Kweken en manipulatie van O9-1 neurale kamcellen
Summary
O9-1 is een cellijn van multipotente muis crest van de neurale. Hier beschrijven we gedetailleerde stapsgewijze protocollen voor kweken O9-1 cellen, O9-1 cellen in specifieke celtypes te differentiëren en genetisch manipuleren O9-1 cellen met behulp van siRNA-gemedieerde knockdown of bewerken van CRISPR-Cas9-genoom.
Abstract
Neurale kamcellen (NCCs) zijn de migratie van multipotente stamcellen die kunnen onderscheiden in verschillende soorten cellen en aanleiding geven tot meerdere organen en weefsels. De regel van de cel O9-1 is afgeleid van de endogene muis embryonale NCCs en onderhoudt haar multipotent. Echter specifieke cultuur, O9-1 cellen kunnen onderscheid in verschillende soorten cellen en voorwaarden worden gebruikt in een breed scala van toepassingen van het onderzoek. Onlangs, met de combinatie van muis studies en O9-1 cel studies, wij hebben aangetoond dat de Hippo signalering traject effectoren Yap en Taz spelen een belangrijke rol in de neurale crest afkomstige craniofaciale ontwikkeling. Hoewel het kweken proces voor O9-1 cellen ingewikkelder dan die is gebruikt voor andere cellijnen is, is de regel van de cel O9-1 een krachtig model voor het onderzoeken van de NCCs in vitro. Hier presenteren we een protocol voor het kweken van de cellijn O9-1 om te handhaven zijn stemness, evenals de protocollen voor het differentiëren van O9-1 cellen in verschillende celtypen, zoals zachte spiercellen en botcellen. Daarnaast worden protocollen beschreven voor het uitvoeren van gene verlies-van-functie studies in O9-1 cellen met behulp van CRISPR-Cas9 verwijderen en Klein Mengend RNA-gemedieerde knockdown.
Introduction
Neurale kamcellen (NCCs) zijn multipotente stamcellen-achtige cellen met een opmerkelijke trekkende vermogen en voorbijgaande bestaan tijdens de embryonale ontwikkeling. NCCs ontstaan tussen de oppervlakte ectoderm en de neurale buis en migreren naar andere delen van het embryo tijdens de embryonale ontwikkeling1. Op basis van hun functionele domeinen, kunnen NCCs worden ingedeeld in verschillende soorten, met inbegrip van de craniale, romp, vagale, sacraal, en cardiale NCCs. Daarnaast kan NCCs onderscheid in meerdere lineages van de cel, zoals zachte spiercellen, bot cellen en neuronen, en aanleiding geven tot verschillende weefsels2,3. De ontwikkeling van de NCCs wordt gekenmerkt door een complexe reeks van morfogenetische gebeurtenissen die zijn verfijnd door verschillende moleculaire signalen. Gezien de complexe regulering van NCCs en hun belangrijke bijdragen aan vele structuren, kan de disregulatie van NCC ontwikkeling vaak leiden tot aangeboren afwijkingen bij de geboorte, die goed zijn voor bijna 30% van alle menselijke aangeboren geboorteafwijkingen. Afwijkingen bij de ontwikkeling van neurale crest kunnen leiden tot gespleten lip/gehemelte, gebrekkig neus vorming, syndromen, gebreken zoals een defecte cardiale uitstroom tractus of zelfs kindersterfte1,4,5, 6 , 7. begrip van de moleculaire mechanismen van NCC ontwikkeling is belangrijk voor de ontwikkeling van behandelingen voor ziekten veroorzaakt door gebreken in de NCC ontwikkeling. Met het gebruik van verschillende in vitro en in vivo benaderingen8,9,10,11,12,13,14 ,15, aanzienlijke vooruitgang is geboekt in de NCC onderzoek. In vivo, dierlijke modellen, waaronder kippen, amfibieën, zebravis en muizen, hebben gebruikt om te onderzoeken NCCs1. Bovendien zijn menselijke embryo’s te bestuderen van het proces van de NCC migratie in de vroege ontwikkeling van het menselijk embryo16gebruikt. In vitro, cel modellen voor NCCs, zoals menselijke NCCs dat afkomstig van de geduldige onderhuids vet is, zijn gebruikt om te onderzoeken Parkinson’s disease17. De O9-1 NCC-lijn, die is oorspronkelijk afgeleid van massale culturen van endogene NCCs van E8.5 muis embryo’s18werd geïsoleerd, is een krachtige cel model voor het bestuderen van NCCs. bovenal onder de kweekomstandigheden niet-differentiëren, O9-1 cellen zijn Multipotente stamcellen-achtige NCCs. Echter onder wisselende cultuuromstandigheden, kunnen O9-1 cellen worden onderscheiden in DN celtypen, zoals zachte spiercellen, botcellen, chondrocyten en gliacellen18. Gezien deze eigenschappen, zijn O9-1 cellen over het algemeen gebruikt voor NCC-gerelateerde studies, zoals het onderzoek van het moleculaire mechanisme van Cranio-faciale gebreken19,20.
Hier, gedetailleerde protocollen worden geleverd voor het onderhouden van O9-1 cellen, O9-1 cellen in verschillende celtypes te differentiëren en O9-1 cellen manipuleren door het uitvoeren van gene verlies-van-functie studies met CRISPR-Cas9 genoom bewerken en Klein Mengend RNA (siRNA)- gemedieerde vechtpartij technologieën. Als een representatief voorbeeld, wordt het gebruik van O9-1 cellen te bestuderen van Yap en Taz verlies-van-functie beschreven. Yap en Taz zijn de stroomafwaartse effectoren van de Hippo signalering traject, die een cruciale rol in de celproliferatie, differentiatie en apoptosis speelt. Het nijlpaard-traject is ook aangetoond als belangrijk in de ontwikkeling en de homeostase van diverse verschillende weefsels en organen, alsmede in de pathogenese van verschillende ziekten20,21,22,23 ,24,25,26,27,28. De basisonderdelen van Hippo signalering omvatten de tumor suppressor steriele 20-achtige kinases Mst1/2, WW domein-bevattende Salvador steiger eiwitten en de grote tumor suppressor homolog (Lats1/2) kinases. Hippo signalering remt Yap en Taz activiteit en bevordert hun afbraak in het cytoplasma. Zonder onderdrukking van Hippo, kunnen Yap Taz translocate in de kernen en fungeren als transcriptionele co activators. We onlangs bleek dat specifiek het inactiveren van de Hippo effectoren Yap en Taz in muis NCCs met behulp van de Wnt1cre signalering en Wnt1Cre2SOR chauffeurs resulteerde in embryonale letaliteit op E10.5 met ernstige craniofaciale afwijkingen20. We hebben ook studies O9-1 cuvetten te onderzoeken van de rol van Yap en Taz in NCCs uitgevoerd. Om te studeren Yap en Taz functie in NCC proliferatie en differentiatie, Yap en Taz knockdown cellen werden gegenereerd in O9-1 cellen met behulp van siRNA en Yap knock-out cellen zijn gegenereerd met behulp van CRISPR-Cas9 genoom bewerken. De dezelfde gene verlies-van-functie strategieën kunnen worden toegepast op verschillende doelgenen in andere trajecten. Daarnaast kunnen winst-van-functie studies en tests van de transfectie ook worden toegepast op O9-1 cellen te bestuderen van genfuncties en verordening. De protocollen die hier beschreven zijn bedoeld om te worden gebruikt door onderzoekers als gids voor het kweken van O9-1 cellen te handhaven van multipotente stemness, voor het differentiëren van O9-1 cellen in andere celtypes onder verschillende kweekomstandigheden en voor het bestuderen van de genfunctie en de moleculaire mechanismen van NCCs.
Protocol
Representative Results
Discussion
De NCC is een veelzijdige en belangrijke bijdrage aan de verschillende weefsels en organen tijdens de embryonale morfogenese. De regel van de cel O9-1 onderhoudt zijn potentieel om te differentiëren in vele verschillende soorten cellen en bootst de kenmerken in vivo van NCCs, waardoor het een nuttig in vitro -hulpmiddel voor de studie van genfuncties en moleculaire verordening in NCCs. De verschillende status van O9-1 cellen kan komen overeen met verschillende neurale crest nakomelingen in vivo</em…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nicole Stancel, Ph.D., ELS, wetenschappelijke publicaties op de Texas Heart Institute, verleend redactionele steun. Wij danken ook de volgende financieringsbronnen: de American Heart Association nationale Center wetenschapper ontwikkeling Grant (14SDG19840000 naar J. Wang), de 2014 Lawrence Research Award van de Rolanette en de Berdon bot ziekte van Lawrence programma van Texas (naar J. Wang ), en de National Institutes of Health (DE026561 en DE025873 J. Wang, DE016320 en DE019650 naar R. Maxson).
Materials
| Active STO feeder cells | ATCC | ATCC CRL-1503 | Also available in mitomycin C-inactivated form, catalog # ATCC 56-X |
| O9-1 mouse cranial neural crest cell line | Millipore Sigma | SCC049 | |
| DMEM, high glucose, no glutamine | Gibco | 11960-044 | |
| DMEM, high glucose | Hyclone | SH30243.01 | |
| FBS (fetal bovine serum) | Millipore Sigma | ES-009-B | |
| Penicillin – streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| L-glutamine 200mM (100X) | Gibco | 25030-081 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma | G1890 | |
| Trypsin-EDTA 0.25% in HBSS | Genesee Scientific | 25-510 | |
| DPBS (Dulbecco's phosphate buffered saline) without calcium or magnesium | Lonza | 17-512F | |
| MEM non-essential amino acids (MEM NEAA) 100X | Gibco | 11140-050 | |
| Sodium pyruvate (100mM) | Gibco | 11360-070 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M-7522 | |
| ESGRO leukemia inhibitory factor (LIF) 106 unit/ml | Millipore Sigma | ESG1106 | |
| Recombinant human fibroblast growth factor-basic (rhFGF-basic) | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Mitomycin C | Roche | 10107409001 | |
| Matrigel matrix | Corning | 356234 | |
| DMSO (dimethylsulfoxide) | Millipore Sigma | MX1458-6 | |
| Lipofectamine RNAiMAX | Thermo Fisher Scientific | 13778-075 | |
| Opti-MEM I (1X) | Gibco | 31985-070 | |
| Minimum essential medium, alpha 1X with Earle's salts, ribonucleosides, deoxyribonucleosides, & L-glutamine | Corning | 10-022-CV | |
| ON-TARGETplus Wwtr1 siRNA | Dharmacon | L-041057 | |
| ON-TARGETplus Non-targeting Pool | Dharmacon | D-001810 | |
| ON-TARGETplus Yap1 siRNA | Dharmacon | L-046247 | |
| FCS (fetal calf serum) | |||
| ITS (insulin-transferrin-selenium ) | |||
| TGF-b3 | |||
| Ascorbic acid | |||
| BMP2 (bone morphogenetic protein 2) | |||
| Dexamethasone | |||
| B-27 supplement |
References
- Achilleos, A., Trainor, P. A. Neural crest stem cells: discovery, properties and potential for therapy. Cell Research. 22 (2), 288-304 (2012).
- Le Douarin, N. M., Dupin, E. Multipotentiality of the neural crest. Current Opinion in Genetics and Development. 13 (5), 529-536 (2003).
- Santagati, F., Rijli, F. M. Cranial neural crest and the building of the vertebrate head. Nature Reviews. Neuroscience. 4 (10), 806-818 (2003).
- Cordero, D. R., et al. Cranial neural crest cells on the move: their roles in craniofacial development. American Journal of Medical Genetics. Part A. 155 (2), 270-279 (2011).
- Trainor, P. A. Craniofacial birth defects: The role of neural crest cells in the etiology and pathogenesis of Treacher Collins syndrome and the potential for prevention. American Journal of Medical Genetics. Part A. 152 (12), 2984-2994 (2010).
- Bronner, M. E., Simoes-Costa, M. The neural crest migrating into the twenty-first century. Current Topics in Developmental Biology. , 115-134 (2016).
- Zurkirchen, L., Sommer, L. Quo vadis: tracing the fate of neural crest cells. Current Opinion in Neurobiology. 47, 16-23 (2017).
- Sauka-Spengler, T., Bronner-Fraser, M. A gene regulatory network orchestrates neural crest formation. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 9 (7), 557-568 (2008).
- Knecht, A. K., Bronner-Fraser, M. Induction of the neural crest: a multigene process. Nature Reviews. Genetics. 3 (6), 453-461 (2002).
- Steventon, B., Carmona-Fontaine, C., Mayor, R. Genetic network during neural crest induction: from cell specification to cell survival. Seminars in Cell and Developmental Biology. 16 (6), 647-654 (2005).
- Raible, D. W. Development of the neural crest: achieving specificity in regulatory pathways. Current Opinion in Cell Biology. 18 (6), 698-703 (2006).
- Dupin, E., Sommer, L. Neural crest progenitors and stem cells: from early development to adulthood. Developmental Biology. 366 (1), 83-95 (2012).
- Henion, P. D., Weston, J. A. Timing and pattern of cell fate restrictions in the neural crest lineage. Development. 124 (21), 4351-4359 (1997).
- Harris, M. L., Erickson, C. A. Lineage specification in neural crest cell pathfinding. Developmental Dynamics. 236 (1), 1-19 (2007).
- Luo, R., Gao, J., Wehrle-Haller, B., Henion, P. D. Molecular identification of distinct neurogenic and melanogenic neural crest sublineages. Development. 130 (2), 321-330 (2003).
- Betters, E., Liu, Y., Kjaeldgaard, A., Sundstrom, E., Garcia-Castro, M. I. Analysis of early human neural crest development. Developmental Biology. 344 (2), 578-592 (2010).
- Yang, S. Y., Beavan, M., Chau, K. Y., Taanman, J. W., Schapira, A. H. V. A human neural crest stem cell-derived dopaminergic neuronal model recapitulates biochemical abnormalities in GBA1 mutation carriers. Stem Cell Reports. 8 (3), 728-742 (2017).
- Ishii, M., et al. A stable cranial neural crest cell line from mouse. Stem Cells and Development. 21 (17), 3069-3080 (2012).
- Yumoto, K., et al. TGF-beta-activated kinase 1 (Tak1) mediates agonist-induced Smad activation and linker region phosphorylation in embryonic craniofacial neural crest-derived cells. Journal of Biological Chemistry. 288 (19), 13467-13480 (2013).
- Wang, J., et al. Yap and Taz play a crucial role in neural crest-derived craniofacial development. Development. 143 (3), 504-515 (2016).
- Heallen, T., et al. Hippo pathway inhibits Wnt signaling to restrain cardiomyocyte proliferation and heart size. Science. 332 (6028), 458-461 (2011).
- Wang, J., Martin, J. F. Hippo pathway: An emerging regulator of craniofacial and dental development. Journal of Dental Research. 96 (11), 1229-1237 (2017).
- Pan, D. The hippo signaling pathway in development and cancer. Developmental Cell. 19 (4), 491-505 (2010).
- Xiao, Y., Leach, J., Wang, J., Martin, J. F. Hippo/Yap signaling in cardiac development and regeneration. Current Treatment Options in Cardiovascular Medicine. 18 (6), 38 (2016).
- Yu, F. X., Meng, Z., Plouffe, S. W., Guan, K. L. Hippo pathway regulation of gastrointestinal tissues. Annual Review of Physiology. 77, 201-227 (2015).
- Fu, V., Plouffe, S. W., Guan, K. L. The Hippo pathway in organ development, homeostasis, and regeneration. Current Opinion in Cell Biology. 49, 99-107 (2017).
- Moya, I. M., Halder, G. The Hippo pathway in cellular reprogramming and regeneration of different organs. Current Opinion in Cell Biology. 43, 62-68 (2016).
- Piccolo, S., Dupont, S., Cordenonsi, M. The biology of YAP/TAZ: hippo signaling and beyond. Physiological Reviews. 94 (4), 1287-1312 (2014).
- Bauer, D. E., Canver, M. C., Orkin, S. H. Generation of genomic deletions in mammalian cell lines via CRISPR/Cas9. Journal of Visual Experiments : JoVE. (95), e52118 (2015).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Manderfield, L. J., et al. Hippo signaling is required for Notch-dependent smooth muscle differentiation of neural crest. Development. 142 (17), 2962-2971 (2015).
- Hindley, C. J., et al. The Hippo pathway member YAP enhances human neural crest cell fate and migration. Scientific Reports. 6, 23208 (2016).
- Nejigane, S., Haramoto, Y., Okuno, M., Takahashi, S., Asashima, M. The transcriptional coactivators Yap and TAZ are expressed during early Xenopus development. International Journal of Developmental Biology. 55 (1), 121-126 (2011).
- Grefte, S., Vullinghs, S., Kuijpers-Jagtman, A. M., Torensma, R., Von den Hoff, J. W. Matrigel, but not collagen I, maintains the differentiation capacity of muscle derived cells in vitro. Biomedical Materials. 7 (5), 055004 (2012).
- Kang, B. J., et al. Effect of matrigel on the osteogenic potential of canine adipose tissue-derived mesenchymal stem cells. Journal of Veterinary Medical Science. 74 (7), 827-836 (2012).
- Uemura, M., et al. Matrigel supports survival and neuronal differentiation of grafted embryonic stem cell-derived neural precursor cells. Journal of Neuroscience Research. 88 (3), 542-551 (2010).
