Summary
Hier presenteren we een protocol voor de isolatie van gezonde en functionele primaire muisknop hepatocyten. Instructies voor het opsporen van hepatische ontluikende eiwitsynthese door niet-radioactieve labeling substraat werden verstrekt om te helpen begrijpen van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de eiwitsynthese in het kader van de homeostase van de energie-metabolisme in de lever.
Abstract
Hepatocyten parenchymal cellen van de lever en in dienst nemen van meerdere metabole functies, met inbegrip van synthese en secretie van eiwitten essentieel voor systemische energie homeostase. Primaire hepatocyten geïsoleerd uit de lymfkliertest lever vormen een waardevolle biologische hulpmiddel om te begrijpen van de functionele eigenschappen of de veranderingen die zich voordoen in de lever. Hierin we beschrijven een methode voor het isoleren en de cultuur van de primaire muisknop hepatocyten door het uitvoeren van een tweestaps collagenase perfusie techniek en hun gebruik voor het onderzoeken van eiwit metabolisme te bespreken. De lever van een volwassen muis is sequentieel geperfundeerd met ethyleenglycol-bis Dinatriumethyleendiaminetetra-azijnzuuroplossing (EGTA) en collagenase, gevolgd door de isolatie van hepatocyten met de dichtheid kleurovergang buffer. Deze geïsoleerde hepatocyten levensvatbaar op cultuur platen zijn en de meerderheid van de begiftigde kenmerken van hepatocyten te handhaven. Deze hepatocyten kunnen worden gebruikt voor de beoordeling van eiwit metabolisme met inbegrip van ontluikende eiwitsynthese met niet-radioactieve reagentia. We laten zien dat de geïsoleerde hepatocyten gemakkelijk worden gecontroleerd en bestaan uit een hogere stabiliteit van de kwaliteit en het volume van eiwitsynthese gekoppeld aan energiemetabolisme door gebruik te maken van de chemo-selectieve afbinding reactie met een Tetramethylrhodamine (TAMRA) eiwit detectiemethode en westelijke bevlekkende analyses. Deze methode is daarom waardevol voor het onderzoeken van hepatische ontluikende eiwitsynthese gekoppeld aan energie homeostase. Het volgende protocol worden de materialen en methoden voor de isolatie van kwalitatief hoogwaardige primaire muisknop hepatocyten en opsporing van ontluikende eiwitsynthese.
Introduction
Eiwit is een belangrijk element van de voeding en ongeveer 50% van het drooggewicht van het menselijk lichaam is samengesteld uit eiwitten die verschillende biologische kenmerken en functies1 hebben. Bijgevolg eiwitsynthese is een van de meeste energie verbruikende gebeurtenissen en een verandering in de stofwisseling van eiwit is sterk gekoppeld aan de ontwikkeling van ziekten, met inbegrip van metabole ziekten2,3,4. In de lever, eiwit biosynthese goed voor ongeveer 20 tot 30% van de totale energie verbruik5,6. Ter vermeerdering, eiwitten functie niet alleen passief bouwen van blokken van de lever, maar ook actief signaal-bemiddelen factoren intracellulair of extracellularly te reguleren de systemische metabolisme7. Bijvoorbeeld, de lagere niveaus van serum albumine, die gesynthetiseerd en uitgescheiden door de lever en de overvloedigste eiwitten in het plasma8, verhoogt het risico van type 2 diabetes ontwikkeling9,10, 11, terwijl een hogere concentratie van serum albumine beschermend is tegen metabool syndroom12te ontwikkelen. Bovendien kan gestoord of verstoring van secretoire of membraan-gebonden hepatische eiwitten, die homeostase van cholesterol moduleren, waaronder lipoproteïnen, LDLR en LRP1, leiden tot de ontwikkeling of insulineresistentie, hyperlipidemie, atherosclerose 13. Daarom, de identificatie van moleculaire pathofysiologische mechanismen die bij eiwit verstoring van het metabolisme in de lever en de bijbehorende metabole complicaties betrokken zijn kan zinvol zijn voor het ontdekken van de roman farmacologische benaderingen om begin retard of het metabole ziektes zoals diabetes, insulineresistentie en non-alcoholische vette lever.
Eiwitsynthese is nauw gekoppeld aan de status van de cellulaire energie (b.v., de vorming van één binding van peptide tijdens de stap van de rek van de eiwitsynthese vereist 4 phosphodiester obligaties14) en wordt gereguleerd door moleculaire trajecten die zin Inter - en intra - cellular nutriënten beschikbaarheid15,16. AMP-geactiveerd proteïne kinase (AMPK) is één van de intracellulaire energie-sensoren die energie homeostase17handhaven. Zodra AMPK wordt geactiveerd wanneer de cellulaire energie niveaus lager worden, functioneren AMPK en haar gerichte substraten om te stimuleren katabole pathways en remmen anabole processen, met inbegrip van eiwit synthese18,19. De regulering van de eiwitsynthese wordt gemedieerd door fosforylering van meerdere factoren van de vertaling en ribosomal eiwitten20. Van de nota, de zoogdieren doel van rapamycin complexe 1 (mTORC1), een belangrijke bestuurder van de eiwitsynthese, is een van de hoofddoelen van AMPK21. Activering van de mTORC1-pathway verbetert de celgroei en proliferatie door stimulerende eiwit vertaling en autophagy20,21. Het is daarom logisch dat activering van AMPK mTORC1-gemedieerde eiwit synthese22kan remmen. Inderdaad, activering van AMPK tegengaat en direct kinaseenzym mTORC1 op threonine residu 2446 (Thr2446) leidt tot de inactivatie23 en onderdrukking van de proteïne biosynthese24. Bovendien kunnen AMPK niet indirect mTORC1 functie door fosforylatie en activering van Tubereuze sclerose complex 2 (TSC2)25 die de upstream regulator van mTORC1 signalering trapsgewijs remmen. Kortom, disregulatie van deze trajecten in de lever is vaak gekoppeld aan de ontwikkeling van metabole ziekten en daarom is er dringend behoefte om effectieve experimentele instrumenten voor het onderzoek naar de rol van deze trajecten in de regulering van energie en eiwit metabolisme in hepatocyten.
Er is een sterkere gelijkenis tussen de functionele eigenschappen van geïsoleerde primaire hepatocyten en in vivo hepatocyten dan met in vitro lever afkomstige cel lijnen26,27,28. Het is aangetoond dat primaire menselijke hepatocyten 77% gelijkenis met die van lever biopsieën delen, overwegende dat HepG2 cellen, die goed gedifferentieerde hepatische kankercellen en op grote schaal gebruikt om te onderzoeken van hepatische functies, vertonen die minder dan 48% in het kader van genexpressie profielen29. Daarom gebruik van primaire hepatocyten, in plaats van vereeuwigd cultuur cellen, is van vitaal belang bij het onderzoeken van hepatische functie en fysiologie, en diverse protocollen beschikbaar zijn voor de isolatie en de cultuur van primaire hepatocyten vooral van ratten30,31. Terwijl de rat hepatocyten handig met een relatief hogere opbrengst van cellen zijn, hebben muis hepatocyten een groter potentieel in vele wetenschappelijke aspecten vanwege de brede beschikbaarheid van genetisch gemoduleerde muizen. Er zijn echter verschillende technische uitdagingen in het isoleren van gezonde en overvloedige primaire hepatocyten van muizen voor cellulaire en moleculaire gebaseerde evaluaties: ten eerste, inbrengen van de canule aan het perfuse van de lever met buffer reagentia is zeer moeilijk te behandelen vanwege de kleine en dunne muis portal ader of vena cava inferior; Ten tweede, een langere tijd van de manipulatie van cellen tijdens de isolatie vermindering kan veroorzaken in cel hoeveelheid en kwaliteit; derde, niet-enzymatische mechanische scheidingsmethoden kunnen leiden tot ernstige schade en een lage opbrengst van levensvatbare geïsoleerde primaire hepatocyten32,33. In de jaren 1980, collagenase perfusie techniek geïntroduceerd voor het isoleren van hepatocyten uit de lever van de dieren34. Deze methode is gebaseerd op collagenase perfusie van de lever35,36,,37, infusie van de lever met calcium complexvormer oplossing38,39, enzymatische spijsvertering en mechanische dissociatie van de hepatische parenchym35. In de eerste stap is de lever van een muis met een calcium [Ca2 +] gratis buffer met een [Ca2 +] complexvormer (ethyleendiamine Dinatriumethyleendiaminetetra-azijnzuuroplossing, NA2EDTA) geperfundeerd. In de tweede stap, is de muis lever geperfundeerd met een buffer van collagenase-bevattende te hydrolyseren van de mobiele-extracellulaire matrix interacties. In tegenstelling tot de buffer die wordt gebruikt in stap 1, de aanwezigheid van [Ca2 +]-ionen in de buffer van de tweede stap is vereist voor effectieve collagenase activiteit, waarna de verteerd lever heeft verder zachtjes en mechanisch gescheiden met behulp van de verlostang tussen de hepatische capsule en parenchymateuze weefsel. Ten slotte, bindweefsel wordt verwijderd door te filteren, en latere centrifugeren scheidt levensvatbare hepatocyten uit zowel niet-parenchymal cellen en niet-levende hepatocyte met het gebruik van dichtheid kleurovergang buffer40,41 ,42. In de huidige studie tonen we een gemodificeerde tweestaps collagenase perfusie techniek te isoleren van de primaire hepatocyten uit de lever van een muis voor de analyse van de eiwitsynthese.
De radiolabeling van eiwitten wordt veel gebruikt om te kwantificeren van de expressie-niveaus, omzet tarieven, en bepalen de biologische distributie van eiwitten,43 , vanwege de hoge gevoeligheid van detectie van radioactiviteit44. Echter, vereist het gebruik van radioactieve isotopen onderzoek sterk gecontroleerde omstandigheden en procedures45. Alternatieve niet-radioactieve methoden zijn ontwikkeld en steeds meer aan populariteit hebben gewonnen. De reactie van de chemo-selectieve afbinding met een Tetramethylrhodamine (TAMRA) methode voor de detectie van de eiwitten is een van hen en is gebaseerd op de chemo-selectieve reactie tussen een azide en alkyn groepen46, die kan worden gebruikt voor het analyseren van cellulaire gebeurtenissen zoals opsporen ontluikende eiwitsynthese en subklassen van glycoproteïnen bewerkt met een azide groep. Voor ontluikende eiwitsynthese, zijn L-Azidohomoalanine (L-AHA, een aminozuur azide gemodificeerde) metabolisch opgenomen in eiwitten en opgespoord door middel van de TAMRA eiwit detectie methode47. Met behulp van deze test in primaire muisknop hepatocyten, laten we zien dat het ontluikende eiwit synthese tarief is strak gekoppeld aan de beschikbaarheid van ATP van mitochondriale en AMPK activering (Figuur 1).
Kortom, gebruik van primaire muisknop hepatocyten is cruciaal voor het onderzoeken van het metabolisme van eiwitten en energie en kwantificeren van de ontluikende eiwitsynthese is waardevol voor het verkrijgen van inzicht in de fysiologische rol van trajecten die relevant zijn voor de ontwikkeling en genezen van hepatocyte-gerelateerde ziekten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dit protocol bevat het gebruik van laboratorium muizen. Verzorging van de dieren en experimentele procedures werden uitgevoerd volgens de procedures die zijn goedgekeurd door de commissies van de verzorging van de dieren van de centrum van de geneeskunde van het ziekenhuis van de kinderen van Cincinnati.
1. isolatie van primaire muisknop hepatocyten
- Pre isolatie preparaten
- 450 mL 40% dichtheid kleurovergang buffer bereiden zoals beschreven in tabel 1 en blijven bij 4 ° C (15 mL/muis).
- 500 mL van Williams' Medium bereiden zoals beschreven in tabel 1 en houden bij 4 ° C.
- 500 mL DMEM bereiden zoals beschreven in tabel 1 en houd op ijs (30 mL/muis).
- 500 mL Buffer HBSS (-) voor te bereiden zoals beschreven in tabel 1 en blijven bij 42 ° C in het waterbad (40 mL/muis).
- Bereiden van 500 mL HBSS (+) Buffer met 0,3 mg/mL Collagenase Type X, zoals beschreven in tabel 1 met 30 min incubatie bij 42 ° C in het waterbad (40 mL/mouse).
- De pomp perfusie opgericht door het plaatsen van de intraveneuze (I.V) administratie buis over de latching voetpedaal en door het controleren van de stroom van het spoelen oplossing zonder luchtbellen.
- Opwarmen op de kachel van de buis op 42° C.
- Afkoelen van de centrifuge machine tot 4 ° C.
- Narcose en perfusie
- Reinig de werkgebieden en de pomp.
- Spoel de IV pomp-verbonden buis door het uitvoeren van 70% ethanol grondig gedurende 10 minuten.
- Verwijder de resterende ethanol uit de IV pomp-verbonden buis door spoelen met DDW geheel gedurende 10 minuten.
- Veeg de schaar en pincet met 70% ethanol.
- Hiermee plaatst u de muisaanwijzer in een plastic container met een gaas bodem en met de 2 mL Isofluraan doordrenkte gaas onder de Maas om te voorkomen dat het directe contact.
- Ezels de diepte van de verdoving door pedaal reflex (stevige teen snuifje).
- Verwijder de muis wanneer het de gewenste diepte van verdoving heeft bereikt.
Opmerking: De tijd van de inductie van de anesthesie mag niet meer dan 1 min. - Construeer een neus kegel met behulp van een conische tube van 15 mL met 1 mL Isofluraan doordrenkte zeem geduwd aan het uiteinde van de buis.
- Bepalen van de diepte van de verdoving door het bewegen van de neus dichter of weg van de neusgaten van de muis.
- Plaats de muis op het werkplatform met de ventrale zijde naar boven.
- 70% ethanol spray over de buikstreek van de muis en open vervolgens de buikholte door het maken van een grote dwarse insnijding van de dermis en buikvlies met behulp van scherpe schaar en getande pincet.
- Controleer vervolgens een verticale snede van de abdominale lagen totdat alle buikorganen zijn volledig blootgesteld met behulp van scherpe schaar en getande pincet.
- Zet kleine en grote darmen naar de linkerkant van de muis met gesteriliseerde met autoclaaf katoen tip tot lever, portal vein en vena cava inferior (IVC) duidelijk worden blootgesteld.
- Invoegen een katheter 24 G IVC alleen op de bifurcatie met recht renale ader zorgvuldig zonder schudden handen om te voorkomen dat de schade van IVC en bloeden.
Opmerking: Als bloeden optreedt terwijl u de katheter in IVC invoegt, vervolgens u moet probeert te voegen de nieuwe katheter in een ader van de portal. - Verwijder de naald van de katheter en de positie van de canule om te voorkomen dat je uit IVC bepalen en sluit vervolgens 24 G canule met perfusie buis met behulp van de verbindingslijn.
Opmerking: De aanwezigheid van luchtbellen te voorkomen voordat de perfusie. - Start de perfusie van de lever met warme HBSS (-) op een debiet van 4 mL/min en afgesneden van de milt ader snel naar afvoer uit het interne bloed met behulp van schaar.
Opmerking: Als de cannulation voltooid is, zal de lever beginnen te blanch als gevolg van de verdeling van de Terugvloeiing van de buffer van IVC hepatische aderen. De portal ader wordt gevormd door de Unie van milt en superieure mesenterische aderen; Daarom is het vrij veilig te snijden van de milt ader, omdat het grote en distale uit de lever. - Blijven perfusie met 35 mL van warme HBSS (-).
Opmerking: De lever bleek in kleur als de perfusie volstaat, en de muis nog steeds leven onder verdoving zal worden in dit stadium.
- Spijsvertering en extractie
- Perfuse de lever van de muis met warme 35 mL HBSS (+) met inbegrip van Collagenase Type X op een debiet van 4 mL/min.
- Om de paar minuten, de milt ader klem met pincet voor ~ 10 s om het gehele volume van HBSS (+) om te verspreiden in alle anatomische delen van de lever.
Opmerking: Lever begint te zwellen na het klemmen van de milt ader als gevolg van de congestie van de buffer. - Schenk 5 mL bereide warme HBSS (+) met Collagenase Type X in 100 mm petrischaal aan het einde van het proces van de perfusie.
- Afgesneden de perfused lever van de rest van het lichaam voordat u stopt de pomp om te voorkomen dat de terugvoer van bloed in de lever, verwijderen van de galblaas door pincet en vervolgens veeg de lever voorzichtig met een papieren handdoek te verwijderen van het bloed.
- Overbrengen van de lever naar de petrischaal waarin 5 mL bereide warme HBSS (+) en de lever capsule voorzichtig met behulp van rechte-tipped pincet te verwijderen.
Opmerking: De lever capsule is een dun laagje bindweefsel dat rond de lever. - Verspreiden de parenchymal weefsel zorgvuldig met behulp van de verlostang. Voeg toe 15 mL koude DMEM om de petrischaal.
Opmerking: Het medium zal draaien bewolkt als gevolg van parenchymal cellen als de lever wordt goed verteerd. - Schud de gescheurde lever zachtjes om de introductie van de resterende parenchymal cellen in het medium en voeg een ander 15 mL koude DMEM om de petrischaal om de rest van de cellen.
- Pipetteer DMEM met de opgeloste lever door 100 μm cel zeef in een conische tube van 50 mL en houden in ijs.
- Zuivering
- Centrifugeer de celsuspensie bij 60 x g gedurende 2 min bij 4 ° C, verwijder de bovendrijvende vloeistof door vacuüm aspiratie voorzichtig en resuspendeer de pellet in 10 mL DMEM.
- Geresuspendeerde pellet toevoegen als een dunne laag op de bovenkant van 40% dichtheid kleurovergang buffer en centrifugeer bij 800 x g gedurende 10 minuten zonder rem op 4° C.
- Verwijder voorzichtig de bovendrijvende vloeistof met inbegrip van de bovenste laag (DMEM) en de middelste laag (dode of niet-parenchymal cellen), maar niet de onderste laag (Pellet: primaire parenchymal hepatocyten).
- Resuspendeer de primaire cellen met 2-3 mL William's middellange E en overbrengen naar de nieuwe tube van 50 mL om verontreiniging van dode cellen in de wand van de buis te voorkomen.
- 7-8 mL William's medium E toevoegen, mengen zachtjes en centrifugeer bij 800 x g voor 1 min bij 4 ° C.
- Verwijder voorzichtig de bovendrijvende vloeistof door vacuüm aspiratie en vervolgens resuspendeer de pellet opnieuw met 10, 20 of 30 mL van William's medium E (op basis van de grootte van de pellet).
- Cellen tellen door middel van een geautomatiseerde cel itemlogboeken.
- Seed met William's medium E, houden van de plaat in een incubator op 37° C gedurende 2-3 uur, vervolgens de middellange with10% FBS DMEM medium met Anti-Anti aan de dode of losse cellen verwijderen en vervangen voor overnachting incubatie bij 37 ° C.
- Volgende dag, zijn primaire muisknop hepatocyten klaar voor experimenteel gebruik.
2. chemo-selectieve afbinding reactie Assay voor het opsporen van ontluikende eiwitsynthese
- Metabole labeling
- (Voorbehandeling) Primaire hepatocyten met 37 ° C warme PBS tweemaal wassen en voeg het methionine-vrije DMEM medium voor 30 min om afbrekende de cytoplasmatische methionine behoudt zich.
Opmerking: L-Azidohomoalanine, is een aminozuur en analoog naar methionine, bevat een deel van de azido die kan worden opgenomen in de eiwitten tijdens de biosynthese van cellulaire eiwitten zodat uitputting van cytoplasmatische methionine de voeding verbeteren zal en de integratie van L-Azidohomoalanine in nieuw samengestelde proteïnen van gekweekte primaire hepatocyten. - (Behandeling) De primaire hepatocyten Wash met 37 ° C warm PBS tweemaal en voeg het methionine-vrije DMEM medium met 25 μM AHA (L-Azidohomoalanine) voor 4 – 6 h.
- Voeg een specifieke chemische stof (d.w.z. 10 μM rotenon) in het medium voor 4 – 6 h in aanwezigheid van AHA om te onderzoeken van het effect daarvan op de ontluikende eiwitniveaus expressie.
- Na incubatie, verwijderen van het medium door vacuüm aspiratie en wassen van primaire hepatocyten met koude PBS driemaal.
- 200 μl lysis-buffermengsel toevoegen aan de plaat en incubeer gedurende 15-30 min op het ijs, dan kantelen van de plaat en nemen de hele cel lysate in 1,7 mL-buis.
Opmerking: U moet observeren dat die cel lysate is erg plakkerig tijdens het oogsten van de cel. - Bewerk de cel lysate op ijs voor 5 ultrasone trillingen ten s drie keer met behulp van een sonde ultrasoonapparaat solubilize van de eiwitten en het verspreiden van het DNA.
- Vortex de cel lysate voor 5 min, centrifugeer de cel lysate bij 21,130 x g gedurende 10 minuten bij 4 oC en breng de duidelijke bovendrijvende substantie in een nieuwe buis. Meet de eiwitconcentratie tweemaal.
Opmerking: In dit stadium EiwitSteekproeven kunnen worden achtergelaten bij-20 ° C gedurende twee weken als ze niet onmiddellijk worden gebruikt.
- (Voorbehandeling) Primaire hepatocyten met 37 ° C warme PBS tweemaal wassen en voeg het methionine-vrije DMEM medium voor 30 min om afbrekende de cytoplasmatische methionine behoudt zich.
- Labelen van de Azide gemodificeerde ontluikende eiwit
- De onderdelen (A + B) voor te bereiden door 60 μL van onderdeel a naar component b toe te voegen.
Opmerking: De kleur omslaat naar helder roze in kleur (A) aan (B) toevoeg component. - Voorbereiden van de buffers (D) en (E) volgens het protocol.
- Neem 20-40 μg cel lysate en voeg 50 l 2 x reactie buffer (component A + B), dan pas het volume aan 80 μL door toevoeging van DDW en vortex voor 5 s.
- Voeg 5 l CuSO4 (onderdeel C), en vortex voor 5 s.
- Voeg 5 μl reactie buffer toevoegingsmiddel 1 (vers bereide onderdeel D), dan vortex voor 5 s en wachten op 3 min.
- Voeg toe 10 μL gereconstitueerd reactie buffer additieve 2 (onderdeel E), vervolgens vortex voor 5 s en roteren monsters gedurende 20 minuten bij 4 ° C met behulp van een machine meerdere rotator.
Opmerking: De kleur omslaat naar fel oranje in kleur na het toevoegen van de component (E). De monsters moeten worden beschermd tegen licht tijdens de rotatie. - Toevoegen van 300 μL methanol en vortex voor 5 s, toevoegen van 75 μL chloroform en vortex voor 5 s, voegt u 200 μl DDW en vortex voor 5 s.
- Centrifugeer de monsters op 21,130 x g en 4° C gedurende 5 min, vervolgens de waterige vloeistof wordt weggeworpen en houden de pellet.
- 250 μL methanol toevoegen aan de buis, vortex, en spin opnieuw voor 5 min op 21,130 x g.
- Verwijder het supernatant, dan dekken de monsters met de stofvrije tissue en toestaan dat de pellets te drogen gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
- De onderdelen (A + B) voor te bereiden door 60 μL van onderdeel a naar component b toe te voegen.
- PAGINA-analyse en het westelijke bevlekken
- Solubilize de pellet in 20 μL van het laden van de buffer zonder β-mercaptoethanol, vortex voor 10 min, warmte bij 70 ° C met behulp van de warmte blok gedurende 10 minuten. Dan laden de monsters in 10% SDS gel (1,5 mm) voor de detectie van de Tetramethylrhodamine (TAMRA).
- AHA-signaal een variabele modus laserscanner gebruikt voor nauwkeurige kwantificatie van ontluikende eiwitten te detecteren.
- Het wassen van de Gel met DDW gedurende 15 minuten.
- Vervolgens vlek de gel SDS 10% met een snelle en gevoelige coomassie-kleurstof reagens voor 15-60 min voor speurder totale eiwitten zoals een besturingselement.
- -De Gel met DDW vlek voor 1-2 h en verwerven van de afbeelding met behulp van een UV fluorescentie imager.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Primaire muisknop hepatocyten isolatie resulteert in een opbrengst van ongeveer 20 x 106 totaal cellen/muis. Histologisch, live en bijgevoegde primaire hepatocyten verschijnen veelhoekige of typische zeshoekige vorm met duidelijk omschreven membraanachtig grens na een incubatieperiode van 24 h (Figuur 2).
We vergeleken om te bevestigen of geïsoleerde cellen primaire hepatocyten zijn, expressie niveaus van albumine eiwit in geïsoleerde primaire muisknop hepatocyten (PMHs), muis embryonale fibroblasten (MEFs), een muis hepatoma cellijn (HEPA-1-6) en muis levers. De albumine eiwit expressie werd ontdekt in de primaire muisknop hepatocyten en muis levers, maar was niet in MEFs of Hepa aantoonbaar 1-6 cellen (Figuur 3).
Om te bepalen of de effecten van rotenon op hepatische AMP-geactiveerd proteïne kinase (AMPK) activering is cel-autonoom, vergeleken we de tijd-afhankelijke reactie van primaire hepatocyten geïsoleerd van een lever van wild-type muis. Primaire hepatocyten werden behandeld zonder of met 10 μM rotenon voor 0, 4 of 6 h. In deze cellen, rotenon behandeling krachtig geïnduceerde AMPK activering, zoals gedetecteerd door verhoogde fosforylatie niveaus op AMPK-T172 vergelijkbaar zijn met die gezien in vivo48 (Figuur 4).
Voor het direct meten van de effecten van rotenon behandeling op ontluikende eiwitsynthese in primaire hepatocyten, werd de opneming van niet-radioactieve AHA in eiwit meer dan 5 h beoordeeld door de chemo-selectieve afbinding reactie bepaling uit te voeren. Behandeling met 10 μM rotenon voor 5 h diepgaande remmende effect gehad op ontluikende eiwitsynthese in behandelde primaire hepatocyten in vergelijking met onbehandelde primaire hepatocyten (Figuur 5).
Figuur 1: Een illustratie toont de stappen van de primaire muisknop hepatocyten isolatie, westelijke vlekkenanalyse en chemo-selectieve afbinding reactie procedures.
Figuur 2: fase contrast morfologische beelden van primaire muisknop hepatocyten. Representatieve foto's van geïsoleerde primaire hepatocyten overgenomen op 2, 12, 24 en 72 uur na de beplating. Schaal bars = 100 μm.
Figuur 3: westelijke vlekkenanalyse voor albumine eiwit expressie in primaire muisknop hepatocyten. Westelijke vlekkenanalyse plaatsgevonden met het laden van 10 μg eiwit/lane van primaire muisknop hepatocyten (PMHs), muis embryonale fibroblasten (MEFs), HEPA-1-6 cellen en muis levers. One-way ANOVA toonde dat een significante albumine eiwit expressie in PMHs in vergelijking met MEF of Hepa 1-6 cellen. Waarden zijn middelen ± SEM van grootte van de groep (n = 3). P, #P < 0,001 vs. HEPA-1-6 of MEFs, respectievelijk. $ P < 0,001 vs. lever lysate.
Figuur 4: inductie van fosforylering van AMPK in primaire muisknop rotenon behandeld hepatocyten. Primaire hepatocyten uit de lever van een wild-type muis werden behandeld met 10 μM rotenon voor 0, 4 of 6 h. fosforylatie niveaus van AMPK werden ontdekt door het westelijke bevlekken en β-actine werd gebruikt als een besturingselement laden (10 μg eiwit was geladen/lane). Herhaalde metingen 2-way ANOVA toonde aan dat behandeling een aanzienlijke toename eiwit expressie van phospho-AMPK in vergelijking met onbehandelde primaire hepatocyten veroorzaakten. Waarden zijn middelen ± SEM van grootte van de groep (n = 3). P < 0,001 vs. Onbehandelde hepatocyten.
Figuur 5: vermindering van hepatische ontluikende eiwit expressie na behandeling van rotenon. Primaire hepatocyten uit de lever van een wild-type muis werden behandeld met 10 μM rotenon voor 5 h, gevolgd door een ontluikende eiwit synthese assay met niet-radioactieve AHA-methode. Synthese eiwitniveaus werden beoordeeld door een laserscanner detecteren de TAMRA fluorescentie. Totale laden eiwitniveaus voor deze bepaling werden ontdekt door de coomassie-kleurstof reagens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hoewel verschillende vereeuwigd hepatische cellijnen zijn voorgesteld en gebruikt voor het onderzoeken van de lever functies49,50,51,52, deze cellen in het algemeen ontbreekt aan de belangrijke en fundamentele functies van de normale hepatocyten, zoals de uitdrukking van albumine (Figuur 3). Het wordt algemeen erkend, daarom, dat met behulp van primaire hepatocyten een waardevolle optie is voor de behandeling van lever fysiologie en metabolisme in cultuur, ondanks de uitdagingen van het kweken en onderhouden van deze cellen. Onze studie gegevens hierin, de succesvolle isolatie van primaire muisknop hepatocyten door het uitvoeren van een tweestaps collagenase methode in een relatief gemakkelijke en efficiënte manier. Door middel van deze procedures de meerderheid van de geïsoleerde primaire hepatocyten binnen de cultuur behouden hun metabole functionaliteit en morfologische stabiliteit en kan worden gebruikt voor het onderzoeken van hepatische functies waaronder eiwit metabolisme, gluconeogenese, en mitochondriale ademhaling.
Geïsoleerde primaire hepatocyten zijn een krachtige experimentele rol te bestuderen van de moleculaire mechanismen van hepatische energiemetabolisme. Rotenon interfereert met het elektronentransport keten complexe ik activiteit in mitochondriën en blokkeert oxidatieve fosforylatie met de beperkte synthese van ATP53, zoals blijkt uit de activering van AMPK (Figuur 4). De activering AMPK activeert de cellulaire adaptieve reacties waarin de anabole mechanisme ter compensatie van de energie-deficiënte rotenon-geïnduceerde stress worden onderdrukt. Onder deze voorwaarde hebben we met succes de drastische vermindering van de ontluikende eiwitniveaus synthese gedetecteerd in primaire hepatocyten met behulp van een niet-radioactieve, chemo-selectieve afbinding reactie met een TAMRA eiwit detectiemethode (Figuur 5). Deze resultaten bevestigen het belang van de energievoorziening uit de mitochondriën voor passende eiwitsynthese in primaire hepatocyten. Deze technieken zijn nuttig voor het verstrekken van de informatie over een actie van de drug of toxiciteit therapeutisch relevante concentraties in het kader van hepatische eiwitsynthese van gezonde en zieke omstandigheden. Bovendien, deze technieken zijn van toepassing voor de behandeling van de rol van specifieke studierichtingen moduleren van eiwit en energiemetabolisme door het analyseren van primaire hepatocyten geïsoleerd van genetisch gemanipuleerd muizen.
In het algemeen zijn lage rendement en levensvatbaarheid van de cellen de grote nadelen van het gebruik van primaire hepatocyten. Deze problemen zijn te wijten aan verschillende redenen zoals eerste cannulation, onvoldoende wassen met HBSS, ongepaste concentratie van collagenase, of lange-perfusie periode. Onze huidige protocol optimaliseert deze meerdere stappen en leidt tot het verkrijgen van een hoger rendement en levensvatbare cellen rond 20 miljoen/lever/volwassene muizen. Vooral, er zijn twee belangrijke stappen: een is de temperatuur en het debiet van verteerd buffers met goede collagenase concentratie te verteren de hepatische parenchym efficiënt in 15-20 min vanaf canule invoegpositie tot lever excisie, aan te passen en een andere is snel te verwerken deze monsters collagenases behandeld zoals beschreven om te houden van de cellen in gezonde conditie. Terwijl geïsoleerde hepatocyten gebaseerde studies zijn uitgevoerd binnen 48u tijdsbestek in vele gepubliceerde gegevens, doorstaan primaire hepatocyten geïsoleerd met onze procedures de langerlopende cultuur (Figuur 2). Met deze cellen tonen we de robuuste etikettering van hepatische ontluikende eiwitsynthese via de chemo-selectieve afbinding reactie assay, hoewel de concentratie en incubatie tijd met AHA in het protocol wellicht opnieuw worden geoptimaliseerd in verschillende biologische voorwaarden van cellen (bijvoorbeeld fysiologische vs. pathologische, wild-type vs. transgene of afvalrace/neer cellen).
Kortom, hebben we procedures om primaire muisknop hepatocyten voor ontluikende eiwitsynthese te analyseren in een niet-radioactieve wijze opgericht. Deze cellen goed inspelen op de mitochondriale stress en onderdrukking van de eiwitsynthese met activering van het leertraject AMPK vertonen. Dus, zijn deze geïsoleerde hepatocyten waardevolle modellen voor het onderzoek naar de pathofysiologie van hepatische eiwit en energie metabolisme ex vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs geven dat ze hebben geen conflicten van belang.
Acknowledgments
Wij danken Drs. Joonbae Seo en Vivian Hwa voor hun wetenschappelijke inbreng en discussie. Dit werk werd gesteund door de National Institute of Health (NIH) (R01DK107530). T.N. werd gesteund door de PRESTO uit het Japan Science and Technology Agency. Een deel van deze studie werd gesteund door een subsidie van NIH (P30DK078392) voor de spijsvertering ziekte Core onderzoekscentrum in Cincinnati.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPES buffer | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| D-glucose | Fisher Scientific | D16-500 | |
| Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-tetraacetic acid | AmericanBio | AB00505-00025 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | Gibco | 15240-062 | |
| HBSS (10x) no calcium, magnesium, phenol red | Gibco | 14185-052 | |
| Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2.2H2O) | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Density gradient buffer | GE Healthcare | 17-0891-02 | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) low glucose, pyruvate | Gibco | 11885-084 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30910.03 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) (1x) | Gibco | 1897141 | |
| Williams medium E, no glutamine | Gibco | 12551-032 | |
| L-alanyl-L-glutamine dipeptide supplement | Gibco | 35050-061 | |
| Collagenase Type X | Wako Pure Chemical Industries | 039-17864 | |
| Perfusion pump | Cole-Parmer | Masterflex L/S | Equipment |
| IV administration set | EXELINT | 29081 | Equipment |
| A water bath | REVSCI | RS-PB-200 | Equipment |
| Tube heater | Fisher Scientific | Isotemp | Equipment |
| Ethanol | Decon Lab, Inc | 0-39613 | |
| Isoflurane | PHOENIX | 10250 | |
| Autoclaved Cotton Tips | Fisherbrand | 23-400-124 | |
| 100 mm Petri Dish | TPP | 93100 | |
| Connector (Male Luer Lock Ring) | Cole-Parmer instrument | EW-4551807 | |
| 24 G catheters | TERUMO | Surflo 24Gx3/4' | |
| 100 μm Filter (CELL STRAINERS) | VWR | 10199-658 | |
| 15 mL conical-bottom centrifuge tubes | VWR | 89039-666 | |
| 50 mL conical-bottom centrifuge tubes | VWR | 89039-658 | |
| Chemoselective ligation reaction PROTEIN ANALYSIS DETECTION KIT, TAMRA ALKYNE | Invitrogen | C33370 | |
| AHA (L-azidohomoalanine) | Invitrogen | C10102 | |
| DMEM (methionine free) | Gibco | 21013024 | |
| L-Cystine Dihydrochloride | SIGMA | C2526 | |
| Laemmli sample buffer | BioRad | 161-0737 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | SIGMA | P9599 | |
| SDS solution (20%) | BioRad | 161-0418 | |
| Tris-HCL (1M) | American Bioanalytical | AB14044-01000 | |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail | SIGMA | P5726 | |
| Protein concentration measuring Kit (Bovin Serum Albumin-BSA) | BioRad | 500-0207 | |
| 6-well tissue culture plate | TPP | 92006 | |
| Digital Heatblock | VWR | 12621-092 | Equipment |
| Multi-Rotator | Grant-bio | PTR-60 | Equipment |
| Ultrasonic Sonicator | Cole-Parmer | GE130PB | Equipment |
| Standard Heavy-Duty Vortex Mixer | VWR | 97043-566 | Equipment |
| A variable mode laser scanner | GE Healthcare Life Science | FLA 9500 | Equipment |
| Coomassie-dye reagent | Thermo Scientific | 24594 | |
| Inverted microscope | Olympus | CKX53 | Equipment |
| Western Blotting apparatus | BioRad | 1658004 | Equipment |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | Equipment |
| Automated cell counter | BioRad | TC20 | Equipment |
| FluorChem R system | proteinsimple | - | Equipment |
| p-Ampka (T172) antibody | Cell signaling | 2535 | |
| Total-AMPK antibody | Cell signaling | 5832 | |
| Albumin antibody | Cell signaling | 4929 | |
| beta actin antibody | Santa Cruz | sc-130656 | |
| Fine scissors and forceps |
References
- Forbes, R. M., Cooper, A. R., Mitchell, H. H. The composition of the adult human body as determined by chemical analysis. Journal of Biological Chemistry. 203, 359-366 (1953).
- Charlton, M. R. Protein metabolism and liver disease. Baillieres Clinical Endocrinology and Metabolism. 10, 617-635 (1996).
- De, F. P., Lucidi, P. Liver protein synthesis in physiology and in disease states. Current Opinion in Clinical Nutrition and Metabolic Care. 5, 47-50 (2002).
- Stoll, B., Gerok, W., Lang, F., Haussinger, D. Liver cell volume and protein synthesis. Biochemical Journal. 287 (Pt 1), 217-222 (1992).
- Brown, G. C. Control of respiration and ATP synthesis in mammalian mitochondria and cells. Biochemical Journal. 284 (Pt 1), 1-13 (1992).
- Buttgereit, F., Brand, M. D. A hierarchy of ATP-consuming processes in mammalian cells. Biochemical Journal. 312 (Pt 1), 163-167 (1995).
- Morrison, C. D., Laeger, T. Protein-dependent regulation of feeding and metabolism. Trends in Endocrinology and Metabolism. 26, 256-262 (2015).
- Bernardi, M., Ricci, C. S., Zaccherini, G. Role of human albumin in the management of complications of liver cirrhosis. Journal of Clinical and Experimental Hepatology. 4, 302-311 (2014).
- Abbasi, A., et al. Liver function tests and risk prediction of incident type 2 diabetes: evaluation in two independent cohorts. PLoS. One. 7, e51496 (2012).
- Schmidt, M. I., et al. Markers of inflammation and prediction of diabetes mellitus in adults (Atherosclerosis Risk in Communities study): a cohort study. Lancet. 353, 1649-1652 (1999).
- Stranges, S., et al. Additional contribution of emerging risk factors to the prediction of the risk of type 2 diabetes: evidence from the Western New York Study. Obesity (Silver Spring). 16, 1370-1376 (2008).
- Jin, S. M., et al. Change in serum albumin concentration is inversely and independently associated with risk of incident metabolic syndrome. Metabolism. 65, 1629-1635 (2016).
- Sluis, B., Wijers, M., Herz, J. News on the molecular regulation and function of hepatic low-density lipoprotein receptor and LDLR-related protein 1. Current Opinion in Lipidology. 28, 241-247 (2017).
- Viollet, B., et al. Activation of AMP-activated protein kinase in the liver: a new strategy for the management of metabolic hepatic disorders. Journal of Physiology. 574, 41-53 (2006).
- Li, H., Lee, J., He, C., Zou, M. H., Xie, Z. Suppression of the mTORC1/STAT3/Notch1 pathway by activated AMPK prevents hepatic insulin resistance induced by excess amino acids. Amerian Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 306, E197-E209 (2014).
- Qian, S. B., et al. mTORC1 links protein quality and quantity control by sensing chaperone availability. The Journal of Biological Chemistry. 285, 27385-27395 (2010).
- Carling, D. The AMP-activated protein kinase cascade--a unifying system for energy control. Trends in Biochemical Sciences. 29, 18-24 (2004).
- Hardie, D. G., Scott, J. W., Pan, D. A., Hudson, E. R. Management of cellular energy by the AMP-activated protein kinase system. FEBS Letters. 546, 113-120 (2003).
- Li, H., et al. AMPK activation prevents excess nutrient-induced hepatic lipid accumulation by inhibiting mTORC1 signaling and endoplasmic reticulum stress response. Biochimica et Biophysica Acta. 1842, 1844-1854 (2014).
- Proud, C. G. Role of mTOR signalling in the control of translation initiation and elongation by nutrients. Current Topics in Microbiology and Immunology. 279, 215-244 (2004).
- Sarbassov, D. D., Ali, S. M., Sabatini, D. M. Growing roles for the mTOR pathway. Current Opinion in Cell Biology. 17, 596-603 (2005).
- Reiter, A. K., Bolster, D. R., Crozier, S. J., Kimball, S. R., Jefferson, L. S. Repression of protein synthesis and mTOR signaling in rat liver mediated by the AMPK activator aminoimidazole carboxamide ribonucleoside. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 288, E980-E988 (2005).
- Cheng, S. W., Fryer, L. G., Carling, D., Shepherd, P. R. Thr2446 is a novel mammalian target of rapamycin (mTOR) phosphorylation site regulated by nutrient status. Journal of Biological Chemistry. 279, 15719-15722 (2004).
- Howell, J. J., et al. Metformin Inhibits Hepatic mTORC1 Signaling via Dose-Dependent Mechanisms Involving AMPK and the TSC Complex. Cell Metabolism. 25, 463-471 (2017).
- Inoki, K., Zhu, T., Guan, K. L. TSC2 mediates cellular energy response to control cell growth and survival. Cell. 115, 577-590 (2003).
- Wilkening, S., Stahl, F., Bader, A. Comparison of primary human hepatocytes and hepatoma cell line Hepg2 with regard to their biotransformation properties. Drug Metabolism Disposition. 31, 1035-1042 (2003).
- Li, A. P., et al. Present status of the application of cryopreserved hepatocytes in the evaluation of xenobiotics: consensus of an international expert panel. Chemico-Biology Interactaction. 121, 117-123 (1999).
- Hengstler, J. G., et al. Cryopreserved primary hepatocytes as a constantly available in vitro model for the evaluation of human and animal drug metabolism and enzyme induction. Drug Metabolism and Reviews. 32, 81-118 (2000).
- Olsavsky, K. M., et al. Gene expression profiling and differentiation assessment in primary human hepatocyte cultures, established hepatoma cell lines, and human liver tissues. Toxicology and Applied Pharmacology. 222, 42-56 (2007).
- Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q., Liu, M. Isolation and primary culture of rat hepatic cells. Journal of Visualized Experiments. , (2012).
- Li, Y., Cai, S., Zhang, L., Li, X. Simultaneous isolation and primary culture of rat hepatocytes, hepatic stellate cells, Kupffer's cells and hepatic sinus endothelial cells. Nan. Fang Yi. Ke. Da. Xue. Xue. Bao. 34, 532-537 (2014).
- Edwards, M., Houseman, L., Phillips, I. R., Shephard, E. A. Isolation of mouse hepatocytes. Methods in Molecular Biology. 987, 283-293 (2013).
- Schreiber, G., Schreiber, M. The preparation of single cell suspensions from liver and their use for the study of protein synthesis. Subcellular Biochemistry. 2, 307-353 (1973).
- Klaunig, J. E., Goldblatt, P. J., Hinton, D. E., Lipsky, M. M., Trump, B. F. Mouse liver cell culture. II. Primary culture. In Vitro. 17, 926-934 (1981).
- Puviani, A. C., Ottolenghi, C., Tassinari, B., Pazzi, P., Morsiani, E. An update on high-yield hepatocyte isolation methods and on the potential clinical use of isolated liver cells. Comparative Biochemistry and Physiology A Molecular and Integrative Physiology. 121, 99-109 (1998).
- Park, K. H., Song, S. C. Morphology of spheroidal hepatocytes within injectable, biodegradable, and thermosensitive poly(organophosphazene) hydrogel as cell delivery vehicle. Journal of Biosciences and Bioengineering. 101, 238-242 (2006).
- Li, K., et al. Improved performance of primary rat hepatocytes on blended natural polymers. Journal of Biomedicine and Material Research Part A. 75, 268-274 (2005).
- Battle, T., Stacey, G. Cell culture models for hepatotoxicology. Cell Biology Toxicology. 17, 287-299 (2001).
- Kravchenko, L., Petrenko, A., Shanina, I., Fuller, B. A simple non-enzymatic method for the isolation of high yields of functional rat hepatocytes. Cell Biology International. 26, 1003-1006 (2002).
- Berry, M. N., Grivell, A. R., Grivell, M. B., Phillips, J. W. Isolated hepatocytes--past, present and future. Cell Biology and Toxicology. 13, 223-233 (1997).
- Jiang, Q. D., et al. Isolation and identification of bovine primary hepatocytes. Genetics and Molecular Research. 12, 5186-5194 (2013).
- Pertoft, H., Laurent, T. C., Laas, T., Kagedal, L. Density gradients prepared from colloidal silica particles coated by polyvinylpyrrolidone (Percoll). Analytical Biochemistry. 88, 271-282 (1978).
- Lipford, G. B., Feng, Q., Wright, G. L. Jr A method for separating bound versus unbound label during radioiodination. Analytical Biochemistry. 187, 133-135 (1990).
- Mukai, T., et al. In-vivo evaluation of indium-111-diethylenetriaminepentaacetic acid-labelling for determining the sites and rates of protein catabolism in mice. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 51, 15-20 (1999).
- Wilson, M. S. C., Saiardi, A. Importance of Radioactive Labelling to Elucidate Inositol Polyphosphate Signalling. Topics in Current Chemistry. 375, 14 (2017).
- Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. A stepwise huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective "ligation" of azides and terminal alkynes. Angewandte Chemie International Edition. 41, 2596-2599 (2002).
- Banerjee, P. S., Ostapchuk, P., Hearing, P., Carrico, I. S. Unnatural amino acid incorporation onto adenoviral (Ad) coat proteins facilitates chemoselective modification and retargeting of Ad type 5 vectors. Journal of Virology. 85, 7546-7554 (2011).
- Hou, W. L., et al. Inhibition of mitochondrial complex I improves glucose metabolism independently of AMPK activation. Journal of Cell Molecular Medicine. 22, 1316-1328 (2018).
- Davalos, A., et al. miR-33a/b contribute to the regulation of fatty acid metabolism and insulin signaling. Proceedings of the National Academy of Science. , 9232-9237 (2011).
- DiPersio, C. M., Jackson, D. A., Zaret, K. S. The extracellular matrix coordinately modulates liver transcription factors and hepatocyte morphology. Molecular and Cellular Biology. 11, 4405-4414 (1991).
- Xu, L., et al. Human hepatic stellate cell lines, LX-1 and LX-2: new tools for analysis of hepatic fibrosis. Gut. 54, 142-151 (2005).
- Yang, L., Li, P., Fu, S., Calay, E. S., Hotamisligil, G. S. Defective hepatic autophagy in obesity promotes ER stress and causes insulin resistance. Cell Metabolism. 11, 467-478 (2010).
- Heinz, S., et al. Mechanistic Investigations of the Mitochondrial Complex I Inhibitor Rotenone in the Context of Pharmacological and Safety Evaluation. Science Reports. 7, 45465 (2017).
