Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

En cellebasert analysen å undersøke ikke-muskel Myosin II Contractility via brettet-gastrulation signalering vei i Drosophila S2R + celler

Published: August 19, 2018 doi: 10.3791/58325
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 2, 2, 1,3,4, 2
1Department of Biology, The University of North Carolina at Chapel Hill, 2Department of Biology, Reed College, 3Carolina Center for Genome Sciences, The University of North Carolina at Chapel Hill, 4Lineberger Comprehensive Cancer Center, The University of North Carolina at Chapel Hill

Summary

Her beskriver vi en contractility analysen bruke Drosophila S2R + celler. Anvendelsen av en ytre ligand, kastet gastrulation (tåke), fører til aktivering av tåke signalering pathway og cellular contractility. Denne analysen kan brukes til å undersøke regulering av mobilnettet contractility proteiner i tåken signalveien.

Abstract

Vi har utviklet et cellebasert analysen bruke Drosophila celler som viser apikale innsnevring initiert av brettet gastrulation (tåke), en secreted epithelial morphogen. I denne analysen, er tåke brukt som en Agonistiske aktivere Rho gjennom en signalnettverk kaskade som inkluderer en G-protein-kombinert reseptor (Mist), en Gα12/13 protein (Concertina/Cta) og en PDZ domene-inneholder guanine nukleotid utveksling faktor (RhoGEF2). Tåke signalering resulterer i rask og dramatisk omorganiseringen av utgangen cytoskeleton å danne en kontraktile vesken streng. Løselig tåke er samlet inn fra en stabil cellen linje og ectopically å S2R + celler, fører til morfologiske endringer som apikale innsnevring, en prosess observert under utviklingsprosesser som gastrulation. Denne analysen er mottakelig for høy gjennomstrømming screening og bruker RNAi, kan lette identifikasjon av flere gener involvert i denne veien.

Introduction

Studier av embryogenesis med genetisk modell organismer har vist seg uvurderlig til vår forståelse av hvordan celler er samlet inn i vev. Studier av Drosophila melanogaster, spesielt, har ført til identifisering av viktige gener og biologiske prinsipper som direkte på morphogenesis og utvikling av organismer fra gjødsling til voksen1,2 , 3. parallelt med genetisk forskning utført med Drosophila, kultivert cellelinjer avledet fra frukt fly vev har også dukket opp som et kraftig system for å ta et bredt spekter av molekylære og cellen biologiske spørsmål4, 5 , 6. drosophila vev kultur celler har minimumskrav for vedlikehold, som de er kultivert ved romtemperatur og uten CO2. Som sådan, de er mottakelig for høy-resolution tenkelig, og de har en høy grad av mottakelighet for genet hemming av RNAi6,7. Mange grupper har brukt Drosophila vev kultur celler som et verktøy for å oppdage gener involvert i celle figur, cellen cytoskjelett dynamics, levedyktighet, fagocytose og signal signaltransduksjon trasé4,8, 9,10,11. Når ansatt som modell sammen med hele dyret, tilbyr kultivert Drosophila cellelinjer en rekke svært utfyllende tilnærminger som akselerere identifikasjon av molekyler viktig for utvikling og gi et rammeverk der du bestemme deres mekanistisk roller12. Her beskriver vi en cellebasert analysen for å studere signalveier som utløser apikale innsnevring via de kaste gastrulation (tåke) veien13,14. Denne cellen-basert contractility analysen kan forskere å undersøke både tåken signalering veien og molekylære mekanismer som regulerer ikke-muskel myosin II contractility.

Gastrulation av tidlig Drosophila embryoet har vært studert i mange år som en genetisk modell for epithelial morphogenesis og mobilnettet overgangen fra epitel mesenchymal celle identitet. En av de viktigste hendelsene i gastrulation er morphogenesis av et delsett av epitelceller langs embryonale ventrale midtlinjen fra kolonne til pyramideformet i figur15,16,17,18. Denne enkel figuren endring resulterer i internalization presumptive mesodermal cellene og er drevet av motor aktiviteten til ikke-muskel myosin II constricting begrepsordbok nettverk16,19,20. Tiår med genetisk forskning har identifisert molekylær komponentene i denne veien og sekvensielt har plassert dem i følgende rekkefølge: 1) tåke utskilles fra apikale domenet epitelceller på ventral midtlinjen; 2) tåke binder til G-protein-kombinert co reseptorene, tåke og Smog, og signaler gjennom en heterotrimeric G-protein kompleks som inneholder Gα12/13 delenhet Concertina (Cta), som er chaperoned av ikke-kanoniske GEF Ric-8; 3) Cta aktiverer en guanine nukleotid utveksling faktor, RhoGEF2, som igjen aktiverer den lille G-protein Rho1; 4) Rho1 aktiverer Rho kinase (Rok); 5) Rok aktiverer ikke-muskel myosin II contractility på apikale domenet gjennom fosforylering av regulatoriske lys kjeden (RLC), dermed produsere apikale innsnevring (figur 1)15,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29. Mutasjoner i flere av disse komponentene forstyrre den normale gastrulation og andre Morfogenetiske bevegelser, inkludert dannelsen av vingen plate og spyttkjertler, som indikerer at denne veien er brukt i flere faser av Drosophila embryogenesis30,31,32. Tåke veien er en av de mest studerte modellene for epithelial forming og har fått betydelig innsikt i hvordan vev nivå morphogenesis reguleres fra gene transkripsjon cytoskeleton-drevet celle bevegelser14,15 ,21.

Vi utviklet en cellebasert contractility analysen som viser mange av mobilnettet svarene nedstrøms tåke som har blitt observert i å utvikle fly embryo17. Vi utviklet en stabil S2 celle linje som uttrykker tåke merket på sin C-terminus med myc under kontroll av en induserbart metallothionine arrangøren som kan høstes ved tillegg av kobber sulfat (CuSO4) til mediet. Når tåke-conditioned media brukes ectopically S2 reseptorer + (S2R +) celler, som er en kildeunderlinjenr S2 celler preget av deres differensial gjengivelsen av reseptorer som Frizzled og integrin underenheter, cellene gjennomgår en omorganisering av det cytoskeleton svært minner om apikale innsnevring12,17,27,33. Disse endringene kan observeres ved kontrast mikroskopi i som tåke behandling fører til utseendet på fase-mørk ruffles antyder en radial økning i ikke-muskel myosin II contractility eller fluorescens mikroskopi der tåke behandling fører til den dannelsen av ikke-muskel myosin II ringer i celler som uttrykker EGFP-merket RLC34. Disse ringene inneholder en myosin-fosforylert regulatoriske lys kjeden (pRLC) synlig via immunostai-23,34,35. Dette tåke-indusert svaret kreves Cta, RhoGEF2, Rho og Rok; Dermed har bruker rekombinant tåke-Myc og S2R + celler, vi etablert et middel til å undersøke tåke-indusert innsnevring i en vev-kultur-basert system24,25,34.

Protocol

1. vedlikehold av Drosophila vev kultur cellene

  1. Opprettholde S2R + S2R +: RLC-EGFP og S2:Fog-Myc celler i romtemperatur, fortrinnsvis mellom 20 ° C og 25 ° C, skjold og Sang M3 insekt medium med 10% fosterets bovin serum, 100 enheter/mL av penicillin, 100 µg/mL streptomycin og 0,25 amfotericin B på en tetthet ikke lavere enn 5 x 105 celler/mL.
    Merk: Lavere celle tettheter føre til døden.
  2. Raskt tine cryo bevarte ampuller av celler og overføre dem til en vev kultur kolbe. Start med en liten vev kultur kolbe (12,5 cm2 eller 25 cm2) i et volum på 4-5 mL celle kultur medium til kulturen er etablert og tegn på celledød på grunn av tining har sunket.
    Merk: Tegn på celledød på grunn av tining inkluderer ikke-tilhenger celler som mangler et jevnt, avrundet form og små mørke biter av mobilnettet rusk i vev kultur medium indikativ nekrotisk celler.
  3. Sakte skalere opp størrelsen på vev kultur ved at cellene å vokse uforstyrret i flere dager (4-8 d) til 100% confluency, hvor det er litt for ikke plass mellom cellene og de begynner å hoper seg opp på hverandre. Overføre alle cellene fra 100% confluent mindre 12,5 cm2 eller 25 cm2 kolbe til en større vev kultur kolbe (av 75 cm2) med 10 mL av celle kultur medium.
    Merk: Opprettholde cellene i en 75 cm2 kolbe vil gi nok celler for de fleste eksperimenter.
  4. Passasje cellene hver 3-4 d av pipettering celle kultur medium opp og ned, bruke den til å fjerne noen løst overholdt celler fra vev kultur plast. Overføre dette mediet, nå inneholder de resuspended cellene, i en fersk kolbe. Fortynne den celler 1:4 med fersk celle kultur medium med hver passasje og gjenta etter behov.

2. RNAi behandling av Drosophila S2R + celler

Merk: Se Rogers og Rogers6 for detaljerte instruksjoner om hvordan å produsere dsRNA egnet for insekt kultur.

  1. Overføre S2R + celler til en 6-godt eller 12-vel vev kultur plate på en tetthet bidrar for livskraft, ikke lavere enn 5 x 105 celler/mL, med komplett skjold og Sang M3 celle kultur medier for RNAi behandlinger.
  2. Arbeider i vev kultur hette, fjerne gamle celle kultur medium ved forsiktig vippe 6-godt eller 12-vel vev kultur plate og aspirating celle kultur medium med en pipette. Raskt erstatte denne gamle celle kultur medium med 1 mL av fersk celle kultur medium av pipettering det i hver brønn.
    Merk: Dette kan gjøres uten betydelige tap når cellene har fått løst følge i 30-45 minutter før sikringene celle kultur medium.
  3. Legge til 10 µg/mL av dsRNA som er generert etter detaljert protokollen i Rogers og Rogers6 av pipettering det direkte inn i vev kultur medium for hver brønn av celler per RNAi tilstand.
  4. Gjenta denne fremgangsmåten daglig, erstatte celle kultur medium med 1 mL av fersk medium og 10 µg/mL dsRNA per RNAi tilstand.
    Merk: RNAi eksperimenter er vanligvis utført for 7 d; nøyaktig tidspunkt er imidlertid avhengig av protein omsetning og effekten av dsRNA. RNAi behandlinger idet kort idet 3 d utarme effektivt celler av visse proteiner, mens andre mål krever lengre behandlinger6.

3. tåke produksjon og Harvest

  1. Skalere opp veksten av S2:Fog-Myc celler ved å tillate dem å vokse uforstyrret for 4-8 d å få en nesten 100% confluent 75 cm2 kolbe celleområde i 10 mL av celle kultur medium (eller alternativt en 150 cm2 kolbe i 20 mL celle kultur medium) til maxi mize tåke produksjon.
  2. Legge til 50 µL av 100 mM CuSO4 (eller 100 µL av 100 mM CuSO4 for en 150 cm2 kolbe) til nesten 100% confluent 75 cm2 kolbe for induksjon av metallothionine promoter. Inkuber 48 h ved romtemperatur.
  3. Fjerne tåke Myc-inneholder mediet fra vev kultur kolbe av pipettering og overføre den til en 15-mL eller 50 mL konisk rør. Sentrifuge 2500 x g på 4 ° C i 10-15 minutter å fjerne mediet av celler og mobilnettet rusk.
  4. Overføre ryddet celle medium til en ny konisk tube og opprettholde det på is. Arbeid i grupper, overføre 5 mL ryddet mediet til 15 mL 3000 MW konsentratorer med Spartments cellulose membraner og sentrifuge det 2500 x g på 4 ° C i 30 minutter om gangen, å konsentrere medium.
    Merk: Alternativt en konsentrator med større volumkapasitet kan være brukt (50 mL). Under konsentrasjon, vil en mørkere farget medium, som er beriket med tåke, begynne å bygge opp nederst i V-formet filteret.
  5. Stikk pipette nederst på "V" til konsentrator og Fjern de mørkere farget mediene mellom hver runde av sentrifugering og overføre den til en frisk 1.7-mL microfuge tube. Opprettholde media på isen.
  6. Bruker du samme konsentratoren, Gjenta trinn 3.4 og 3,5 ved å fjerne det mørkere farget konsentrert tåke-Myc media og erstatte den med mer precleared medium, til mediet har vært konsentrert til 1/10 av sin opprinnelige volum (dvs., 1 mL fra 10 mL starter materiale).
  7. Lagre den konsentrert tåke-Myc på 4 ° C.
    Merk: Etter lagring, må du overvåke bakteriell forurensning, som kan oppstå lengre lagring.
  8. Utføre SDS-side ved å blande 10 µL av konsentrert tåke-Myc medium med 10 µL av en denaturing som inneholder SDS buffer for å danne en lysate. Kjøre SDS side gel på 35 mA for ca 1 h. overføre gel til en nitrocellulose membran (eller alternativt en PVDF membran) 1t på 120 mA. Utføre en western blot bruke alle kommersielt tilgjengelig Myc antistoff for å oppdage en 150-kDa band.
    Merk: Konsentrasjonen av tåke-Myc i betinget medium kan variere per satsvis. Det er ikke nødvendig å bestemme nøyaktig konsentrasjonen tåke-myC for å utføre analysen, men effekten av hvert parti bør testes før du utfører et eksperiment.
  9. Følgende 3.1-3.2, forberede kontrollen S2-conditioned media ved å samle 10 mL av celle kultur medium fra en nesten 100% confluent 75 cm2 kolbe S2 celler (eller alternativt, 20 mL fra en 150 cm2 kolbe) av pipettering. Overføre kontrollen S2 celle kultur medium til en frisk 15-mL eller 50 mL konisk rør.
  10. Følgende 3.4-3.7, fjerner den lysate av celler og mobilnettet rusk med sentrifugering (på 2500 x g på 4 ° C i 30 minutter om gangen) og deretter overføre ryddet cellen lysate til konsentratorer og sentrifuge dem å konsentrere seg kontroll mediet i grupper for å 1/10th opprinnelige volumet.
    Merk: Bruk av S2-conditioned media ikke føre til betydelig celle contractility i analysen.
  11. Lagre konsentrert S2 kontroll media på 4 ° C i flere måneder.
    Merk: Etter lagring, må du overvåke for forurensning.

4. forberedelse av Concanavalin-A-belagt glassbunn retter og Plating S2R + celler

  1. Gjøre 10 mL av concanavalin en (con A) løsning ved å løse opp 5 mg con A i 10 mL vann for en siste konsentrasjon på 0,5 mg/mL. Aliquot denne løsningen i enklere volumer (500 µL til 1 mL) og lagre den på 20 ° C.
  2. Forberede 35 mm glassbunn retter av belegg delen glass hver rett med 200 µL av con A løsningen og ruge rettene i ca 2 minutter ved romtemperatur i vev kultur hette. Deretter fjerne alle con A løsningen (som kan beholdes og gjenbrukes for senere eksperimenter) og la rettene til air-dry helt.
    Merknader: Retter kan tilberedes i store partier og kan lagres i opptil 6 måneder i et tørt sted som en lab-benken skuff.
  3. Legge til ca 2 mL frisk celle kultur medier hver glassbunn rett. Resuspend S2R + cellene å bli testet av analysen av pipettering celle kultur medium opp og ned, bruke den til å koble løst overholde celler.
  4. Overføre resuspended S2R + cellene til 35 mm glassbunn retter med fersk celle kultur medium slik de er mellom 50% - 70% confluent. Sjekk celle tetthet under mikroskopet vev kultur ved å fokusere opp og ned gjennom flere slettene i cellene suspendert i medium å få et anslag over antall celler.
    Merk: Gjennom prøving og feiling, riktig tettheten av nødvendig å oppnå 50% - 70% confluency kan oppnås.
  5. At cellene å knytte til con-A-belagt glassbunn rettene i 45-60 minutter.
    Merk: Fullt vedlagte S2R + celler vises "stekt-egg-like," flat og fase-mørk.

5. effekt tidens tåke-conditioned mediet og mobilnettet Contractility analysen

  1. Eventuelt bekrefte avkastningen av tåke-Myc produsert og konsentrert fra S2:Fog-Myc stabil celler linjer av SDS side og vestlige blotting. Legge til 10 µL SDS inneholder eksempel bufferen 10 µL av konsentrert tåke-Myc og kok i 5 min. følger standard SDS-side og vestlige blotting protokoller og blot for anti-Myc å bekrefte tåke-Myc produksjon.
  2. Fjern alle skjold og Sang M3 medium fra den vedlagte S2R + celler fra trinn 4.3 ved forsiktig pipettering, og nøye legge tilbake 75 µL av fersk skjold og Sang medium å begrense mengden av tåke-conditioned medium brukes.
  3. Legge til 75 µL av tåke-conditioned media i glass delen av glassbunn rett fra trinn 5.2 å bringe det totale volumet til 150 µL, på en 1:1 ratio tåke-conditioned media å skjerme og Sang M3.
    Merk: Et totalt volum på 150-200 µL kreves for å fullt ut dekker den glass-delen av en typisk glassbunn rett; men avhenger dette på dimensjonene av glassbunn parabolen brukes.
  4. Overvåke contractility cellene ved kontrast mikroskopi med 20 X eller 40 X forstørrelse for å observere et helt felt av celler. Spore morfologi av cellene og se etter skiftende mønsteret fase mørke og fase lys ruffling indikativ av figuren endringen.
    Merk: Bruk av tåke fører vanligvis til 30% - 50% av S2R + cellene gjennomgår mobilnettet innsnevring, og etter 10 min, cellene begynne å slappe av, tilbake til sine avrundede kanter, stekt egg som morfologi.
  5. Overvåke robustheten av mobilnettet contractility. Hvis celle respons er sterkt ved hjelp av en 1:1 ratio av tåke-conditioned middels til frisk skjold og Sang medium, redusere tåke-conditioned medium å spare konsentrert tåke-Myc mediet for senere eksperimenter. Bruk ufortynnet tåke-conditioned medium hvis en 1:1 ratio ikke fører til robust mobilnettet innsnevring; vanligvis produserer forholdet 1:3 nok respons til å kunne utføre eksperimentet.
    Merk: Når riktige forholdet mellom tåke-conditioned middels til frisk skjold og Sang medium er opprettet gitt parti av tåke-conditioned middels, Bruk dette forholdet for alle andre eksperimenter.
  6. Overvåke ikke-muskel myosin II dynamics under cellular contractility analysen ved hjelp av stabil S2R + celle linjen som uttrykker GFP-merket regulatoriske lys kjeden (S2R +: Sqh-EGFP).
  7. Bruke etablerte forholdet mellom tåke-conditioned medium å frisk skjold og Sang M3 medium fra trinn 5.2-5.5 fjerner celle-kulturperler medium med en pipette og legge tilbake frisk skjold og Sang medium i glasset del av innglasset bunn parabolen. Perfuse tåke-conditioned medium på forhåndsbestemte forholdet samtidig tilegne seg en bildesekvens live cellene; ta vare å ikke flytte glassbunn parabolen i perfusjonen.

6. fastsettelse og flekker av trange S2R + celler

  1. Fastsette S2R + celler med en 10% paraformaldehyde løsning i PEM buffer (100 mM rør, 1 mM EGTA, 1 mM MgCl2, pH 6,9).
    Merk: PEM bufferen er vanligvis gjort på 2 x lagerløsning og kan lagres for måneder på 4 ° C.
  2. Fjerne celle kultur medium fra tåke-behandlet S2R + celler av pipettering og umiddelbart erstattes med 1,5-2.0 mL 10% paraformaldehyde. Inkuber i 15 min ved romtemperatur.
    Merk: Fast celler kan lagres i fiksering løsning på 4 ° C i flere dager; Det er imidlertid viktig at første 15 minutter fiksering gjøres ved romtemperatur før du overfører cellene til 4 ° C.
  3. Fjerne 10% paraformaldehyde løsningen av pipettering og kast denne organisk avfall produkt riktig. Skyll cellene av forsiktig pipettering 1.5-2.0 mL fosfat-bufret saltoppløsning (PBS) på 35 mm glassbunn maten. Fjern gamle PBS ved pipettering og erstatte den med 1,5-2.0 mL frisk PBS 2 x mer fjerne gjenværende fiksering løsningen.
    Merk: Det er viktig at cellene ikke tørr fra dette punktet på i protokollen.
  4. Blokkere cellene med ca 200 µL av 5% normal geit serum fortynnet i PBS som har vært supplert med 0,1% ikke-ioniske vaskemiddel (PBST) for 20 min ved romtemperatur.
    Merk: Vanligvis blokkerer løsninger inneholder serum som tilsvarer organismen sekundære antistoffer er oppvokst i.
  5. Klargjør primære antistoff løsningen ved å fortynne den i PBST. Bruk et volum på ca 200 µL til dekker den glass delen av glassbunn parabolen.
    1. Fjerne blokkering løsningen av pipettering og legge den primære antistoff-løsningen direkte til delen glass av retten. Inkuber 1t ved romtemperatur eller, alternativt ruge over natten på 4 ° C.
    2. Når rugende natten på 4 ° C, vikle 35 mm glassbunn parabolen med parafilm å hindre fordampning.
  6. Fjerne den primære antistoff løsningen av pipettering og skyll cellene av pipettering 1.5-2.0 mL frisk PBS på 35 mm glassbunn maten. Fjerne PBS av pipettering og erstatte den med 1,5-2.0 mL frisk PBS 2 x mer.
  7. Forberede en løsning av sekundær antistoff ved å fortynne den i PBST. Et volum på 200 µL er tilstrekkelig å bare dekke delen glass av retten.
    1. Legge til sekundære antistoff løsningen direkte til glasset del av parabolen. Inkuber cellene med sekundær antistoff løsning for 1t ved romtemperatur eller over natten på 4 ° C.
    2. Pakk 35 mm parabolen med parafilm hvis rugende overnatting, for å hindre fordampning.
  8. Fjern sekundær antistoff løsningen ved pipettering og skyll cellene med PBS av pipettering 1.5-2.0 mL frisk PBS på maten. Fjerne gamle PBS og erstatte den 2 x mer, følge samme fremgangsmåte.
  9. Bevare de faste og farget cellene ved å legge til nok en anti-fade fluorescerende montering medium å dekke den glass delen av glassbunn 35mm parabolen.
  10. Lagre prøvene 4 ° C og fra lys.
    Merk: Fluorescerende signalet vil sakte forfalle månedene selv om riktig lagret. For best resultat, bilde innen en uke.

7. imaging og måling av mobilnettet Contractility analysen

  1. Bildet fast S2R + celler ved hjelp av en standard invertert lys mikroskop med kontrast, DIC eller fluorescens imaging evner. Bruker 20 X eller 40 X forstørrelse, fange 10-30 ved bildefelt celleområde avhengig av den cellen tettheten, med mål om å skaffe bilder av 200 eller mer celler per betingelse.
  2. Bruker en standard celle teller, teller og registrere antallet kontrakt (fase-mørk, bonneted celler) og noncontracted celler per hvert felt fanget.
    Merk: Det er best å ha to forskere ta uavhengige teller kontrakt og noncontracted celler per felt, eller alternativt samme forskeren kan telle bildefeltet av celler tre ganger, slik at for en gjennomsnittlig antall kontrakt og noncontracted celler per felt skal beregnes.
  3. Forbered flere con-A-belagt glassbunn retter per eksperimentelle betingelse som beskrevet i trinn 4.2. Pipetter opp og ned celle kultur medium å dislodge løst tilhenger S2R +: Sqh-EGFP celler og plate dem slik at de 50% - 70% confluent i 35 mm glassbunn retter. At cellene å feste i 30-45 minutter.
  4. Bildet S2R +: Sqh-EGFP celler live bruker et spinning-disk, feide-feltet AC confocal mikroskop, eller av lys arks mikroskopi bruker 60 X - 100 X forstørrelse. Fjern alle skjold og Sang M3 medium fra glassbunn parabolen som inneholder tilknyttede S2R +: Sqh-EGFP-celler.
    1. Perfuse forhåndsbestemt forholdet mellom tåke-Myc betinget medium til frisk skjold og Sang M3 medium fra trinn 5.2-5.5 direkte på glass delen av glassbunn retten bruker en pipette, forsiktig for ikke å forstyrre posisjon rett på målet. Hente bilder i 12-15 min for å fange initiering og full sammentrekning av S2R +: Sqh-EGFP-celler.
      Merk: Hvis flekker for ikke-muskel myosin eller myosin-pRLC, er også dannelsen av en stram myosin ring på overflaten av cellene om contractility. Hvis imaging S2R +: Sqh-EGFP celler live, EGFP-merket RLC-data vil danne lignende stramt ringer (se Figur 3) indikativ av contractility. Figur endringen som oppstår vil føre cellene til "karosseri", tar opp 3D form; flyet av fokus av mikroskopet må justeres for å spore denne cellen figur endringen. Under kontroll RNAi betingelser, vanligvis 30% - 50% av cellene gjennomgår innsnevring på tillegg av tåke. Vær oppmerksom på at noen RNAi forhold kan føre til innsnevring i fravær av tåke.

Representative Results

S2 og S2:Fog-Myc celler var vokst til nær confluent forhold i en 150 cm2 vev kultur kolbe og ble behandlet med 25-75 µM CuSO4 over en periode på 24-48 timer å indusere uttrykk tåke-myC (figur 2). Prøver fra S2 celler (figur 2A) og S2:Fog-Myc celler (figur 2B) ble fjernet og tåke-Myc produksjon var overvåket ved western blot. Som forventet, kunne vi oppdage tåke-Myc i media høstet fra S2 celler under alle forhold. Men vi gjorde oppdager tåke i media høstet fra S2:Fog-Myc stabil celle linje så tidlig som 24 timer etter induksjon med 75 µM CuSO4. S2R + celler knyttet til con-A-belagt glassbunn retter uttrykke en EGFP-merket regulatoriske lys kjeden (GFP-RLC) av ikke-muskel myosin II (tall 3A og 3B). Live-celle imaging ble utført på en invertert mikroskop utstyrt med 100 X / 1.4 NA linsen under perfusjon av tåke-conditioned media. Ca 5 minutter etter behandling med tåke-Myc, RLC-data dannet ringer om ikke-muskel myosin II innsnevring. Disse ringene kan observeres gjennom immunostaining S2R + celler med et antistoff reist mot en syntetisk phosphopeptide tilsvarer rester rundt Ser19 av menneskelig myosin RLC (tall 4A og 4B). Denne antistoff cross-reacts med Drosophila RLC.

Her har vi et representativt eksempel på mobilnettet contractility analysen etter en 7-dagers behandling av celler med kontroll RNAi og dsRNA mot Rho1 (tall 5A - 5E). S2R + celler var belagt con-A-belagt glassbunn retter og behandlet med tåke-conditioned (+ tåke) media eller kontroll media (-tåke). Antall avtalte celler ble deretter kvantifisert etter fiksering. Fase-kompakt ruffles indikativ av innsnevring var fremtredende i kontroll utarmet cellene behandlet med tåke-conditioned media (figur 5B). I figur 5Cer Rho-utarmet cellene behandlet med S2-conditioned medium et typisk eksempel på avrundede kanter, stekt egg som morfologi. Merk at Rho spiller en rolle i tåke signalveien og cytokinesis; dermed Rho-utarmet cellene ofte ikke skal dele, fører til en økning i Cellestørrelse og ploidy. Behandling av kontroll utarmet celler med tåke-conditioned media typisk fører til 30% - 50% av cellene gjennomgår innsnevring, mens vi kunne observere betydelig innsnevring i Rho-utarmet celler.

Figure 1
Figur 1:antatte tåken signalveien. I fravær av tåke, Gα12/13 underenheten, Concertina (Cta), sammen med partnerne bindende Gϒ og Gβ, er inaktive og forbundet med co receptors tåke og Smog. Ric-8 chaperones Cta og regulerer sin subcellular lokalisering. På tåke bindende, Cta tar avstand fra Gϒ og Gβ rekrutterer RhoGEF2 til cellemembranen der det gir utveksling av BNP for GTP i den lille GTPase Rho1. GTP-bundet Rho1, nå aktiv, aktiverer Rho Kinase (Rok), som phosphorylates RLC av ikke-muskel myosin, fører til aktivering og påfølgende mobilnettet contractility. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Gang-løpet av tåke-Myc produksjon. Disse skjermbildene viser cellen kultur medium høstet fra en nær 100% confluent kolbe (A) kontroll S2 celleområde eller (B) S2:Fog-Myc stabil celler. Cellene ble behandlet med 25-75 µM CuSO4 over en periode på 24-48 timer. Celle kultur mediet ble samlet inn og forberedte SDS side og vestlige blotting. Tåke-Myc ble oppdaget av en anti-Myc antistoff. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : Live-celle avbilding av tåke-indusert innsnevring. Stabil S2R + cellelinjer uttrykke EGFP-merket RLC av ikke-muskel myosin II ble fotografert av feide-feltet AC confocal mikroskopi under perfusjon av tåke-conditioned media. Tiden vises i minutter og sekunder. (A) dette panelet viser et bilde av en fokalplanet nær celle-dekkglassvæske grensesnittet på tidspunkt 0:00 før perfusjon av tåke-Myc. (B) dette panelet viser en tidsserier (0:30-10:00) bilder tatt på en fokalplanet nær toppen av cellen. Hvite pilene viser omorganiseringen av ikke-muskel myosin II som angitt av EGFP-RLC i kontraktile ringer under innsnevring. Skala baren er 10 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 : Fosforylert RLC regionaliserer til kontraktile ringer etter induksjon av innsnevring av tåke-Myc. S2R + celler var fast og farget for utgangen bruker phalloidin (rød), fosforylert RLC bruker et phosphoserine-19 antistoff (grønn) og DAPI (DNA, blå), etter behandling med (A) eller (B) tåke-Myc-conditioned media. Merk omorganiseringen av fosforylert RLC i ringer på tillegg av tåke-Myc. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5 : Representant kvantifisering av tåke-indusert mobilnettet contractility analysen. S2R + celler ble behandlet med (A og B) RNAi eller (C og D) dsRNA mot den lille GTPase Rho1 for 7 dager. Etter denne tid, cellene var belagt con-A-belagt glassbunn retter og ble behandlet med (A og C) kontroll medier eller (B og D) tåke-Myc-conditioned media. Skalaen bar representerer 10 µm. (E) A spredningsdiagram angir middelverdi og 95% konfidensintervall brøkdel av innleide celler per betingelse. Enkeltpunkt representerer brøkdel av innleide celler per synsfelt på 40 X forstørrelse (10-120 celler per felt) og tallene i parentes viser antall celler telles for både kontrakt og ikke-forkortet celler over tre separate RNAi eksperimenter. Stjerner betegne en statistisk signifikant forskjell mellom RNAi og tåke-behandlet forhold som veis VARIANSANALYSE (p < 0,0001) med Tukeys flere sammenligning legge hoc analyse. Merk at det var ingen statistisk signifikant forskjell (født) mellom Rho1 RNAi-behandlet prøvene behandlet med kontroll eller tåke-Myc-conditioned media. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Her presenterer vi en detaljert protokoll for en cellebasert contractility analysen ved hjelp av en Drosophila vev kultur cellen linje (S2R + celler), som gjennomgår ikke-muskel myosin II innsnevring som svar på tåke signalering. Denne analysen er nyttig for å undersøke tåke veien, så vel som mekanismer som regulerer ikke-muskel myosin II contractility.

Celle-dyrking betraktninger:
Betingelsene under hvilke S2R + celler vedlikeholdes er avgjørende for å oppnå pålitelige data fra denne analysen. Når du planlegger å utføre contractility analysen, det best å opprettholde S2R + celler i skjold og Sang M3 insekt medium. Mens S2R + celler kan trives i andre insekt celle kultur medier (f.eksSF900 eller Schneiders insekt middel), de ofte miste deres respons til tåke. S2R + celler som har høy passasje, generelt mer enn 20-25 passasjer, begynner å miste følsomheten til RNAi. Det er best å bruke tidlig passering celler for alle eksperimentene. En annen viktig aspekt å RNAi uttømming eksperimenter er å velge riktige kontroller. Felles negative kontroller inkluderer dsRNA rettet mot EGFP eller pBlueScript, verken har homologi å fly genomet. Målretting proteiner i tåke veien (Rho, Rok, etc.), som når oppbrukt, forhindre aktiveringen av ikke-muskel myosin contractility, er også nyttig kontroller. S2:Fog-Myc celler kan opprettholdes i en alternativ celle kultur medium som SF900 med 100 enheter/mL av penicillin, 100 µg/mL streptomycin, og 0,25 amfotericin B. Merk at FBS er ikke nødvendig når dyrking celler i SF900. Cellen tetthet er også en kritisk komponent for alle aspekter av Drosophila vev kultur celler. Ulikt pattedyr vev kultur, Drosophila-avledet vev kultur celler trives best under høyere celle tettheter (tettheter ikke lavere enn 5 x 105 celler/mL). Men når du utfører denne analysen, er det kritisk at celler ikke er belagt con-A-belagt glassbunn retter over 80% samløpet, som kvantifiseringen kontrakt versus ikke-forkortet celler blir ekstremt kjedelig.

Kritiske aspekter og Alternative tilnærminger til mobilnettet Contractility analysen:
Produksjon av tåke, ligand som utløser ikke-muskel myosin II contractility, er en nøkkelkomponent i denne analysen. Tåke genet koder et protein på 730 aminosyrer med en anslått molekylvekt ~ 78 kDa26. Hydropathy analyse viste en strekning av 12 hydrofobe rester på Tåkes amino-terminus som kan fungere som en sekresjon signal sekvens. I tillegg inneholder koding sekvensen også flere nettsteder for potensielle N - og O-tilknyttet glykosylering, videre foreslå tåke er en utskilles protein26. Dette var tåke lokalisert til sekretoriske blemmer i presumptive epidermal cellene gjennomgår apikale innsnevring16. Tåke-Myc uttrykket ble indusert ved tillegg av kobber sulfat til medium, og antistoffer mot tåke eller Myc anerkjent en 150-kD protein fra kultur medium høstet fra indusert kulturer, men ikke fra indusert media fra S2 celler mangler den tåke-Myc konstruere. Denne molekylvekt var høyere enn den anslåtte 80-kD Molekylvekten av tåke og antyder at sekretoriske maskiner av S2 celler kan glycosylate protein før exocytosis. På grunn av den potensielle variasjonen i tåke rensing anbefales det å bruke samme tåke-conditioned medier for alle eksperimenter. Gjøre opp store grupper av konsentrert tåke-Myc media vil hjelpe opprettholde konsistens i runder av eksperimenter.

Suksessen til denne analysen avhenger også trygt identifisere celler som har gjennomgått innsnevring. Mens trange celler kan observeres av fluorescens mikroskopi, av flekker for utgangen eller ikke-muskel myosin II, er den mest pålitelige måten å identifisere og telle trange celler gjennom kontrast eller DIC mikroskopi. Nøyaktig teller kan oppnås med 20 X - 40 X forstørrelse på de fleste standard lys mikroskop. Selv om protokollen skrevet her bruker glassbunn retter, kan analysen også utføres ved hjelp av standard 1,5 glass coverslips belagt med con A. Tillegg av tåke kan gjøres i 35 mm av vev kultur på en dekkglassvæske plassert på parafilm, for å begrense mengden av tåke brukes for hver analysen. Kvaliteten på fiksering er en kritisk komponent i analysen, som dårlig fast celler kan føre til falske positiver. Bruke friske fiksering løsning og kontrollere vil cellene aldri tørr når fast føre til mer pålitelige resultater. Til slutt, er det viktig å telle et stort antall celler. Vanligvis bare 30% - 50% av ubehandlet eller kontroll RNAi-behandlet celler constrict etter perfusjon av tåke. Det er imidlertid en basal nivå av innsnevring som oppstår i S2R + celler, så mange celler for å sikre noen endring i delen av trange celler skyldes behandlinger. Videre kan uttømming av noen proteiner involvert i regulering av ikke-muskel myosin II contractility føre til hyper-contractility, selv i fravær av tåke. Dataene som presenteres her er fra over 3600 celler som ble talt, i tre etterfølgende RNAi behandlinger bruker samme batch tåke-conditioned medier.

Anvendelser av mobilnettet Contractility analysen:
Denne contractility analysen, kombinert med RNAi screening metoder, tilbyr et kraftig system for å studere celle signalisering, morphogenesis og mobilnettet contractility. Tidligere har det blitt brukt til å identifisere en av to tåke co reseptorer21. En målrettet skjerm på 138 G-protein-kombinert reseptorer (GPCRs) er utarmet av RNAi i S2R + celler, og dens evne til å svare på tåke var assayed som beskrevet i protokollen presenteres her. 138 GPCRs, én ble tidligere uncharacterized genet, nå kjent som tåke, avdekket. Videre undersøkelser i funksjonen av tåke viste at ikke bare var det kreves for tåke-indusert mobilnettet contractility i S2R + celler, men det var også viktig for gastrulation i utviklingsland Drosophila21. Videre ble denne analysen brukt til å vise at Ric-8, en ikke-kanoniske GEF, er også en komponent i tåken signalering veien27. En rekke epistasis RNAi eksperimenter kombinert med contractility analysen viste at Ric-8 samvirker med Gα12/13 delenhet Cta og funksjoner for å lokalisere den i cellen, som er avgjørende for tåke-indusert mobilnettet contractility31 .

Drosophila vev kultur er godt egnet for nybegynnere, som cellene er lett holdt ved romtemperatur, krever ikke CO2 eller bufret celle kultur medium og er robuste så lenge riktig celle kultur tettheter opprettholdes. Mobilnettet contractility analysen var utført av laboratoriet delen av et lavere celle biologi kurs, der elevene hadde liten eller ingen erfaring med dyrking celler eller mikroskopi. Mobilnettet contractility analysen presenteres her representerer en kraftig, cellen-basert verktøy som kan brukes i gen funnet, eller for å avhøre tåken signalveien, hjelper oss å bedre forstå utviklingsprosesser, som apikale innsnevring og ikke-muskel myosin II contractility, generelt.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Forfatterne vil gjerne takke medlemmer av Rogers Lab og Applewhite lab, Greta Glover og studentene i Reed College våren 2018 mobilnettet biologi kurs, som har bidratt til utviklingen av denne protokollen. Videre gjerne forfatterne takke medlemmer av Ritz laboratoriet nøye lese og redigere dette manuskriptet. Forskningen i denne publikasjonen ble støttet av National Science Foundation award nummer 716964 D.A.A. og A.R. og Reed College biologi avdeling.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
S2R+ cells Drosophila Genomics Resorce Center  150 cell culture line, exhibits contractility when treated with Fog
S2:Fog-myc cells Drosophila Genomics Resorce Center  218 cell culture line, produces Fog-myc under pMT promoter
S2R+ :Sqh-EGFP cells Drosophila Genomics Resorce Center  196 cell culture line, stably expresses Sqh(RLC of non-muscle myosin II) tagged with EGFP
Shield and Sang M3 Sigma-Aldrich S3652 cell culture medium
SF900 insect medium Thermofisher Scientific 12658019 alternative cell cutlure medium
Schneider’s insect medium Thermofisher Scientific 21720024 alternative cell cutlure medium
Fetal Bovine Serum Thermofisher Scientific 16000044 media supplement
Antibiotic-Antimycotic (100X) Thermofisher Scientific 15240112 antimicrobial/antifugal media supplement
Concanavalin A MP Biomedicals 150710 used to coat dishes and coverslip for cellular adhesion
Glass bottom plates Maktek P35G-1.5-10 used for assay and for fixing and staining cells
Glass cover slips Corning 2940-225 alternative to glass bottom dishes
Protein concentrators Millipore UFC903008 30,000 molecular weight cutoff, used to concentrate media
25 cm2, 75 cm2, 150 cm2 tissue culture flasks Genessee 25-204,25-206,25-208,25-210 used to culture cells
6-well and 12-well tissue culture dishes Genessee 25-105, 25-106 used to culture cells
Flourescent mounting medium Dako S3023 to preserve fixed cells
32% Paraformaldehyde EMS 15714-S used to fix cells
Pipes EMS 19240 used in PEM buffer for cell fixation
Anti-Myc Antibody Drosophila Hybirdoma Bank cat# 9E10 used to dectect Fog-Myc 
PhosphoSerine-19 antibody Cell Signaling 3671 antibody against phosphorylated regulatory light chain (RLC) serine 19
488-Phalloidin, 568-Phalloidin Thermofisher Scientific A12379, A12380 to stain for f-actin
Hawk-VT multi-point array scanning confocal system  VisiTech International Used for live cell imaging of S2R+:Sqh cells
Eclipse TE300 Inverted microscope Nikon Used for live cell imaging of S2R+:Sqh cells

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. Drosophila tools and assays for the study of human diseases. Disease Model Mechanisms. 9 (3), 235-244 (2016).
  2. Bier, E. Drosophila, the golden bug, emerges as a tool for human genetics. Nature Reviews Genetics. 6 (1), 9-23 (2005).
  3. Millburn, G. H., Crosby, M. A., Gramates, L. S., Tweedie, S., FlyBase, C. FlyBase portals to human disease research using Drosophila models. Disease Model Mechanisms. 9 (3), 245-252 (2016).
  4. Perrimon, N., Mathey-Prevot, B. Applications of high-throughput RNA interference screens to problems in cell and developmental biology. Genetics. 175 (1), 7-16 (2007).
  5. Currie, J. D., Rogers, S. L. Using the Drosophila melanogaster D17-c3 cell culture system to study cell motility. Nature Protocols. 6 (10), 1632-1641 (2011).
  6. Rogers, S. L., Rogers, G. C. Culture of Drosophila S2 cells and their use for RNAi-mediated loss-of-function studies and immunofluorescence microscopy. Nature Protocols. 3 (4), 606-611 (2008).
  7. Applewhite, D. A., Davis, C. A., Griffis, E. R., Quintero, O. A. Imaging of the Cytoskeleton Using Live and Fixed Drosophila Tissue Culture Cells. Methods Molecular Biology. 1365, 83-97 (2016).
  8. Rogers, S. L., Wiedemann, U., Stuurman, N., Vale, R. D. Molecular requirements for actin-based lamella formation in Drosophila S2 cells. The Journal of Cell Biology. 162 (6), 1079-1088 (2003).
  9. Yi, C. H., et al. A genome-wide RNAi screen reveals multiple regulators of caspase activation. The Journal of Cell Biology. 179 (4), 619-626 (2007).
  10. Philips, J. A., Rubin, E. J., Perrimon, N. Drosophila RNAi screen reveals CD36 family member required for mycobacterial infection. Science. 309 (5738), 1251-1253 (2005).
  11. Nir, O., Bakal, C., Perrimon, N., Berger, B. Inference of RhoGAP/GTPase regulation using single-cell morphological data from a combinatorial RNAi screen. Genome Research. 20 (3), 372-380 (2010).
  12. Manning, A. J., Peters, K. A., Peifer, M., Rogers, S. L. Regulation of epithelial morphogenesis by the G protein-coupled receptor mist and its ligand fog. Science Signaling. 6 (301), 98 (2013).
  13. Leptin, M., Grunewald, B. Cell shape changes during gastrulation in Drosophila. Development. 110 (1), 73-84 (1990).
  14. Leptin, M. Gastrulation movements: the logic and the nuts and bolts. Developmental Cell. 8 (3), 305-320 (2005).
  15. Martin, A. C., Goldstein, B. Apical constriction: themes and variations on a cellular mechanism driving morphogenesis. Development. 141 (10), 1987-1998 (2014).
  16. Dawes-Hoang, R. E., et al. folded gastrulation, cell shape change and the control of myosin localization. Development. 132 (18), 4165-4178 (2005).
  17. Rogers, S. L., Wiedemann, U., Häcker, U., Turck, C., Vale, R. D. Drosophila RhoGEF2 associates with microtubule plus ends in an EB1-dependent manner. Current Biology. 14 (20), 1827-1833 (2004).
  18. Coravos, J. S., Martin, A. C. Apical Sarcomere-like Actomyosin Contracts Nonmuscle Drosophila Epithelial Cells. Developmental Cell. 39 (3), 346-358 (2016).
  19. Mason, F. M., Tworoger, M., Martin, A. C. Apical domain polarization localizes actin-myosin activity to drive ratchet-like apical constriction. Nature Cell Biology. 15 (8), 926-936 (2013).
  20. Fox, D. T., Peifer, M. Abelson kinase (Abl) and RhoGEF2 regulate actin organization during cell constriction in Drosophila. Development. 134 (3), 567-578 (2007).
  21. Manning, A. J., Rogers, S. L. The Fog signaling pathway: insights into signaling in morphogenesis. Developmental Biology. 394 (1), 6-14 (2014).
  22. Xie, S., Mason, F. M., Martin, A. C. Loss of Gα12/13 exacerbates apical area dependence of actomyosin contractility. Molecular Biology of the Cell. 27 (22), 3526-3536 (2016).
  23. Vasquez, C. G., Tworoger, M., Martin, A. C. Dynamic myosin phosphorylation regulates contractile pulses and tissue integrity during epithelial morphogenesis. The Journal of Cell Biology. 206 (3), 435-450 (2014).
  24. Parks, S., Wieschaus, E. The Drosophila gastrulation gene concertina encodes a G alpha-like protein. Cell. 64 (2), 447-458 (1991).
  25. Barrett, K., Leptin, M., Settleman, J. The Rho GTPase and a putative RhoGEF mediate a signaling pathway for the cell shape changes in Drosophila gastrulation. Cell. 91 (7), 905-915 (1997).
  26. Costa, M., Wilson, E. T., Wieschaus, E. A putative cell signal encoded by the folded gastrulation gene coordinates cell shape changes during Drosophila gastrulation. Cell. 76 (6), 1075-1089 (1994).
  27. Peters, K. A., Rogers, S. L. Drosophila Ric-8 interacts with the Gα12/13 subunit, Concertina, during activation of the Folded gastrulation pathway. Molecular Biology of the Cell. 24 (21), 3460-3471 (2013).
  28. Jha, A., van Zanten, T. S., Philippe, J. M., Mayor, S., Lecuit, T. Quantitative Control of GPCR Organization and Signaling by Endocytosis in Epithelial Morphogenesis. Current Biology. 28 (10), 1570-1584 (2018).
  29. Kerridge, S., et al. Modular activation of Rho1 by GPCR signalling imparts polarized myosin II activation during morphogenesis. Nature Cell Biology. 18 (3), 261-270 (2016).
  30. Myat, M. M., Andrew, D. J. Organ shape in the Drosophila salivary gland is controlled by regulated, sequential internalization of the primordia. Development. 127 (4), 679-691 (2000).
  31. Kanesaki, T., Hirose, S., Grosshans, J., Fuse, N. Heterotrimeric G protein signaling governs the cortical stability during apical constriction in Drosophila gastrulation. Mechanisms of Development. 130 (2-3), 132-142 (2013).
  32. Nikolaidou, K. K., Barrett, K. A Rho GTPase signaling pathway is used reiteratively in epithelial folding and potentially selects the outcome of Rho activation. Current Biology. 14 (20), 1822-1826 (2004).
  33. Yanagawa, S., Lee, J. S., Ishimoto, A. Identification and characterization of a novel line of Drosophila Schneider S2 cells that respond to wingless signaling. Journal Biological Chemistry. 273 (48), 32353-32359 (1998).
  34. Mason, F. M., Xie, S., Vasquez, C. G., Tworoger, M., Martin, A. C. RhoA GTPase inhibition organizes contraction during epithelial morphogenesis. The Journal of Cell Biology. 214 (5), 603-617 (2016).
  35. Martin, A. C., Kaschube, M., Wieschaus, E. F. Pulsed contractions of an actin-myosin network drive apical constriction. Nature. 457 (7228), 495-499 (2009).

Tags

Utviklingspsykologi biologi problemet 138 apikale innsnevring tåke signalnettverk mobilnettet contractility ikke-muskel myosin II begrepsordbok signalisering
En cellebasert analysen å undersøke ikke-muskel Myosin II Contractility <em>via</em> brettet-gastrulation signalering vei i <em>Drosophila</em> S2R + celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Peters, K. A., Detmar, E.,… More

Peters, K. A., Detmar, E., Sepulveda, L., Del Valle, C., Valsquier, R., Ritz, A., Rogers, S. L., Applewhite, D. A. A Cell-based Assay to Investigate Non-muscle Myosin II Contractility via the Folded-gastrulation Signaling Pathway in Drosophila S2R+ Cells. J. Vis. Exp. (138), e58325, doi:10.3791/58325 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter