Här presenterar vi ett protokoll för isolering av sunda och funktionella primära mus hepatocyter. Instruktioner för att upptäcka nedsatt begynnande proteinsyntesen av icke-radioaktiv märkning substrat tillhandahölls för att förstå mekanismerna bakom proteinsyntesen i samband med energiomsättning homeostas i levern.
Hepatocyter är parenkymal celler i levern och engagera flera metaboliska funktioner, inklusive syntes och sekretion av proteiner nödvändiga för systemisk energi homeostas. Primära hepatocyter isolerade från murina levern utgör ett värdefullt biologiska verktyg för att förstå de funktionella egenskaper eller förändringarna som sker i levern. Häri vi beskriva en metod för isolering och kultur av primära mus hepatocyter genom att utföra en två-stegs kollagenas perfusion teknik och diskutera deras utnyttjande för att utreda proteinmetabolism. Levern av en vuxen mus är sekventiellt perfusion med etylenglykol-bis tetraacetic acid (EGTA) och kollagenas, följt av isoleringen av hepatocyter med täthet lutning bufferten. Dessa isolerade hepatocyter är livskraftiga på kultur plattor och underhålla majoriteten av begåvade egenskaper av hepatocyter. Dessa hepatocyter kan användas för bedömningar av proteinmetabolism inklusive begynnande proteinsyntesen icke-radioaktiva reagenser. Vi visar att de isolerade hepatocyterna styrs lätt och omfatta en högre kvalitet och volym stabilitet av proteinsyntesen kopplade till energiomsättning genom att utnyttja chemo-selektiv ligering reaktionen med ett tetrametylrodamin (TAMRA) protein metod för detektering och western blotting analyser. Denna metod är därför värdefulla för att utreda nedsatt begynnande proteinsyntesen som är kopplade till energi homeostas. Följande protokoll beskrivs de material och metoder för isolering av hög kvalitet primära mus hepatocyter och detektion av begynnande proteinsyntes.
Protein är en viktig näring och cirka 50% av torrsubstansen av en mänsklig kropp består av proteiner som har flera biologiska egenskaper och funktioner1. Följaktligen, proteinsyntesen är en av de mesta energi tidskrävande händelserna och en förändrad proteinmetabolism är starkt förknippade med utvecklingen av sjukdomar, inklusive metabola sjukdomar2,3,4. I levern, Proteinbiosynthesis står för omkring 20 – 30% av totala energiförbrukning5,6. Dessutom, proteiner funktion som inte bara passiv eller byggstenar i levern, men också aktiv signal-medla faktorer intracellulärt eller extracellularly att reglera den systemiska metabolism7. Exempelvis minskade nivåer av serumalbumin, som syntetiseras och utsöndras av levern och det mest förekommande proteinet i plasma8, ökar risken för typ 2 diabetes utveckling9,10, 11, medan en högre koncentration av serumalbumin är skyddande mot utveckla metabola syndromet12. Dessutom kan störd eller störning av sekretoriska eller membran-bundna nedsatt proteiner, som modulerar kolesterol homeostas, inklusive lipoproteiner, Receptorn och LRP1, leda till utvecklingen av insulinresistens, hyperlipidemi eller åderförkalkning 13. identifiering av molekylära patofysiologiska mekanismer som är involverade i protein metabolism störning i levern och dess metabola komplikationer kan därför vara användbara för att upptäcka roman farmakologiska metoder för att fördröja uppkomsten eller behandla metabola sjukdomar som insulinresistens, diabetes och alkoholfria fettlever.
Proteinsyntes är tätt knuten till cellulär energistatus (t.ex., bildandet av en peptidbindning under töjning steg av proteinsyntesen kräver 4 phosphodiester obligationer14) och regleras av molekylära vägar som känner av Inter – och mellan – celler näringsämnen tillgänglighet15,16. AMP-aktiverat proteinkinas (AMPK) är en av de intracellulära energi-sensorer som upprätthåller energi homeostas17. När AMPK aktiveras när cellulär energi nivåer blir lägre, funktion AMPK och dess riktade substrat för att stimulera katabola vägar och hämmar anabola processer inklusive protein synthesis18,19. Regleringen av proteinsyntesen medieras av fosforylering av flera översättning faktorer och ribosomala proteiner20. Notera är däggdjur mål för rapamycin komplexa 1 (mTORC1), en viktig drivkraft för proteinsyntesen, en av de viktigaste målen av AMPK21. Aktivering av den mTORC1 vägen ökar cellernas tillväxt och spridning av stimulerande protein översättning och autofagi20,21. Därför är det logiskt att aktiveringen av AMPK kan hämma mTORC1-medierad proteinsyntes22. Faktiskt, aktiveringen av AMPK motverkar och direkt phosphorylates mTORC1 på treonin rester 2446 (Thr2446) leder till inaktivering23 och undertryckande av protein biosyntes24. AMPK kan dessutom indirekt hämmar mTORC1 funktion genom fosforylering och aktivering av tuberös skleros complex 2 (TSC2)25 som är uppströms tillsynsmyndighet för mTORC1 signalering kaskad. Kort sagt, dysreglering av dessa vägar i levern är ofta kopplad till utveckling av metaboliska sjukdomar och därför finns det ett kritiskt behov att upprätta effektiva experimentella verktyg för att undersöka betydelsen av dessa vägar i regleringen av energi och proteinmetabolism i hepatocyter.
Det finns en starkare likhet mellan isolerade primära hepatocyter funktionella egenskaper och i vivo hepatocyter än med in vitro- lever-derived cell linjer26,27,28. Det har visats att primära humana hepatocyter delar 77% likhet med leverbiopsier, medan HepG2 celler, som väl differentierade nedsatt cancerceller och ofta används för att undersöka leverfunktionen, visar mindre än 48% i samband med genuttryck profiler29. Därför utnyttjande av primära hepatocyter, snarare än förevigade kultur celler, är av avgörande betydelse att utreda nedsatt funktion och fysiologi och flera protokoll finns för isolering och kultur av primära hepatocyter särskilt från råttor30,31. Medan de råtta hepatocyterna är användbart med en relativt högre avkastning av celler, har mus hepatocyter en större potential i många vetenskapliga aspekter på grund av den stora tillgången på genetiskt modulerade möss. Det finns dock flera tekniska utmaningar isolera friska och rika primära hepatocyter från möss för cellulär och molekylär-baserade bedömningar: första kanyl införande att BEGJUTA levern med buffert reagenser är mycket svårt att hantera på grund av små och tunna mus portvenen eller sämre hålvenen; det andra kan längre manipulation av celler under isoleringen orsaka minskning i cell kvantitet och kvalitet. tredje, icke-enzymatiska maskinurbening metoder kan resultera i allvarliga skador och producera en låg avkastning av livskraftiga isolerade primära hepatocyter32,33. I 1980 introducerades kollagenas perfusion tekniken för att isolera hepatocyter ur lever från djur34. Denna metod är baserad på kollagenas perfusion av levern35,36,37, infusion av levern med kalcium kelator lösning38,39, enzymatisk nedbrytning och mekaniska dissociation av nedsatt parenkymet35. I det första steget är en mus lever perfusion med kalcium [Ca2 +] gratis buffert innehållande en [Ca2 +] kelator (etylendiamin tetraacetic acid, EDTA). I det andra steget är mus levern perfusion med kollagenas-innehållande buffert att hydrolysera cellular-extracellulära matrix interaktioner. Till skillnad från bufferten används i steg ett, förekomsten av [Ca2 +] joner i bufferten av det andra steget som krävs för effektiv kollagenas aktivitet, varefter smält levern har ytterligare försiktigt och mekaniskt separeras med hjälp av tången mellan den nedsatt kapsel och parenkymvävnaden. Slutligen, bindväv avlägsnas genom filtrering och efterföljande centrifugering separerar livskraftig hepatocyter från både icke-parenkymal celler och icke-levande hepatocyte med användning av täthet lutning buffert40,41 ,42. I den aktuella studien visar vi en modifierad two-step kollagenas perfusion teknik att isolera primära hepatocyter från en mus lever för analys av proteinsyntes.
Den radiolabeling av proteiner används ofta för att kvantifiera de uttrycksnivåerna, omsättning priser, och bestämma biologiska fördelningen av proteiner43 på grund av upptäckten av radioaktivitet44hög känslighet. Användning av radioaktiva isotoper kräver dock starkt kontrollerad forskning omständigheter och förfaranden45. Alternativa icke-radioaktiva metoder har utvecklats och har alltmer vunnit i popularitet. Kemo-selektiv ligering reaktionen med en tetrametylrodamin (TAMRA) protein detektionsmetod är en av dem och baseras på den kemo-selektiv reaktionen mellan en natriumazid och alkynen grupper46, som kan utnyttjas för att analysera cellulära händelser såsom att upptäcka begynnande proteinsyntes och underklasser av glykoproteiner modifierad med en natriumazid grupp. För begynnande proteinsyntesen, kan L-Azidohomoalanine (L-AHA, en natriumazid-modifierad aminosyra) vara metaboliskt införlivas med proteiner och påvisas med hjälp av den TAMRA protein Upptäck metod47. Med hjälp av denna analys i primära mus hepatocyter, visar vi att begynnande proteinsyntes som är tätt kopplat till tillgången på ATP från mitokondriella och AMPK aktivering (figur 1).
Sammanfattningsvis, utnyttjande av primära mus hepatocyter är avgörande för att utreda protein och energi metabolism och kvantifiera begynnande proteinsyntesen är värdefull för att få insikter i den fysiologiska rollen av vägar som är relevanta för utvecklingen och bota hepatocyte-relaterade sjukdomar.
Även om flera förevigade nedsatt cellinjer har föreslagits och används för att undersöka levern fungerar49,50,51,52, saknar dessa celler ofta den viktigaste och grundläggande funktioner i normala hepatocyter, såsom uttrycket av albumin (figur 3). Det är allmänt erkänt, därför att utnyttja primära hepatocyter är ett värdefullt alternativ för att und…
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Drs. Joonbae Seo och Vivian Hwa för sin vetenskapliga input och diskussion. Detta arbete stöds av National Institute of Health (NIH) (R01DK107530). T. stöddes av PRESTIGEN från Japan Science och Technology Agency. En del av denna studie stöddes av ett bidrag från NIH (P30DK078392) för mag sjukdom forskning Core Center i Cincinnati.
HEPES buffer | Fisher Scientific | BP310-500 | |
D-glucose | Fisher Scientific | D16-500 | |
Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-tetraacetic acid | AmericanBio | AB00505-00025 | |
Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240-062 | |
HBSS (10X) no calcium, magnesium, phenol red | Gibco | 14185-052 | |
Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2.2H2O) | Fisher Scientific | C79-500 | |
Density gradient buffer | GE Healthcare | 17-0891-02 | |
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) low glucose, pyruvate | Gibco | 11885-084 | |
Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30910.03 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) (1X) | Gibco | 1897141 | |
Williams medium E, no glutamine | Gibco | 12551-032 | |
L-alanyl-L-glutamine dipeptide supplement | Gibco | 35050-061 | |
Collagenase Type X | Wako Pure Chemical Industries | 039-17864 | |
Perfusion pump | Cole-Parmer | Masterflex L/S | Equipment |
IV administration set | EXELINT | 29081 | Equipment |
A water bath | REVSCI | RS-PB-200 | Equipment |
Tube heater | Fisher Scientific | Isotemp | Equipment |
Ethanol | Decon Lab, Inc | 0-39613 | |
Isoflurane | PHOENIX | 10250 | |
Autoclaved Cotton Tips | Fisherbrand | 23-400-124 | |
100 mm Petri Dish | TPP | 93100 | |
Connector (Male Luer Lock Ring) | Cole-Parmer instrument | EW-4551807 | |
24G catheters | TERUMO | Surflo 24Gx3/4' | |
100 μm Filter (CELL STRAINERS) | VWR | 10199-658 | |
15 ml conical-bottom centrifuge tubes | VWR | 89039-666 | |
50 ml conical-bottom centrifuge tubes | VWR | 89039-658 | |
Chemoselective ligation reaction PROTEIN ANALYSIS DETECTION KIT, TAMRA ALKYNE | Invitrogen | C33370 | |
AHA (L-azidohomoalanine) | Invitrogen | C10102 | |
DMEM (methionine free) | Gibco | 21013024 | |
L-Cystine Dihydrochloride | SIGMA | C2526 | |
Laemmli sample buffer | BioRad | 161-0737 | |
Protease Inhibitor Cocktail | SIGMA | P9599 | |
SDS solution (20%) | BioRad | 161-0418 | |
Tris-HCL (1M) | American Bioanalytical | AB14044-01000 | |
Phosphatase Inhibitor Cocktail | SIGMA | P5726 | |
Protein concentration measuring Kit (Bovin Serum Albumin-BSA) | BioRad | 500-0207 | |
6-well tissue culture plate | TPP | 92006 | |
Digital Heatblock | VWR | 12621-092 | Equipment |
Multi-Rotator | Grant-bio | PTR-60 | Equipment |
Ultrasonic Sonicator | Cole-Parmer | GE130PB | Equipment |
Standard Heavy-Duty Vortex Mixer | VWR | 97043-566 | Equipment |
A variable mode laser scanner | GE Healthcare Life Science | FLA 9500 | Equipment |
Coomassie-dye reagent | Thermo Scientific | 24594 | |
Inverted microscope | Olympus | CKX53 | Equipment |
Western Blotting apparatus | BioRad | 1658004 | Equipment |
Centrifuge | Eppendorf | 5424R | Equipment |
Automated cell counter | BioRad | TC20 | Equipment |
FluorChem R system | proteinsimple | – | Equipment |
p-Ampka (T172) antibody | Cell signaling | 2535 | |
Total-AMPK antibody | Cell signaling | 5832 | |
Albumin antibody | Cell signaling | 4929 | |
beta actin antibody | Santa Cruz | sc-130656 | |
Fine scissors and forceps |