Summary
Mouse de ovos fertilizados e embriões adiantados do palco são protegidos pela zona pelúcida, uma matriz de glicoproteína que forma uma barreira contra a entrega do gene. Este artigo descreve um protocolo para perfurar a zona com um laser para transduce células embrionárias com vetores Lentivirus e criar ratos transgénicos.
Abstract
Lentivírus são eficientes vetores para entrega de gene em células de mamíferos. Seguindo a transdução, o genoma de Lentivirus estàvel é incorporado ao cromossomo do hospedeiro e é passado para a descendência. Assim, eles são vetores ideais para a criação de linhas de célula estável, na vivo entrega dos indicadores e transdução de ovos única célula fertilizada para criar animais transgénicos. No entanto, rato fertilizado ovos e embriões adiantados do palco são protegidos pela zona pelúcida, uma matriz de glicoproteína que forma uma barreira contra a entrega do gene Lentivirus. Lentivírus são demasiado grandes para penetrar a zona e são tipicamente entregues pela microinjeção de partículas virais em cavidade perivitelline, o espaço entre a zona e as células embrionárias. O requisito para tecnólogos altamente qualificados e equipamentos especializados minimizou o uso do lentivírus para entrega de genes em embriões de rato. Este artigo descreve um protocolo para permeabilizing os ovos fertilizado de rato por perfurar a zona com um laser. Laser-perfuração não resulta em danos aos embriões e permite lentivírus ter acesso às células embrionárias para a entrega do gene. Transduzidas embriões podem desenvolver-se em blastocisto in vitro e se implantado em ratos pseudopregnant, evoluir para filhotes transgênicos. O laser utilizado neste protocolo é eficaz e fácil de usar. Genes, entregados por lentivírus estàvel incorporam em células embrionárias de rato e são transmissível germline. Este é um método alternativo para a criação de ratos transgênicos que requer sem micromanipulação e microinjeção de ovos fertilizados.
Introduction
Este método fornece instruções detalhadas para permeabilizing a zona pelúcida de ovos fertilizado de rato para tornar as células embrionárias acessível para a entrega do gene lentivírus. Lentivírus são projetados pela natureza para entrega eficiente de gene de células de mamíferos. Eles infectam células de divisão e não dividindo e integrarem o genoma de Lentivirus seu anfitrião cromossomos1. O intervalo de células hospedeiras Lentivirus prontamente é expandido por pseudotyping o lentivirus recombinante com a glicoproteína de vírus estomatite vesicular (VSV-G), devido a ampla tropismo do VSV-G proteínas2. Após transdução, Lentivirus genes são integrados estàvel e expressa como parte de seus cromossomos de acolhimento criando uma ferramenta ideal para a geração de animais transgênicos. Se entregue para células embrionárias de estágio inicial, o genoma Lentivirus é replicado e expresso em todo o organismo. Transdução de Lentivirus conduziu à produção de ratos, rato, galinha, codorna e porco3,4,5,6,7 , entre outras espécies de transgênicos. O método típico de entrega de Lentivirus gene, no entanto, requer técnicos especializados e equipamentos especializados para superar a barreira da zona pelúcida que encapsula os embriões adiantados do palco. O objectivo geral deste método é que descrevem como permeabilize a zona com um laser para facilitar a entrega de Lentivirus gene.
Ovos de mamíferos estão rodeados pela zona pelúcida que endurece após a fecundação para proteger os ovos fertilizados contra poliespermia e limitar a interacções ambientais8,9. A zona forma uma barreira que mantém os lentivírus longe as células embrionárias até que os embriões são incubados como um blastocisto. Mouse culta fertilizado ovos eclodem após 4 dias e deve ser implantado em ratos pseudopregnant antes da incubação para o desenvolvimento normal em filhotes. Portanto, para a transdução, lentivírus são injetadas antes da eclosão da zona em cavidade perivitelline, o espaço entre a zona e as células embrionárias.
Muitas vezes, a zona pelúcida é removida para fertilização " in vitro " de ovos humanos para aumentar a taxa de fertilização10. No entanto, a remoção química de rato zona pelúcida negativamente afeta o desenvolvimento do embrião de rato e é prejudicial para as células embrionárias11,12. Outros métodos para a entrega do gene de ovos fertilizado de rato superar a barreira da zona pelúcida pelo microinjection direto do DNA para a célula núcleo13. Microinjeção pró-nuclear é um meio eficiente de entregar genes para embriões. No entanto, desde que cada embrião é mantido no lugar individualmente para microinjeção, a prática pode ser trabalhoso e demorado para um usuário iniciante.
Outros métodos como electroporation e photoporation são úteis para transiente e a curto prazo entrega de gene de rato fertilizado ovos14,15,16. Esses métodos são usados extensivamente para a entrega de recombinases e CRISPR-Cas9 componentes. No entanto, eletroporação e photoporation entrega de genes não pode ser usada com eficiência para criar transgênicos. Espermatozoides, que são coletadas do epidídimo de rato perfurado também podem ser transformados por lentivírus e utilizados para fertilização in vitro , para produzir animais transgénicos17,18,19, 20.
Neste protocolo, a entrega do gene Lentivirus de embriões do rato é facilitada pela permeabilizing a zona usando um laser. O laser de XYClone foi desenvolvido como um auxílio para em vitro fertilização21 e cultivo de células-tronco embrionárias22. É um pequeno aparelho que é simples de configurar e fácil de usar. Uma vez instalado em um microscópio, que ocupa o espaço de uma lente objetiva e o software que acompanha permite apontar o laser ao olhar através da ocular do microscópio (Veja o protocolo: seção 3). Uma vez que a zona é perfurada pelo laser XYClone, lentivírus podem ser introduzidos o meio de cultura para gene entrega23. Lentivírus múltiplas poderiam ser usados para entregar simultaneamente vários genes para incorporação cromossômica.
Este protocolo irá descrever como isolar e cultura mouse fertilizado ovos, ilustra o uso do laser para perfuração da zona pelúcida e demonstra a transdução de células embrionárias de rato por lentivírus.
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Protocol
Todos os animais procedimentos e tratamentos utilizados neste protocolo estavam em conformidade com as orientações de cuidados com animais de NIH/NIEHS e foram aprovados pelo Animal Care e Comissão de utilização (ACUC) no NIH/NIEHS, Animal protocolo 2010-0004.
1. preparações
- Prepare-se compra e recombinação não-propagação lentivírus carreg o gene de interesse. Neste estudo, lentivirus SBI511 expressando a proteína fluorescente verde copépode (copGFP; abreviado para GFP) de um alongamento promotor de 1a fator foi usado para a transdução. Protocolos padrão2 foram usados para produzir e lentivírus título em títulos superiores 1e8 transducing unidades por mL (TU/mL).
Nota: Use cautela e branquear todo material que estiveram em contacto com lentivírus. Consulte as orientações do seu Instituto para a segurança de utilização e manipulação dos lentivírus. - Configuração de casais reprodutores da estirpe do mouse desejado no dia antes da colheita de embriões. Neste experimento, utilizou-se C57BL/6J cepa de ratos. Usado para os ovários e oviduto coleção de ratos fêmeas não foram tratados com qualquer hormônios para superovulação.
- 2 – 24 h antes da colheita de ovos fertilizado de rato, preparar vários pratos de gota potássio Simplex otimizado médio24 (KSOM) como segue: adicionar uma gota de 50 μL de meio KSOM no meio de um prato de cultura de tecidos tratados de 35 mm e tampa com 2 mL de Dimetilpolissiloxano (DMPS5X) e lugar na 37 oC, 5% de CO2, 5% O2 e 90% N2 para equilibrar.
Nota: Usar placas estéreis descartáveis e descartar após exposição ao lentivírus. - Preparar 1 x solução de hialuronidase médio/M2 da solução estoque (100 x, 30 mg/mL, armazenar a-20 ° C). 100 x solução estoque foi preparada em água.
- 24 h pós-laser-assisted transdução de ovos fertilizado de rato, configurar pares entre vasectomizado ratos machos e fêmeas para preparar pseudopregnant ratos fêmeas reprodutores.
2. isolamento do Mouse fertilizado ovos
- 16 – 24 h post de acasalamento, selecione ratos fêmeas com indicativo de acasalamento bem sucedido vaginal plugues e humanamente eutanásia em25. Os ratos utilizados neste estudo foram sacrificados por deslocamento cervical sob inspiração profunda CO2 ou isoflurano.
- Isole os ovários e ovidutos de acordo com protocolos padrão25.
- Transferi os ovários e ovidutos para um prato de 35 mm, contendo mídia M2.
- Para cada ovário, rasgar distante ampola para liberar ovos fertilizados, rodeados por células do cumulus.
- Transferência de ovos fertilizados e células cumulus para uma 35mm prato contendo hialuronidase de x 1 M2 médio e incubam a temperatura ambiente por 3 – 5 min.
- Pipeta fertilizado ovos acima e para baixo para liberar as células do cumulus.
- Transferi ovos fertilizados para um prato de 35 mm, contendo mídia M2 e pipeta para cima e para baixo lave a hialuronidase.
- Transferi ovos fertilizados para um prato de 35 mm, contendo KSOM e pipetar acima e para baixo para lavar fora os restantes meios de M2 e hialuronidase.
- Transferi ovos fertilizados para as placas preparadas de gota KSOM da etapa 1.3.
Nota: Ovos fertilizado de rato em KSOM devem ser mantidos em uma incubadora de cultura de tecidos em 37 ° C, 5% de CO2, 5% O2 e 90% N2 para equilibrar. Retirar as placas da incubadora por mais de 15 min irá resultar em danos aos embriões. - Permitir que os ovos fertilizados recuperar por 2 h na incubadora antes de passar para a próxima etapa.
3. perfuração de Mouse fertilizado ovos com XYClone Laser
- Configurar e calibrar XYClone do laser de acordo com a recomendação do fabricante. Outros lasers, normalmente utilizados para fertilização in vitro , podem ser substituídos por XYClone laser para perfurar ovos fertilizados.
- Conecte o cabo de caixa de controlador do laser para o aparelho de laser no microscópio.
- Fixe a caixa do controlador do laser para o computador que está executando o software do laser através de uma porta USB. 3.1.3. Conecte o controlador do laser e ligá-lo.
- Olhar através da ocular, perfure uma amostra de teste (por exemplo, marcações de tinta lavável sobre uma lâmina de vidro).
- Use uma chave de fenda pequena (incluído no kit do laser) para ajustar o X e Y posição do laser para coincidir com o LED de luz visível através da ocular do microscópio e calibrar o laser.
- Coloque uma placa de gota KSOM contendo ovos fertilizado de rato no palco microscópio. Não fique com o prato fora da incubadora por mais de 15 min.
- Olhe através da ocular do microscópio e garantir pelúcida do embrião em foco e o laser de diodo emissor de luz é visível.
- Mova o estágio de microscópio para atingir a zona com o luz do LED/laser.
- Usar o software de computador conjunto do laser XYClone para 250 μs.
- Ajuste o tamanho de luz LED para dimensões desejadas (configuração 5 neste experimento).
- Perfure a zona de cada óvulo fertilizado três vezes com o laser. A zona pode ser perfurado ou diluído. Usando as configurações acima, o laser irá produzir um buraco com um diâmetro de 10 μm (Figura 2).
Nota: Visando perto do corpo polar mantém laser longe da célula embrionária. - Permitir que os ovos fertilizados recuperar por 2 h na incubadora de cultura de tecidos antes de passar para a próxima etapa.
4. transdução de Mouse fertilizado ovos após perfuração de Laser XYClone
- Pipetar 2 μL de concentrado lentivirus (maior do que o título de 1e8 TU/mL) à gota KSOM 50 μL. Fazer não Pipetar para cima e para baixo. Ovos fertilizados prontamente anexar para a ponta da pipeta. Baseado em nossa experiência, 1e5-5e5 transducing unidades de lentivirus em um volume menor que 3 μL é ideal para a entrega do gene.
- Permitir que os ovos fertilizados desenvolver-se em blastocisto para 4 dias na incubadora. Nenhuma necessidade de mudar os meios de comunicação.
5. não-cirúrgico transferência de embriões do rato transduzidas aos ratos pseudo grávidas
- Use pseudopregnant ratos, 3,5 dia após o acasalamento, preparado na etapa 1.5.
- Utilize o dispositivo de transferência de embriões não-cirúrgico (NSET) para implantar embriões de rato em ratos pseudopregnant.
- Usando um microscópio cirúrgico ou dissecação, inserir um espéculo vaginal para visualizar o colo do útero.
- Insira o dispositivo de transferência de embrião não-cirúrgico (NSET) aproximadamente 5 mm no colo do útero e depósito de embriões em um volume de aproximadamente 2 μL.
Nota: Um dispositivo NSET estéril é usado para cada transferência e descartado após o procedimento. Todos os reagentes utilizados na manipulação de embriões devem ser estéril.
- Transferi os blastocistos saudável de 10 – 15 no volume 2 μL KSOM para cada pseudopregnant ratos.
- Continue a monitorar e medir o ganho de peso em camundongos pseudopregnant nos dias seguintes para determinar se a NSET foi bem-sucedida.
- Recupere filhotes, permitindo que os ratos grávidos a dar à luz naturalmente ou a realização de uma cesariana 17 dias depois que o embrião transferir26. Uma cesariana é frequentemente necessária se muito poucos embriões estão presentes e crescem muito grandes para o parto natural.
- Colete tecido de filhotes para genotipagem determinar a taxa de transgênese27.
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Representative Results
Desenvolvimento de ovos de rato isolado/transfectadas fertilizado pode ser verificado ao microscópio diariamente (Figura 1). Os embriões saudáveis desenvolvem-se em blastocisto dentro de 3-4 dias. Neste protocolo, 60-70% dos embriões não tratados desenvolvem-se em blastocisto23. Fora 114 embriões transduzidos laser-perfurados, 54 desenvolveu-se em blastocisto (taxa de 47%) e 46 blastocistos expressaram GFP (46/54 = 85%)23.
Os embriões de rato foram perfurados do laser no dia da colheita. A configuração ideal para o tratamento do laser foi 3 furos por ovo fertilizado e 250 MS. O laser deve destinar-se a fina a zona em vez de criar um buraco (Figura 2). Isto permite o desenvolvimento de embriões beneficiar uma pelúcida intacta encapsular enquanto se tornando permissiva de Lentivirus transdução. Nesses experimentos, embriões de rato foram transformados com um lentivirus recombinante que expressa copépode GFP (abreviado GFP) de um promotor de 1a do factor de alongamento. Para transdução, 2 uL de lentivirus foi introduzido os meios de cultura. Aumentando a quantidade de vírus, diretamente afetado o número de embriões transduzidos que expressa GFP enquanto adversamente afetar o desenvolvimento do embrião em blastocisto23. Virais volumes superiores a 10% do volume de gota KSOM também prejudicar formação de blastocisto (por exemplo, maior que 5 μL de vírus em uma gota KSOM 50 μL).
Para validar a viabilidade, embriões do rato transduzidas não cirurgicamente foram transferidos para os ratos pseudopregnant. Seis NSET eventos separados, transferir um total de 58 blastocisto, resultou em 9 filhotes de transgênico GFP de total de 12, rendendo a taxa de 75% de transgênese 23. O protocolo NSET é relatado para produzir 30-35% de nados-vivos28 em comparação com 21% de rendimento que foram observadas em nossos experimentos (12/58). O tratamento Lentivirus pode ter desempenhado um papel no desenvolvimento do embrião e contribuiu para a taxa de transferência de embriões de baixa. Filhotes com múltiplas integrações Lentivirus e alta expressão de GFP foram visualmente verdes sob uma lâmpada de LED azul (465-470 nm) (Figura 3). O número de cópias GFP incorporados variou de 0-6 cópias e foi determinada por meio de PCR qualitativo isolado DNA cromossômico de filhote tecido23.
Figura 1: desenvolvimento de Mouse Transduzido fertilizado ovos na cultura. Os ovos fertilizado de rato de C57BL/6J foram monitorados no dia 0 (colhido óvulo fecundado), 1 dia (duas câmaras), dia 2 (8-16 células), dia 3 (mórula) e dia 4 (blastocisto). Os embriões foram transformados com um lentivirus carreg um gene da GFP. Presença de fluorescência em embriões transduzidas tornou-se evidente por dia 2-3. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2:-tratamento com Laser do Mouse fertilizado ovos. Exemplos de perfurar a zona para produzir um buraco vs afinamento da zona.
Figura 3: ratos transgênicos expressando GFP. Leitor escuro (DR Spot lâmpada, DRSL-9S) foi usado para visualizar filhotes positivos de GFP em um ambiente escuro. Filhotes de controle não-transgênicas foram adicionados ao grupo de contraste. Filhotes resultantes (setas vermelhas) foram genótipo e contido entre 0-6 cópias do gene Lentivirus/GFP.
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Discussion
A capacidade dos lentivírus para integrar o seu genoma hospedeiro torna um vetor ideal para a entrega do gene estável. Vetores de Lentivirus podem transportar até 8,5 mil par (kbp) de material genético que pode acomodar células específicas ou inducible promotores, marcadores de seleção ou partes fluorescentes. Material genómico incorporado pode replicar como parte de seu genoma do hospedeiro e ser regulamentado para expressar ou desactivar em pontos de tempo desejado. Estes vetores permitem spatiotemporal controle sobre a expressão gênica em vários estágios de desenvolvimento e lentivírus de marca como poderosas ferramentas para a entrega do gene.
Transgênese Lentivirus assistida por laser é um método eficaz e fácil de usar para gene expressão na vivo. Esse método pode ser usado na vivo produção de proteína, expressão de indicadores geneticamente codificados, ou estudos funcionais. Em comparação com outros métodos, entrega de gene de Lentivirus assistida por laser é tão eficaz quanto microinjeção pró-nuclear mas não requer habilidades técnicas ou estações de trabalho caro microinjeção. O laser XYClone é pequeno, portátil e podem ser facilmente compartilhados entre vários laboratórios.
Entrega do gene de Lentivirus assistida por laser é estável e não transitórios, como electroporation ou photoporation de ovos fertilizados. Entrega do gene transiente é mais vantagens para a entrega de componentes CRISPR-Cas9 ou recombinases desde expressão prolongada pode levar a consequências aberrantes. Neste protocolo, os integrase deficiente lentivírus (IDLVs) podem ser substituídos por transdução transiente de ovos fertilizado de rato. IDLVs reter particulas de Lentivirus infecciosidade mas reter apenas uma fração (menos de 8%) capacidade Integrativa dos lentivírus29. Transgênese Lentivirus assistida por laser é uma opção de entrega do gene adicional para os usuários a avaliar com base no seu resultado desejado.
A principal desvantagem de Lentivirus transdução é a inserção aleatória do gene entregue. Também, as células dentro do mesmo embrião podem hospedar várias integrações de Lentivirus que conduz ao mosaicismo nos transgênicos. Genotipagem de progenitura e várias rodadas de reprodução planejada são necessárias estabelecer um animal transgénico único locus. Estratégias de reprodução similares também são empregadas em transgênese convencionais métodos30.
Um passo crítico no presente protocolo é o comprimento de tempo gasto na perfuração do laser. Ovos fertilizado de rato cultivados em KSOM não podem ser mantidos fora da incubadora por mais de 15 min. Um usuário novato deve mover os ovos fertilizados para M2 médio, use Advanced KSOM embrião médio ou limitar o número de embriões por placa. De acordo com nosso resultado, 47% dos ovos transduzidas rato culta fertilizado desenvolvem em blastocistos23. Portanto, 30-40 ovos fertilizados por placa de cultivo irá garantir o número adequado de blastocistos transduzidos em um prato para transferência em ratos pseudopregnant.
Assistida por laser de perfuração da zona de ovo fertilizado de rato pode também ser aplicável para a zona de outras espécies e permitir a entrada de outros tipos de vírus ou reagentes de transfecção.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi apoiada pelo programa de pesquisa Intramural do Instituto Nacional de saúde (NIH), National Institute de Ciências de saúde ambiental (NIEHS). Nós estamos gratos ao Dr. Robert Petrovich e Dr. Jason Williams para leitura crítica do manuscrito e conselhos úteis. Também gostaríamos de reconhecer e agradecer o Dr. Bernd Gloss, o núcleo de nocaute, a facilidade de citometria de fluxo, a microscopia de fluorescência e centro de imagem e as instalações da filial de medicina comparativa do NIEHS por suas contribuições técnicas. Gostaríamos de agradecer o Sr. David Goulding do ramo de medicina comparativa e MS. Lois Wyrick do centro de imagem no NIEHS para fornecer-nos com fotografias e ilustrações.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD510B-1 plasmid | System Biosciences | CD510B-1 | used to package the lentivirus expressing EF1a-copGFP |
| Dimethylpolysiloxane | Sigma | DMPS5X | culturing embryos |
| hyaluronidase | Sigma | H3506 | used to remove cumulus cells |
| XYClone Laser | Hamilton Thorne Biosciences | perforating mouse fertilized eggs | |
| Non-Surgical Embryo Transfer (NSET) Device | ParaTechs | 60010 | NSET of embryos |
| KSOM medium | Millipore | MR-020P-5F | culturing embryos |
| Composition of KSOM: | mg/100mL | ||
| NaCl | 555 | ||
| KCl | 18.5 | ||
| KH2PO4 | 4.75 | ||
| MgSO4 7H2O | 4.95 | ||
| CaCl2 2H2O | 25 | ||
| NaHCO3 | 210 | ||
| Glucose | 3.6 | ||
| Na-Pyruvate | 2.2 | ||
| DL-Lactic Acid, sodium salt | 0.174mL | ||
| 10 mM EDTA | 100µL | ||
| Streptomycin | 5 | ||
| Penicillin | 6.3 | ||
| 0.5% phenol red | 0.1mL | ||
| L-Glutamine | 14.6 | ||
| MEM Essential Amino Acids | 1mL | ||
| MEM Non-essential AA | 0.5mL | ||
| BSA | 100 | ||
| M2 medium | Millipore | MR-015-D | culturing embryos |
| Composition of M2: | mg/100mL | ||
| Calcium Chloride | 25.1 | ||
| Magnesium Sulfate (anhydrous) | 16.5 | ||
| Potassium Chloride | 35.6 | ||
| Potassium Phosphate, Monobasic | 16.2 | ||
| Sodium Bicarbonate | 35 | ||
| Sodium Chloride | 553.2 | ||
| Albumin, Bovine Fraction | 400 | ||
| D-Glucose | 100 | ||
| Na-HEPES | 54.3 | ||
| Phenol Red | 1.1 | ||
| Pyruvic Acid | 3.6 | ||
| DL-Lactic Acid | 295 |
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