Summary
Mus befrugtede æg og tidlige fase embryoner er beskyttet af zona pellucida, et glykoprotein matrix, der danner en barriere mod gen levering. I denne artikel beskrives en protokol for perforering af zona med en laser transduce embryonale celler med lentiviral vektorer og skabe Transgene mus.
Abstract
Lentiviruses er effektive vektorer genet leveres til pattedyrsceller. Efter transduktion, den lentiviral genom er stabilt indarbejdet i host-kromosom og videregives til afkom. De er derfor ideelle vektorer for oprettelsen af stabile cellelinjer, i vivo levering af indikatorer og transduktion af enkelt celle befrugtede æg til at skabe transgene dyr. Men musen befrugtet æg og tidlige fase embryoner er beskyttet af zona pellucida, et glykoprotein matrix, der danner en barriere mod lentiviral gen levering. Lentiviruses er for stort til at trænge ind i zona og leveres typisk ved mikroinjektion af virale partikler i perivitelline hulrum, afstanden mellem zona og embryonale celler. Kravet om, at højt kvalificerede teknikere og specialiseret udstyr har minimeret brugen af lentiviruses til gen levering til musen embryoner. I denne artikel beskrives en protokol for permeabilizing mus befrugtede æg ved perforering af zona med en laser. Laser-perforering medfører ikke nogen skade til embryoner og tillader lentiviruses at få adgang til embryonale celler til gen levering. Transduced embryoner kan udvikle sig til blastocyst in vitro og hvis implanteret i pseudopregnant mus, udvikle sig til transgene unger. Laser bruges i denne protokol er effektiv og nem at bruge. Gener leveret af lentiviruses stabilt indarbejde mus embryonale celler og er kønscelleoverførsel smitsomme. Dette er en alternativ metode til oprettelse af Transgene mus, der kræver ingen micromanipulation og mikroinjektion af befrugtede æg.
Introduction
Denne metode giver detaljerede instruktioner for permeabilizing zona pellucida mus befrugtede æg at gøre embryonale celler tilgængelige til gen levering af lentiviruses. Lentiviruses er designet af naturen for effektiv gen levering til pattedyrsceller. De inficerer delende og ikke-dividere celler og integrere den lentiviral genom i deres vært kromosomer1. Lentiviral vært celleområdet er let udvidet med pseudotyping den rekombinante lentivirus med vesikulær stomatitis-virus glycoprotein (VSV-G), på grund af den brede tropisme VSV-G protein2. Efter transduktion, lentiviral gener er stabilt integreret og udtrykt som en del af deres vært kromosomer skaber et ideelt værktøj til generering af transgene dyr. Hvis leveret til tidlige fase embryonale celler, er det lentiviral genom replikeret og udtrykt i hele organismen. Lentiviral transduktion har ført til produktion af mus, rotter, kylling, vagtel og gris3,4,5,6,7 blandt andre arter af transgenics. Den typiske lentiviral gen levering, dog kræver dygtige teknikere og specialudstyr til at overvinde den zona pellucida barriere, der indkapsler de tidlige fase embryoner. Det overordnede mål med denne metode er at beskrive hvordan man permeabilize zona bruger en laser til at lette lentiviral gen levering.
Pattedyr æg er omgivet af zona pellucida, der hærder efter befrugtning at beskytte de befrugtede æg mod polyspermy og begrænse miljøvekselvirkninger8,9. Zona danner en barriere, der holder lentiviruses væk fra embryonale celler, indtil embryonerne er udklækket som en blastocyst. Kulturperler mus befrugtede æg klækkes efter 4 dage og skal implanteres i pseudopregnant mus før klækning til normale udvikling i hvalpe. Derfor, for transduktion, lentiviruses er microinjected før klækning fra zona i perivitelline hulrum, afstanden mellem zona og embryonale celler.
Zona pellucida er ofte fjernet for in vitro- befrugtning af menneskelige æg til at øge befrugtning af10. Men kemisk fjernelse af musen zona pellucida negativt påvirker mus embryo udvikling og er skadeligt for embryonale celler11,12. Andre metoder til gen levering til musen befrugtede æg overvinde zona pellucida barriere ved direkte mikroinjektion af DNA i cellen kernen13. Pronuclear mikroinjektion er et effektivt middel til at levere gener til embryoner. Da hver embryo er holdt på plads individuelt for mikroinjektion, kan praksis kan være besværlige og tidskrævende for en novice-bruger.
Andre metoder såsom elektroporation og photoporation er nyttige for flygtig og kortvarig gen levering til musen befrugtede æg14,15,16. Disse metoder er flittigt brugt til at levere CRISPR-Cas9 komponenter og recombinases. Dog anvendes ikke elektroporation og photoporation levering af gener effektivt til at oprette transgenics. Sædcellerne, der er indsamlet fra punkteret mus epididymis kan også transduced af lentiviruses og anvendes til in vitro- befrugtning til at producere transgene dyr17,18,19, 20.
I denne protokol lettes lentiviral gen levering til musen embryoner ved permeabilizing zona ved hjælp af en laser. XYClone laser blev udviklet som en hjælp til in vitro- befrugtning21 og dyrkning af embryonale stamceller22. Det er et lille apparat, der er nem at setup og nem at bruge. Når først installeret på et mikroskop, det optager plads i et mål linse og den medfølgende software giver mulighed for sigter laser mens du kigger gennem mikroskop okularer (Se protokollen: afsnit 3). Når zona er perforeret af XYClone laser, kan lentiviruses indføres i Kulturmedier til gen levering23. Flere lentiviruses kan bruges samtidigt levere flere gener for kromosomale indarbejdelse.
Denne protokol vil beskrive hvordan man isolere og kultur mus befrugtede æg, illustrerer brugen af laser for perforering af zona pellucida og demonstrerer transduktion af musen embryonale celler ved lentiviruses.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyr procedurer og behandlinger anvendes i denne protokol var i overensstemmelse med retningslinjerne NIH/NIEHS dyrs pleje og blev godkendt af dyrs pleje og brug udvalg (ACUC) på NIH/NIEHS, Animal protokol 2010-0004.
1. præparater
- Forberede/Køb rekombinant ikke formerings lentiviruses transporterer din gen af interesse. I denne undersøgelse, lentivirus SBI511 udtrykker copepod grøn fluorescerende proteiner (copGFP; forkortet til normal god landbrugspraksis) fra en brudforlængelse faktor 1a promotor blev brugt til transduktion. Standardprotokoller2 blev brugt til at producere og titer lentiviruses på titers højere end 1e8 transducing enheder pr. mL (TU/mL).
Bemærk: Vær forsigtig og blegemiddel alt materiale, der har været i kontakt med lentiviruses. Henvise til din institute's retningslinjer for sikker brug og håndtering af lentiviruses. - Opsætning af ynglende par af ønskede mus stamme dagen før høst embryoner. I dette eksperiment, blev C57BL/6J stamme af mus brugt. Hunmus bruges til æggestokkene og oviduct samling blev ikke behandlet med nogen hormoner til superovulation.
- 2 – 24 h før høst mus befrugtede æg, forberede flere kalium Simplex optimeret Medium24 (KSOM) drop plader som følger: tilføje en 50 μL dråbe KSOM medium til midten af en 35 mm vævskultur-behandlede skål og dække med 2 mL Dimethylpolysiloxan (DMPS5X) og sted på 37 oC, 5% CO2, 5% O2 og 90% N2 til Reagensglasset.
Bemærk: Brug engangs sterile plader og kassér efter udsættelse for lentiviruses. - Forberede 1 x løsning af hyaluronidase i M2 medium fra stamopløsningen (100 x, 30 mg/mL, opbevares ved-20 ° C). 100 x stamopløsning blev udarbejdet i vand.
- 24 h post laser-assisteret transduktion af musen befrugtede æg, opsætning af ynglende par mellem vasectomized mandlige og kvindelige mus til at forberede pseudopregnant hunmus.
2. isolering af musen befrugtede æg
- 16-24 h post parring, Vælg hunmus med vaginal stik vejledende af vellykket parring og euthanize humant25. Musene brugt i denne undersøgelse blev aflivet af cervikal dislokation under dyb CO2 eller isofluran indånding.
- Isolere æggestokkene og æggelederne ifølge standardprotokoller25.
- Overføre æggestokkene og æggelederne til en 35 mm skål indeholdende M2 medier.
- Hver æggestok, rive ampulla fra hinanden for at frigive befrugtede æg omgivet af cumulus celler.
- Overføre befrugtede æg og cumulus celler til en 35 mm fad indeholdende 1 x hyaluronidase i M2 medium og inkuberes ved stuetemperatur i 3-5 min.
- Med pipette overfoeres befrugtet æg op og ned at frigive cumulus celler.
- Overføre befrugtede æg til en 35 mm skål indeholdende M2 medier og afpipetteres op og ned for at vaske af hyaluronidase.
- Overføre befrugtede æg til en 35 mm skål indeholdende KSOM og afpipetteres op og ned at vaske de resterende M2 medier og hyaluronidase.
- Overføre befrugtede æg til rede KSOM drop plader fra trin 1.3.
Bemærk: Mus befrugtet æg i KSOM skal holdes i en vævskultur inkubator ved 37 ° C, 5% CO2, 5% O2 og 90% N2 til Reagensglasset. At fjerne plader fra rugemaskinen i mere end 15 min vil medføre skade på embryoner. - Tillad befrugtede æg til at inddrive for 2 h i rugemaskinen før du flytter til det næste trin.
3. perforation af musen befrugtede æg med XYClone Laser
- Setup og kalibrere XYClone laser ifølge producentens anbefaling. Andre lasere, typisk anvendes til in vitro- befrugtning, kan erstattes XYClone laser at perforere befrugtede æg.
- Knytte laser controller box wire til laser apparatet på mikroskopet.
- Knytte laser controller box til den computer, der kører laser softwaren via en USB-port. 3.1.3. stik i laser-controlleren og tænd den.
- Ser man gennem okularet, perforere en proeve (f.eks. tør-slette markeringer på et glas dias).
- Bruge en lille skruetrækker (inkluderet i laser kit) til at justere X og Y position af laser til at matche LED lys synlige gennem mikroskop okular og kalibrere laser.
- Placer en KSOM drop pladen indeholdende mus befrugtede æg på stadiet mikroskop. Opbevar ikke plade uden for inkubator i mere end 15 min.
- Se gennem mikroskopet okular og sikre, at det embryon zona pellucida er i fokus og laser LED lys er synlig.
- Flytte stadiet mikroskop til at målrette zona med LED lys/laser.
- Ved hjælp af computersoftware indstillet XYClone laser til 250 μs.
- Justere størrelsen LED lys til ønskede dimensioner (indstilling 5 i dette eksperiment).
- Perforere zona af hvert befrugtet æg tre gange med laser. Zona kan være enten gennemboret eller fortyndet. Brug ovenstående indstillinger, vil laser producere et hul med en diameter på 10 μm (figur 2).
Bemærk: Sigte tæt på polar kroppen holder laser fra den embryonale celle. - Tillad befrugtede æg til at inddrive for 2 h i vævskultur inkubator før du flytter til det næste trin.
4. transduktion af musen befrugtede æg efter XYClone Laser Perforation
- Pipette 2 μl af koncentreret lentivirus (større end 1e8 TU/mL titer) i 50 μL KSOM drop. Gør ikke afpipetteres op og ned. Befrugtede æg tillægger let afpipetteres tip. Baseret på vores erfaringer, 1e5-5e5 transducing enheder af lentivirus i et volumen mindre end 3 μL er optimal for gen levering.
- Tillad befrugtede æg til at udvikle sig til blastocyst i 4 dage i væksthuset. Ingen grund til at ændre medierne.
5. ikke-kirurgiske overførsel af Transduced musen embryoner til pseudo gravide mus
- Bruge pseudopregnant mus, 3,5 dag efter parring, forberedt i trin 1,5.
- Brug ikke-kirurgisk Embryo Transfer (NSET) enhed til implantatet mus embryoner til pseudopregnant mus.
- Ved hjælp af en kirurgisk eller dissekere mikroskop, indsætte en vaginal speculum at visualisere livmoderhalsen.
- Indsætte ikke-kirurgisk Embryo Transfer (NSET) enhed ca 5 mm i livmoderhalsen og depositum embryoner i et volumen på ca. 2 μl.
Bemærk: En steril NSET enhed bruges til hver overførsel og kasseres efter indgrebet. Alle reagenser, der anvendes i manipulation af embryonerne skal være steril.
- Overfør 10 – 15 sund blastocyst i 2 μl volumen af KSOM til hver pseudopregnant mus.
- Fortsætte med at overvåge og måle vægtøgning i pseudopregnant mus i følgende dage til at afgøre, hvorvidt NSET er vellykket.
- Genoprette unger ved at tillade de gravide mus at føde naturligt eller udfører en kejsersnit 17 dage efter ægoplægningen26. En c-sektion er ofte nødvendige, hvis meget få embryoner er til stede, og de vokser for stor til naturlig fødsel.
- Indsamle væv fra unger for genotypebestemmelse at bestemme hastigheden af transgenese27.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Udvikling af isoleret/transduced mus befrugtede æg kan kontrolleres under mikroskop dagligt (figur 1). Sund embryoner udvikler sig til blastocyst inden for 3-4 dage. I denne protokol udvikler 60 – 70% af ubehandlet embryoner sig til blastocyst23. Ud af 114 laser-perforerede transduced embryoner, 54 udviklet i blastocyst (på 47%) og 46 blastocyster udtryk for normal god landbrugspraksis (46/54 = 85%)23.
Musen embryoner blev laser-perforeret på dagen for høsten. Den optimale indstilling for Laserbehandling var 3 huller pr befrugtede æg og 250 ms. laser bør rettes til tynde zona i stedet for at skabe et hul (figur 2). Dette giver mulighed for at udvikle embryoner til fordel fra en intakt indkapsling zona pellucida samtidig at blive eftergivende til lentiviral transduktion. I disse eksperimenter var mus embryoner transduced med en rekombinant lentivirus, der udtrykte copepod normal god landbrugspraksis (forkortet normal god landbrugspraksis) fra en brudforlængelse faktor 1a promotor. For transduktion, blev 2 uL af lentivirus indført i kultur medier. Øge mængden af virus, påvirket direkte antallet af transduced embryoner, der gav udtryk for normal god landbrugspraksis mens skade embryo udvikling i blastocyst23. Viral diskenheder større end 10% af KSOM drop ville også påvirke blastocyst dannelse (f.eks. større end 5 μl af virus i en 50 μL KSOM drop).
For at validere levedygtighed, overført transduced mus embryoner ikke-kirurgisk til pseudopregnant mus. Seks separate NSET begivenheder, overførsel af i alt 58 blastocyst, resulterede i 9 NGL transgene unger ud af i alt 12, giver 75% sats af transgenese 23. NSET protokol er rapporteret at give 30-35% levendefødte28 sammenlignet med 21% udbytte, der blev observeret i vores eksperimenter (12/58). Lentiviral behandling kan have spillet en rolle i embryo udvikling og bidraget til lav embryo datatransport sats. Unger med flere lentiviral integrationer og høj udtryk for normal god landbrugspraksis var visuelt grøn under en blå LED lampe (465-470 nm) (figur 3). Antallet af indarbejdet normal god landbrugspraksis kopier varierede fra 0-6 eksemplarer og blev fastsat ved at udføre kvalitative PCR på isolerede kromosomale DNA fra pup væv23.
Figur 1: udvikling af Transduced musen befrugtet æg i kultur. C57BL/6J mus befrugtede æg blev overvåget på dag 0 (høstede befrugtede æg), dag 1 (to-celle), dag 2 (8-16 celler), dag 3 (morula) og dag 4 (blastocyst). Embryoner blev transduced med en lentivirus, bærer en normal god landbrugspraksis gen. Tilstedeværelsen af fluorescens i transduced embryoner blev tydeligt ved dag 2-3. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Laserbehandling af musen befrugtet æg. Eksempler på perforering zona for at producere en hul vs udtynding af zona.
Figur 3: Transgene mus udtryk for normal god landbrugspraksis. Mørke læser (DR Spot lampe, DRSL-9) blev brugt til at visualisere normal god landbrugspraksis positive unger i mørke omgivelser. Ikke-transgene kontrol unger blev føjet til gruppen for kontrast. Resulterende unger (røde pile) var genotypebestemmes og indesluttede fra 0-6 eksemplarer af lentiviral gen/normal god landbrugspraksis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Lentiviruses evne til at integrere i deres vært genom gør dem en ideel vektor for stabil gen levering. Lentiviral vektorer kan bære op til 8,5 kilobase par (kbp) af genetisk materiale, der kan rumme celle-specifikke eller inducerbar initiativtagerne, markeringen markører eller fluorescerende fraspaltning. Indbygget genomisk materiale kan replikere som en del af deres vært genom og reguleres for at udtrykke eller deaktivere på ønskede tidspunkter. Disse vektorer mulighed for spatiotemporelle kontrol over genekspression på forskellige stadier af udvikling og mærke lentiviruses som kraftfulde værktøjer til gen levering.
Laser-assisteret lentiviral transgenese er en effektiv og nem at bruge metode for gen udtryk i vivo. Denne metode kan bruges til i vivo protein produktion, udtryk for genetisk kodet indikatorer eller funktionelle studier. Sammenlignet med andre metoder, laser-assisteret lentiviral gen levering er så effektiv som pronuclear mikroinjektion men kræver ingen tekniske færdigheder eller dyre mikroinjektion arbejdsstationer. XYClone laser er små, bærbare, og kan nemt deles af flere laboratorier.
Laser-assisteret lentiviral gen levering er stabil og ikke flygtig som elektroporation eller photoporation af befrugtede æg. Forbigående gen levering er flere fordele for levering af CRISPR-Cas9 komponenter eller recombinases siden udvidet udtryk kan føre til absurde konsekvenser. Integrase mangelfuld lentiviruses (IDLVs) kan i denne protokol erstattes forbigående transduktion af musen befrugtet æg. IDLVs beholder lentiviral smitteevne men kun beholde en brøkdel (mindre end 8%) af Integrativ kapacitet i lentiviruses29. Laser-assisteret lentiviral transgenese er en yderligere genet levering mulighed for brugerne at vurdere baseret på deres ønskede resultat.
Den store ulempe ved lentiviral transduktion er tilfældige indsættelsen af det leverede genet. Også, celler i de samme embryo kan være vært for flere lentiviral integrationer, der fører til mosaicisme i den transgene. Genotypebestemmelse af afkommet og flere runder af planlagte avl er nødvendigt at etablere et enkelt locus transgene dyr. Lignende avl strategier er også ansat i konventionelle transgenese metoder30.
Et afgørende skridt i denne protokol er længden af tid brugt på laser perforering. Musen befrugtede æg kulturperler i KSOM ikke kan holdes uden for inkubator i mere end 15 min. En novice-bruger skal flytte de befrugtede æg til M2 medium, bruge avancerede KSOM Embryo Medium eller begrænse antallet af embryoner pr. plade. Ifølge vores resultat udvikles 47% af transduced kulturperler mus befrugtede æg til blastocyster23. Derfor, dyrkning af 30-40 befrugtede æg pr. plade vil sikre passende antal transduced blastocyster i én plade til overførsel til pseudopregnant mus.
Laser-assisteret perforation af musen befrugtede æg zona kan også gælde for zona af andre arter og tillader adgang til andre typer af virus eller Transfektion reagenser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Denne forskning blev støttet af den murene Research Program af National Institute of Health (NIH), nationale Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS). Vi er taknemmelige for Dr. Robert Petrovich og Dr. Jason Williams kritisk læsning af manuskript og nyttige råd. Vi vil også gerne anerkende og takke Dr. Bernd Gloss, Knockout core, Flow flowcytometri facilitet, Fluorescens mikroskopi og Imaging Center og sammenlignende medicin filial faciliteter af NIEHS for deres tekniske bidrag. Vi vil gerne takke Mr. David Goulding fra grenen sammenlignende medicin og Ms. Lois Wyrick af Imaging Center på NIEHS for at forsyne os med billeder og illustrationer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD510B-1 plasmid | System Biosciences | CD510B-1 | used to package the lentivirus expressing EF1a-copGFP |
| Dimethylpolysiloxane | Sigma | DMPS5X | culturing embryos |
| hyaluronidase | Sigma | H3506 | used to remove cumulus cells |
| XYClone Laser | Hamilton Thorne Biosciences | perforating mouse fertilized eggs | |
| Non-Surgical Embryo Transfer (NSET) Device | ParaTechs | 60010 | NSET of embryos |
| KSOM medium | Millipore | MR-020P-5F | culturing embryos |
| Composition of KSOM: | mg/100mL | ||
| NaCl | 555 | ||
| KCl | 18.5 | ||
| KH2PO4 | 4.75 | ||
| MgSO4 7H2O | 4.95 | ||
| CaCl2 2H2O | 25 | ||
| NaHCO3 | 210 | ||
| Glucose | 3.6 | ||
| Na-Pyruvate | 2.2 | ||
| DL-Lactic Acid, sodium salt | 0.174mL | ||
| 10 mM EDTA | 100µL | ||
| Streptomycin | 5 | ||
| Penicillin | 6.3 | ||
| 0.5% phenol red | 0.1mL | ||
| L-Glutamine | 14.6 | ||
| MEM Essential Amino Acids | 1mL | ||
| MEM Non-essential AA | 0.5mL | ||
| BSA | 100 | ||
| M2 medium | Millipore | MR-015-D | culturing embryos |
| Composition of M2: | mg/100mL | ||
| Calcium Chloride | 25.1 | ||
| Magnesium Sulfate (anhydrous) | 16.5 | ||
| Potassium Chloride | 35.6 | ||
| Potassium Phosphate, Monobasic | 16.2 | ||
| Sodium Bicarbonate | 35 | ||
| Sodium Chloride | 553.2 | ||
| Albumin, Bovine Fraction | 400 | ||
| D-Glucose | 100 | ||
| Na-HEPES | 54.3 | ||
| Phenol Red | 1.1 | ||
| Pyruvic Acid | 3.6 | ||
| DL-Lactic Acid | 295 |
References
- Sakuma, T., Barry, M. A., Ikeda, Y. Lentiviral vectors: basic to translational. Biochemical Journal. 443 (3), 603-618 (2012).
- Salmon, P., Trono, D. Production and titration of lentiviral vectors. Current Protocols in Human Genetics. , Chapter 12 Unit 12 10 (2007).
- Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors. Science. 295 (5556), 868-872 (2002).
- Filipiak, W. E., Saunders, T. L. Advances in transgenic rat production. Transgenic Research. 15 (6), 673-686 (2006).
- McGrew, M. J., Sherman, A., Lillico, S. G., Taylor, L., Sang, H. Functional conservation between rodents and chicken of regulatory sequences driving skeletal muscle gene expression in transgenic chickens. BMC Developmental Biology. 10, 26 (2010).
- Zhang, Y., et al. Production of transgenic pigs mediated by pseudotyped lentivirus and sperm. PLoS One. 7 (4), e35335 (2012).
- Zhang, Z., et al. Transgenic quail production by microinjection of lentiviral vector into the early embryo blood vessels. PLoS One. 7 (12), e50817 (2012).
- Wassarman, P. M. Zona pellucida glycoproteins. Annul Review of Biochemistry. 57, 415-442 (1988).
- Clift, D., Schuh, M. Restarting life: fertilization and the transition from meiosis to mitosis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (9), 549-562 (2013).
- Fong, C. Y., et al. Blastocyst transfer after enzymatic treatment of the zona pellucida: improving in-vitro fertilization and understanding implantation. Human Reproduction. 13 (10), 2926-2932 (1998).
- Nijs, M., Van Steirteghem, A. C. Assessment of different isolation procedures for blastomeres from two-cell mouse embryos. Human Reproduction. 2 (5), 421-424 (1987).
- Ribas, R. C., et al. Effect of zona pellucida removal on DNA methylation in early mouse embryos. Biology of Reproduction. 74 (2), 307-313 (2006).
- Gordon, J. W., Scangos, G. A., Plotkin, D. J., Barbosa, J. A., Ruddle, F. H. Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA. Proceedings of National Academy of Science U S A. 77 (12), 7380-7384 (1980).
- Kaneko, T., Sakuma, T., Yamamoto, T., Mashimo, T. Simple knockout by electroporation of engineered endonucleases into intact rat embryos. Scientific Reports. 4, 6382 (2014).
- Hosokawa, Y., Ochi, H., Iino, T., Hiraoka, A., Tanaka, M. Photoporation of biomolecules into single cells in living vertebrate embryos induced by a femtosecond laser amplifier. PLoS One. 6 (11), e27677 (2011).
- Horii, T., et al. Validation of microinjection methods for generating knockout mice by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Scientific Reports. 4, 4513 (2014).
- Hamra, F. K., et al. Production of transgenic rats by lentiviral transduction of male germ-line stem cells. Proceedings of National Academy of Science U S A. 99 (23), 14931-14936 (2002).
- Kanatsu-Shinohara, M., et al. Production of transgenic rats via lentiviral transduction and xenogeneic transplantation of spermatogonial stem cells. Biology of Reproduction. 79 (6), 1121-1128 (2008).
- Dann, C. T., Garbers, D. L. Production of knockdown rats by lentiviral transduction of embryos with short hairpin RNA transgenes. Methods in Molecular Biology. 450, 193-209 (2008).
- Chandrashekran, A., et al. Efficient generation of transgenic mice by lentivirus-mediated modification of spermatozoa. FASEB Journal. 28 (2), 569-576 (2014).
- Woods, S. E., et al. Laser-assisted in vitro fertilization facilitates fertilization of vitrified-warmed C57BL/6 mouse oocytes with fresh and frozen-thawed spermatozoa, producing live pups. PLoS One. 9 (3), e91892 (2014).
- Tanaka, N., Takeuchi, T., Neri, Q. V., Sills, E. S., Palermo, G. D. Laser-assisted blastocyst dissection and subsequent cultivation of embryonic stem cells in a serum/cell free culture system: applications and preliminary results in a murine model. Journal of Translational Medicine. 4, 20 (2006).
- Martin, N. P., et al. En masse lentiviral gene delivery to mouse fertilized eggs via laser perforation of zona pellucida. Transgenic Research. 27 (1), 39-49 (2018).
- Lawitts, J. A., Biggers, J. D. Culture of preimplantation embryos. Methods in Enzymology. 225, 153-164 (1993).
- Stein, P., Schindler, K. Mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment. Journal of Visualized Experiments. (53), (2011).
- Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. Caesarean section and fostering. CSH Protocols. 2006 (2), (2006).
- Chum, P. Y., Haimes, J. D., Andre, C. P., Kuusisto, P. K., Kelley, M. L. Genotyping of plant and animal samples without prior DNA purification. Journal of Visualized Experiments. (67), (2012).
- Bin Ali, R., et al. Improved pregnancy and birth rates with routine application of nonsurgical embryo transfer. Transgenic Research. 23 (4), 691-695 (2014).
- Liu, K. C., et al. Integrase-deficient lentivirus: opportunities and challenges for human gene therapy. Current Gene Therapy. 14 (5), 352-364 (2014).
- Sauvain, M. O., et al. Genotypic features of lentivirus transgenic mice. Journal of Virology. 82 (14), 7111-7119 (2008).
