante dopo aver aggiunto il componente (A) a (B). - Preparare il buffer (D) e (E) secondo il protocollo.
- Prendere 20 – 40 μg lisato cellulare e aggiungere 50 µ l 2 x tampone di reazione (componente A + B), quindi regolare il volume a 80 μL aggiungendo DDW e vortexare per 5 s.
- Aggiungere 5 μL CuSO4 (componente C) e agitare con vortex per 5 s.
- Aggiungere 5 tampone di reazione μL 1 additivo (preparata al momento componente D), quindi agitare con vortex per 5 s e attendere 3 min.
- Aggiungere 10 μL ricostituito reazione tampone additivo 2 (componente E), quindi agitare con vortex per 5 s e ruotare i campioni per 20 min a 4 ° C utilizzando una macchina multi-rotatore.
Nota: La soluzione diventa di colore arancione brillante dopo l'aggiunta di componenti (E). I campioni dovrebbero essere protetti dalla luce durante la rotazione. - Aggiungere 300 μL metanolo e vortexare per 5 s, aggiungere 75 μL cloroformio ed agitare con vortex per 5 s, quindi aggiungere 200 μL DDW e vortexare per 5 s.
- Centrifugare i campioni a 21.130 x g e 4° C per 5 min, poi scartare il surnatante acquoso e tenere il pellet.
- Aggiungere 250 metanolo μL per il tubo, il vortice e spin ancora per 5 min a 21.130 x g.
- Eliminare il supernatante, quindi coprire i campioni con la salvietta e consentire i pellet asciugare all'aria per 15 min a temperatura ambiente.
- Preparare i componenti (A + B) con l'aggiunta di 60 μL del componente (A) per componente (B).
- Analisi della pagina e western blotting
- Solubilizzare il pellet in 20 μL di tampone senza β-mercaptoetanolo, vortexare per 10 min, calore a 70 ° C di caricamento tramite blocco di calore per 10 min. Quindi caricare i campioni nel gel di SDS 10% (1,5 mm) per il rilevamento di tetrametilrodamina (TAMRA).
- Rilevare il segnale di AHA utilizzando uno scanner laser modalità variabile per la precisa quantificazione delle proteine nascenti.
- Lavare il Gel con DDW per 15 min.
- Quindi, macchia il gel di SDS 10% con un reagente di coomassie-tintura veloce e sensibile per 15 – 60 min rilevare proteine totali come controllo.
- De-macchia il Gel con DDW per 1 – 2 h e acquisire l'immagine utilizzando un imager di fluorescenza UV.
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Representative Results
Isolamento di epatociti primari del topo si traduce in una resa di circa 20 x 106 totale cellule/mouse. Istologicamente, epatociti primari collegati e dal vivo appaiono poligonali o tipico esagonale in forma con chiaramente delineato membranosa contorno dopo 24 ore di incubazione (Figura 2).
Per verificare se cellule isolate sono epatociti primari, abbiamo confrontato i livelli di espressione della proteina albumina in epatociti isolati e primari del topo (PMHs), fibroblasti embrionali del mouse (MEFs), una linea cellulare del tumore epatico del topo (Hepa 1-6) e fegati del topo. L'espressione della proteina albumina è stato rilevato in epatociti primari del topo e fegati del topo ma non era rilevabile in MEFs o Hepa 1-6 celle (Figura 3).
Per determinare se gli effetti di rotenone sull'attivazione di chinasi (AMPK) epatica proteica AMP-attivata è cellula-autonoma, abbiamo confrontato la risposta dipendente dal tempo di epatociti primari isolato da un fegato di selvaggio-tipo mouse. Epatociti primari sono stati trattati senza o con 10 rotenone μM per 0, 4 o 6 h. In queste cellule, trattamento di rotenone indotto robustamente attivazione di AMPK, come rilevato da livelli aumentata fosforilazione di AMPK-T172 simili a quelli visti in vivo48 (Figura 4).
Per misurare direttamente gli effetti del trattamento di rotenone sulla sintesi proteica nascente in epatociti primari, l'incorporazione di AHA non radioattivo in proteina oltre 5 h è stata valutata eseguendo l'analisi di reazione a legatura chemo-selettive. Trattamento con rotenone μM 10 per 5 h ha avuto profondi effetti inibitori sulla sintesi proteica nascente in epatociti primari trattati rispetto ai non trattati epatociti primari (Figura 5).
Figura 1: Un'illustrazione mostra i passaggi del mouse primario isolamento epatociti, analisi western blot e procedure di reazione di legatura chemo-selettive.
Figura 2: immagini morfologiche di epatociti primari del topo di contrasto di fase. Immagini rappresentative di epatociti primari isolati sono stati acquisiti a 2, 12, 24 e 72 h dopo il placcaggio. Scala bar = 100 μm.
Figura 3: analisi di Western blot per l'espressione della proteina albumina in epatociti primari del topo. L'analisi Western blot è stata condotta con il caricamento di 10 μg proteina/corsia da epatociti primari del topo (PMHs), fibroblasti embrionali del mouse (MEFs), Hepa 1-6 celle e fegati del topo. One-way ANOVA ha mostrato che un'espressione di proteina albumina significativo in PMHs rispetto al MEF o Hepa 1-6 celle. I valori sono mezzi ± SEM della dimensione del gruppo (n = 3). P, n.P < 0,001 vs. HEPA 1-6 o MEFs, rispettivamente. $ P < 0,001 vs. lisato di fegato.
Figura 4: induzione di fosforilazione di AMPK in epatociti primari rotenone-trattati del topo. Epatociti primari da un fegato di topo selvatico sono stati trattati con rotenone di 10 μM per 0, 4 o 6 h. livelli di fosforilazione di AMPK sono stati rilevati mediante western blotting e β-actina è stato usato come un controllo di carico (10 μg proteina era caricato/lane). Misurazioni ripetute 2-way ANOVA ha mostrato che il trattamento ha causato un aumento significativo nell'espressione della proteina di fosfo-AMPK rispetto ai non trattati epatociti primari. I valori sono mezzi ± SEM della dimensione del gruppo (n = 3). P < 0,001 vs. Epatociti non trattati.
Figura 5: riduzione dell'espressione epatica della proteina nascente dopo trattamento di rotenone. Epatociti primari da un fegato di topo selvatico sono stati trattati con 10 rotenone μM per 5 h, seguita da un'analisi di sintesi della proteina nascente, con metodo AHA non radioattivo. I livelli di sintesi della proteina sono stati valutati da un scanner laser per rilevazione della fluorescenza di TAMRA. Livelli di proteina totale carico per questo test sono stati rilevati il reagente colorante coomassie.
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Discussion
Anche se parecchie linee cellulari immortalizzate epatiche sono state proposte e utilizzati per indagare le funzioni epatiche49,50,51,52, queste cellule mancano generalmente importante e fondamentale funzioni degli epatociti normali, quali l'espressione di albumina (Figura 3). È ampiamente riconosciuto, pertanto, che utilizzando epatociti primari è un'opzione importante per l'esame di fisiologia del fegato e metabolismo in cultura, nonostante le sfide di coltura e il mantenimento di queste cellule. Qui, il nostro studio dettagli l'isolamento successo di epatociti primari del topo effettuando un metodo di collagenasi in due fasi in modo relativamente comodo ed efficiente. Attraverso queste procedure, la maggior parte degli epatociti isolati primari all'interno della cultura mantengono la loro funzionalità metabolica e la stabilità morfologica e può essere utilizzata per indagare le funzioni epatiche, compreso proteina metabolismo, e la gluconeogenesi, e la respirazione mitocondriale.
Epatociti primari isolati sono un potente strumento sperimentale per esaminare i meccanismi molecolari del metabolismo energetico epatico. Rotenone interferisce con la catena di trasporto degli elettroni complessa sono attività in mitocondri e blocca la fosforilazione ossidativa con la limitata sintesi di ATP53, come testimonia l'attivazione di AMPK (Figura 4). L'attivazione di AMPK innesca risposte adattative cellulari che sopprimono il meccanismo di anabolizzante per compensare lo stress indotto da rotenone di energia-carenti. In questa circostanza, abbiamo rilevato con successo la drastica riduzione dei livelli di sintesi della proteina nascente in epatociti primari utilizzando una reazione di legatura non radioattivo, chemo-selettive con un metodo di rilevazione di TAMRA proteina (Figura 5). Questi risultati confermano l'importanza dell'approvvigionamento di energia dai mitocondri per la sintesi proteica appropriato in epatociti primari. Queste tecniche sono utili per fornire informazioni relative a un'azione della droga o la tossicità in concentrazioni terapeuticamente rilevanti nel contesto della sintesi epatica delle proteine di condizioni sane e malate. Inoltre, queste tecniche sono applicabili per esaminare il ruolo delle specifiche vie modulante della proteina e metabolismo energetico analizzando epatociti primari isolati da geneticamente manipolato topi.
In generale, la bassa resa e attuabilità delle cellule sono principali svantaggi dell'uso di epatociti primari. Questi problemi sono dovuti a diversi motivi come iniziale inserimento di una canula, insufficiente lavaggio con HBSS, inadeguata concentrazione di collagenasi, o periodo lungo-perfusione. Nostro protocollo attuale ottimizza questi passaggi multipli e conduce per acquisire una maggiore resa e cellule vitali circa 20 milioni/fegato/adulto di topi. Soprattutto, ci sono due passaggi critici: uno è quello di regolare la temperatura e la portata dei buffer digerito con concentrazione corretta collagenosi a digerire il parenchima epatico in modo efficiente in 15 – 20 minuti dall'inserimento della cannula fino l'asportazione del fegato, e un altro è per elaborare questi campioni di collagenasi trattati rapidamente come descritto al fine di mantenere le cellule in condizioni di buona salute. Mentre sono stati condotti studi basati su epatociti isolati entro 48h lasso di tempo in molti dati pubblicati, epatociti primari isolati con le nostre procedure di sopportare la cultura a più lungo termine (Figura 2). Con queste cellule, dimostriamo che l'etichettatura robusto della sintesi epatica delle proteine nascenti attraverso l'analisi di reazione a legatura chemo-selettive, anche se il tempo di concentrazione e l'incubazione con AHA nel protocollo potrebbe essere necessario ri-essere ottimizzato nei diversi biologici condizioni delle cellule (ad es. fisiologica vs patologico, selvaggio-tipo vs transgenici o knockout/giù le cellule).
In sintesi, abbiamo stabilito procedure per analizzare epatociti primari del topo per la sintesi proteica nascente in modo non radioattivo. Queste cellule rispondono bene a sforzo mitocondriale e soppressione della sintesi proteica con l'attivazione del pathway AMPK per mostre. Così, questi epatociti isolati sono preziosi modelli per studiare la fisiopatologia della proteina epatica e metabolismo energetico ex vivo.
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Disclosures
Gli autori indicano che non hanno conflitti di interesse.
Acknowledgments
Ringraziamo la d. ssa Joonbae Seo e Vivian Hwa per il loro contributo scientifico e la discussione. Questo lavoro è stato supportato dal National Institute of Health (NIH) (R01DK107530). T.N. è stato sostenuto da PRESTO dalla Japan Science and Technology Agency. Una parte di questo studio è stata sostenuta da una sovvenzione dal NIH (P30DK078392) per il digestivo malattia Research Core Center di Cincinnati.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPES buffer | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| D-glucose | Fisher Scientific | D16-500 | |
| Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-tetraacetic acid | AmericanBio | AB00505-00025 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | Gibco | 15240-062 | |
| HBSS (10x) no calcium, magnesium, phenol red | Gibco | 14185-052 | |
| Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2.2H2O) | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Density gradient buffer | GE Healthcare | 17-0891-02 | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) low glucose, pyruvate | Gibco | 11885-084 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30910.03 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) (1x) | Gibco | 1897141 | |
| Williams medium E, no glutamine | Gibco | 12551-032 | |
| L-alanyl-L-glutamine dipeptide supplement | Gibco | 35050-061 | |
| Collagenase Type X | Wako Pure Chemical Industries | 039-17864 | |
| Perfusion pump | Cole-Parmer | Masterflex L/S | Equipment |
| IV administration set | EXELINT | 29081 | Equipment |
| A water bath | REVSCI | RS-PB-200 | Equipment |
| Tube heater | Fisher Scientific | Isotemp | Equipment |
| Ethanol | Decon Lab, Inc | 0-39613 | |
| Isoflurane | PHOENIX | 10250 | |
| Autoclaved Cotton Tips | Fisherbrand | 23-400-124 | |
| 100 mm Petri Dish | TPP | 93100 | |
| Connector (Male Luer Lock Ring) | Cole-Parmer instrument | EW-4551807 | |
| 24 G catheters | TERUMO | Surflo 24Gx3/4' | |
| 100 μm Filter (CELL STRAINERS) | VWR | 10199-658 | |
| 15 mL conical-bottom centrifuge tubes | VWR | 89039-666 | |
| 50 mL conical-bottom centrifuge tubes | VWR | 89039-658 | |
| Chemoselective ligation reaction PROTEIN ANALYSIS DETECTION KIT, TAMRA ALKYNE | Invitrogen | C33370 | |
| AHA (L-azidohomoalanine) | Invitrogen | C10102 | |
| DMEM (methionine free) | Gibco | 21013024 | |
| L-Cystine Dihydrochloride | SIGMA | C2526 | |
| Laemmli sample buffer | BioRad | 161-0737 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | SIGMA | P9599 | |
| SDS solution (20%) | BioRad | 161-0418 | |
| Tris-HCL (1M) | American Bioanalytical | AB14044-01000 | |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail | SIGMA | P5726 | |
| Protein concentration measuring Kit (Bovin Serum Albumin-BSA) | BioRad | 500-0207 | |
| 6-well tissue culture plate | TPP | 92006 | |
| Digital Heatblock | VWR | 12621-092 | Equipment |
| Multi-Rotator | Grant-bio | PTR-60 | Equipment |
| Ultrasonic Sonicator | Cole-Parmer | GE130PB | Equipment |
| Standard Heavy-Duty Vortex Mixer | VWR | 97043-566 | Equipment |
| A variable mode laser scanner | GE Healthcare Life Science | FLA 9500 | Equipment |
| Coomassie-dye reagent | Thermo Scientific | 24594 | |
| Inverted microscope | Olympus | CKX53 | Equipment |
| Western Blotting apparatus | BioRad | 1658004 | Equipment |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | Equipment |
| Automated cell counter | BioRad | TC20 | Equipment |
| FluorChem R system | proteinsimple | - | Equipment |
| p-Ampka (T172) antibody | Cell signaling | 2535 | |
| Total-AMPK antibody | Cell signaling | 5832 | |
| Albumin antibody | Cell signaling | 4929 | |
| beta actin antibody | Santa Cruz | sc-130656 | |
| Fine scissors and forceps |
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