Summary
小鼠受精卵和早期胚胎受透明带保护, 透明带是一种糖蛋白基质, 形成了对抗基因传递的屏障。本文介绍了一种用激光射孔带带的协议, 用慢病毒载体传递胚胎细胞, 并创造转基因小鼠。
Abstract
慢病毒是将基因传递给哺乳动物细胞的有效载体。继转导之后, 慢病毒基因组被稳定地纳入宿主染色体, 并传递给后代。因此, 它们是创造稳定细胞系、体内传递指标和单个细胞受精卵的理想载体, 以创造转基因动物。然而, 小鼠受精卵和早期胚胎是由透明带保护的, 透明带是一种糖蛋白基质, 形成了抵御慢病毒基因传递的屏障。慢病毒太大, 无法穿透带状疱疹, 通常通过微注射病毒颗粒进入卵细胞周围腔, 即带状疱疹和胚胎细胞之间的空间。对高技能技术人员和专用设备的需求已最大限度地减少了小鼠胚胎基因传递慢病毒的使用。本文介绍了一种用激光射孔小鼠受精卵的渗透方案。激光穿孔不会对胚胎造成任何损害, 并允许慢病毒进入胚胎细胞进行基因传递。转基因胚胎可以在体外发育为囊胚, 如果植入假性小鼠体内, 就会发育成转基因幼崽。该协议中使用的激光是有效的, 易于使用。慢病毒提供的基因稳定地纳入小鼠胚胎细胞, 并可细菌传播。这是一种创造转基因小鼠的替代方法, 不需要微操作和微注射受精卵。
Introduction
该方法为小鼠受精卵透明带的渗透性提供了详细的指导, 使胚胎细胞可通过慢病毒进行基因传递。lent主义病毒是自然为有效地将基因传递给哺乳动物细胞而设计的。它们感染分裂和非分裂细胞, 并将慢病毒基因组整合到它们的宿主染色体1中。由于 vsv-g 蛋白2的广泛取向, 通过假型重组慢病毒与泡状口腔炎病毒糖蛋白 (vsv-g) 的分析, 使慢病毒宿主细胞的范围易于扩大。在转导之后, 慢病毒基因被稳定地整合和表达, 作为其宿主染色体的一部分, 创造了一个理想的工具, 产生转基因动物。如果传递给早期胚胎细胞, 慢病毒基因组被复制并在整个生物体中表达。慢病毒转导导致小鼠、大鼠、鸡、鹌鹑和猪3、4、5、6、7种转基因生物的产生。然而, 典型的慢病毒基因传递方法需要熟练的技术人员和专门的设备来克服包裹早期胚胎的透明带屏障。这种方法的总体目标是描述如何渗透带状疱疹使用激光, 以促进慢病毒基因的传递。
哺乳动物卵被透明带包围, 在受精后使其变硬, 以保护受精卵免受多精子的侵害, 并限制环境相互作用8,9。带形成了一个屏障, 使小病毒远离胚胎细胞, 直到胚胎孵化成囊胚。培养的小鼠受精卵在4天后孵化, 必须在孵化前植入假性小鼠体内, 才能正常发育到幼崽体内。因此, 对于转导, 慢病毒在孵化前从带状疱疹进入玻璃体周围腔, 即带状疱疹和胚胎细胞之间的空间。
透明带经常被去除用于人体卵子的体外受精, 以提高受精率10。然而, 清除小鼠透明带的化学作用对小鼠胚胎发育产生不利影响, 对胚胎细胞11,12 是有害的。其他将基因传递给小鼠受精卵的方法通过直接向细胞核13注入 dna 来克服透明带屏障.核微注射是将基因传递给胚胎的有效手段。然而, 由于每个胚胎都是单独固定的微注射, 这种做法对新手来说可能是费力和耗时的。
其他方法, 如电穿孔和光着色是有用的瞬态和短期基因传递到小鼠受精卵14,15,16。这些方法被广泛用于提供 crispr-cas9 组件和重组。然而, 基因的电穿孔和光化传递不能有效地用于创造转基因。从被刺破的小鼠附附虫中采集的精子也可以被慢病毒诱导, 并用于体外受精, 以产生转基因动物17,18,19, 20岁。
在该协议中, 利用激光渗透带的光病毒基因传递到小鼠胚胎。开发了 xyclone 激光, 用于体外受精21和胚胎干细胞22的培养。它是一个小的设备, 设置简单, 易于使用。一旦安装在显微镜上, 它就占据了物镜的空间, 随附的软件允许在透过显微镜目镜观察的同时瞄准激光 (见协议: 第3节)。一旦带状疱疹被 xyclone 激光射孔, 就可以将慢病毒引入基因传递的培养基23。多种慢病毒可用于同时传递多个基因的染色体整合。
该协议将描述如何分离和培养小鼠受精卵, 说明激光用于透明带穿孔, 并演示小鼠胚胎细胞的转导由慢病毒。
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Protocol
该议定书中使用的所有动物程序和治疗方法都符合 nih/niehs 动物护理准则, 并得到 NIH/NIEHS 动物护理和使用委员会 (acuc) 的批准, 《2010-0004 动物议定书》。
1. 准备工作
- 购买具有兴趣基因的重组非繁殖慢病毒。本研究采用 lentivirus SBI511 表达科普足绿色荧光蛋白 (copgfp; 简称 gfp) 的伸长因子1a 启动子进行了透射。标准协议 2用于在每毫升 (tu/ml) 的滴度高于1e8 转运单位时产生和滴度慢病毒。
注: 请谨慎使用, 并漂白所有接触过慢病毒的材料。请参阅贵研究所关于安全使用和处理慢病毒的指南。 - 在收获胚胎的前一天培养对所需的小鼠菌株。本实验采用 c57bl/6j 菌株的小鼠。用于卵巢和输卵管采集的雌性小鼠没有接受任何激素的超排卵治疗。
- 在收获小鼠受精卵前 2-24小时, 准备几个简单钾优化介质 24 (ksom) 滴板, 如下所示: 在35毫米组织培养处理的盘子中间加入50μl 滴克 som.二甲基聚硅氧烷 (dmps5x), 并放置在37°c、5% co 2、5% o2 和 90% n2 以平衡.
注: 使用一次性无菌板, 并在接触慢病毒后丢弃。 - 从库存溶液 (100x, 30 mg/ml, 储存在-20°c) 中制备 m2 介质中的1x 透明质酸酶溶液。在水中制备了100x 库存溶液。
- 24小时激光辅助小鼠受精卵的传导, 在输精管切除的雄性和雌性小鼠之间建立繁殖对, 制备假选择性雌性小鼠。
2. 小鼠受精卵的分离
- 16–24小时交配后, 选择女性小鼠阴道插头表明成功交配和人道安乐死 25.本研究中使用的小鼠在深 co2 或异氟醚吸入下, 采用颈椎脱位对其进行安乐死。
- 根据标准协议25分离卵巢和输卵管。
- 将卵巢和输卵管转移到含有 m2 培养基的35毫米盘子中。
- 对于每个卵巢, 撕开壶腹, 释放被积液细胞包围的受精卵。
- 将受精卵和积云细胞转移到一个35毫米的盘中, 在 m2 培养基中含有1x 透明质酸酶, 并在室温下孵育3-5分钟。
- 移液体上下受精, 释放积云细胞。
- 将受精卵转移到一个35毫米的盘子里, 里面含有 m2 培养基和上上下下的移液, 以洗掉透明质酸酶。
- 将受精卵转移到一个35毫米的含有 ksom 的盘子里, 上下移植物, 以洗掉剩余的 m2 培养基和透明质酸酶。
- 将受精卵从步骤1.3 转移到准备好的 ksom 落板。
注: ksom 中的小鼠受精卵必须保存在37°c、5% co2、5% o2 和 90% n2的组织培养孵化器中才能平衡。从孵化器中取出钢板超过15分钟将导致胚胎受损。 - 在进入下一步之前, 让受精卵在孵化器中恢复2小时。
3. 用 xyclone 激光对小鼠受精卵的穿孔
- 根据制造商的建议安装和校准 xyclone 激光器。其他激光, 通常用于体外受精, 可以取代 xyclone 激光射孔受精卵。
- 将激光控制器盒线连接到显微镜上的激光设备上。
- 通过 usb 端口将激光控制器盒连接到运行激光软件的计算机。3.1.3. 插入激光控制器并将其打开。
- 透过目镜, 打孔测试样品 (例如, 玻璃滑梯上的干擦除标记)。
- 使用一个小螺丝刀 (包含在激光套件中) 来调整激光的 x 和 y 位置, 以匹配通过显微镜目镜可见的 led 光, 并校准激光。
- 将含有小鼠受精卵的 ksom 滴板放置在显微镜下。不要将盘子放在孵化器外超过15分钟。
- 通过显微镜目镜观察, 确保胚胎的透明带聚焦, 激光 led 光能可见。
- 用 led 光激光将显微镜的舞台移动到瞄准带的位置。
- 使用计算机软件将 xyclone 激光设置为250μs。
- 将 led 灯尺寸调整到所需尺寸 (在此实验中设置 5)。
- 用激光三次射孔每个受精卵的带。带可以被刺穿或变薄。使用上述设置, 激光将产生直径为10μm 的孔 (图 2)。
注: 瞄准靠近极体, 使激光远离胚胎细胞。 - 在进入下一步之前, 允许受精卵在组织培养孵化器中恢复2小时。
4. 氧克隆激光穿孔后小鼠受精卵的诱导
- 将浓缩慢病毒 (大于 1e8 tuml 滴度) 的吡格为 2μl, 进入 50μl ksom 滴。不要上下移管。受精卵很容易附着在移液器的顶端。根据我们的经验, 在小于3μl 的体积中诱导的慢病毒1e5-55 转移单位是最佳的基因传递单位。
- 允许受精卵在孵化器中发育为囊胚4天。不需要改变媒体。
5. 小鼠胚胎向假性妊娠小鼠的非手术转移
- 使用假小鼠, 交配后3.5 天, 在步骤1.5 中准备。
- 使用非手术胚胎移植 (nset) 装置将小鼠胚胎植入假性小鼠体内。
- 使用手术或解剖显微镜, 插入阴道镜片, 以可视化子宫颈。
- 将非手术胚胎移植 (nset) 装置插入子宫颈约5毫米, 并将胚胎沉积在大约2μl 的体积中。
注: 无菌 nset 设备用于每次传输, 并在手术后丢弃。所有用于操作胚胎的试剂都必须是无菌的。
- 在每只伪多动鼠体内转移10–15种健康囊胚, 在 ksom 的2μl 体积中转移。
- 继续监测和测量假小鼠在随后几天的体重增加, 以确定 nset 是否成功。
- 在胚胎移植26天后, 通过让怀孕的老鼠自然分娩或进行剖腹产来恢复幼崽.如果很少有胚胎存在, 而且它们生长得太大, 无法自然出生, 那么剖腹产往往是必要的。
- 收集幼崽的组织进行基因分型, 以确定转基因的速度 27.
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Representative Results
每天可在显微镜下检查分离/转染小鼠受精卵的发育情况 (图 1)。健康的胚胎在3-4天内发育成囊胚。在该协议中, 60-70% 未经处理的胚胎发育成囊胚 23.在114个激光穿孔的经导胚胎中, 54个发育为囊胚 (率为 47%), 46个囊胚表达 gfp (46/54 = 85%)23。
小鼠胚胎在收获当天被激光穿孔。激光处理的最佳设置是每个受精卵3洞和250毫秒, 激光的目的应该是使带束变薄, 而不是形成一个洞 (图 2)。这使得发育中的胚胎受益于一个完整的封装透明带透明带, 同时成为许可的慢病毒转导。在这些实验中, 小鼠胚胎被转化为重组小病毒, 表达了从伸长因子1a 启动子的 copepod gfp (简称 gfp)。在转导方面, 将 2 ul 的慢病毒引入培养基中。增加病毒的数量, 直接影响了表达 gfp 的诱导胚胎的数量, 同时对胚胎发育进入囊胚23产生了不利影响。大于 ksom 下降体积10% 的病毒量也会对囊胚的形成产生不利影响 (例如, 在 50μl ksom 下降中大于5μl 的病毒)。
为了验证其可行性, 将被诱导的小鼠胚胎非手术转移到假性小鼠身上。6个独立的 nset 事件, 共转移58个囊胚, 导致 9个 gfp 转基因幼崽的总数 12, 产生75% 的转基因率23。据报道, nset 协议的产率为 30-35,为28例, 而我们的实验 (12/58) 中观察到的产量为21%。慢病毒治疗可能在胚胎发育中发挥了作用, 并导致胚胎移植率较低。在蓝色 led 灯 (465-470 纳米) 下, 具有多个慢病毒整合和 gfp 高表达的小狗在视觉上是绿色的 (图 3)。纳入 gfp 的数量从0-6 拷贝不等, 通过对从小狗组织中分离出的染色体 dna 进行定性 pcr 检测, 样本为23。
图 1: 诱导小鼠受肥卵在培养中的发展.c57bl/6j 小鼠受精卵在第0天 (收获的受精卵)、第1天 (双细胞)、第2天 (8-16 细胞)、第3天 (莫鲁拉) 和第4天 (囊胚) 进行了监测。胚胎是用携带 gfp 基因的慢病毒转化的。在第2-3 天开始, 经诱导的胚胎中荧光的存在变得明显。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 小鼠受肥卵的激光处理.射孔带产生孔与带变薄的例子。
图 3: 表达 gfp 的转基因小鼠.黑暗读取器 (dr 点灯, DRSL-9S) 被用来可视化 gfp 阳性幼崽在黑暗的环境中。在该组中加入了非转基因控制幼崽进行对比。生成的幼崽 (红色箭头) 是基因分型的, 含有0-6 拷贝的慢病毒基因/gfp。
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Discussion
慢病毒整合到宿主基因组中的能力使它们成为稳定基因传递的理想载体。慢病毒载体最多可以携带8.5 千卡的遗传物质, 这些遗传物质可以容纳特定细胞或诱导的启动子、选择标记或荧光分子。包含的基因组材料可以作为其宿主基因组的一部分进行复制, 并在所需的时间点进行调节以表达或停用。这些载体允许在不同的发展阶段对基因表达进行时空控制, 并将 lentiviruses 品牌作为基因传递的有力工具。
激光辅助慢病毒转染是一种有效且易于使用的基因在体内表达的方法。该方法可用于体内蛋白质的产生、基因编码指标的表达或功能研究。与其他方法相比, 激光辅助慢病毒基因的传递与原核微注射一样有效, 但不需要技术技能或昂贵的微注射工作站。xyclone 激光器体积小, 便于携带, 可在多个实验室之间轻松共享。
激光辅助慢病毒基因传递是稳定的, 而不是瞬态的, 如在电泳或感化卵子的光化。瞬态基因传递对于 crispr-cas9 成分的传递或重组是更多的优势, 因为扩展表达可能导致异常后果。在该协议中, 缺乏整合酶的慢病毒 (idlv) 可以替代小鼠受精卵的瞬态转导。idlv 保留慢病毒的传染性, 但只保留慢病毒29的一小部分 (小于 8%) 的整合能力。激光辅助慢病毒转染是一个额外的基因传递选项, 供用户根据他们想要的结果进行评估。
慢病毒转导的主要缺点是随机插入所传递的基因。另外, 同一胚胎内的细胞可以容纳多个慢病毒整合, 从而导致转基因中的马赛克。后代的基因分型和多轮有计划的繁殖是建立单一位点转基因动物所必需的。常规转基因方法也采用了类似的育种策略30。
该协议的一个关键步骤是花在激光射孔上的时间长度。在 ksom 中培养的小鼠受精卵不能在孵化器外停留超过15分钟。新手应将受精卵移动到 m2 培养基, 使用高级 ksom 胚胎培养基, 或限制每个盘子的胚胎数量。根据我们的结果, 47% 的转基因培养的小鼠受精卵发育成囊胚 23.因此, 每个板培养30-40 受精卵将确保在一个盘子中培养足够数量的被诱导囊胚, 以便转移到假性小鼠体内。
激光辅助穿孔的小鼠受精卵带也可能适用于其他物种的带, 并允许进入其他类型的病毒或转染试剂。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项研究得到了国家卫生研究所 (nih)、国家环境卫生科学研究所 (niehs) 内部研究方案的支持。我们感谢罗伯特·彼得罗维奇博士和杰森·威廉姆斯博士对手稿的批判性解读和有益的建议。我们还要感谢贝恩德·格洛斯博士、淘汰赛核心公司、流式细胞术设施、荧光显微镜和成像中心以及 niehs 比较医学处的设施所作的技术贡献。我们要感谢比较医学处的 david goulding 先生和 nihs 成像中心的 lois wyrick 女士为我们提供了照片和插图。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD510B-1 plasmid | System Biosciences | CD510B-1 | used to package the lentivirus expressing EF1a-copGFP |
| Dimethylpolysiloxane | Sigma | DMPS5X | culturing embryos |
| hyaluronidase | Sigma | H3506 | used to remove cumulus cells |
| XYClone Laser | Hamilton Thorne Biosciences | perforating mouse fertilized eggs | |
| Non-Surgical Embryo Transfer (NSET) Device | ParaTechs | 60010 | NSET of embryos |
| KSOM medium | Millipore | MR-020P-5F | culturing embryos |
| Composition of KSOM: | mg/100mL | ||
| NaCl | 555 | ||
| KCl | 18.5 | ||
| KH2PO4 | 4.75 | ||
| MgSO4 7H2O | 4.95 | ||
| CaCl2 2H2O | 25 | ||
| NaHCO3 | 210 | ||
| Glucose | 3.6 | ||
| Na-Pyruvate | 2.2 | ||
| DL-Lactic Acid, sodium salt | 0.174mL | ||
| 10 mM EDTA | 100µL | ||
| Streptomycin | 5 | ||
| Penicillin | 6.3 | ||
| 0.5% phenol red | 0.1mL | ||
| L-Glutamine | 14.6 | ||
| MEM Essential Amino Acids | 1mL | ||
| MEM Non-essential AA | 0.5mL | ||
| BSA | 100 | ||
| M2 medium | Millipore | MR-015-D | culturing embryos |
| Composition of M2: | mg/100mL | ||
| Calcium Chloride | 25.1 | ||
| Magnesium Sulfate (anhydrous) | 16.5 | ||
| Potassium Chloride | 35.6 | ||
| Potassium Phosphate, Monobasic | 16.2 | ||
| Sodium Bicarbonate | 35 | ||
| Sodium Chloride | 553.2 | ||
| Albumin, Bovine Fraction | 400 | ||
| D-Glucose | 100 | ||
| Na-HEPES | 54.3 | ||
| Phenol Red | 1.1 | ||
| Pyruvic Acid | 3.6 | ||
| DL-Lactic Acid | 295 |
References
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