Aquí, presentamos un protocolo para obtener imágenes en vivo de fluorescencia etiquetadas fragmentos de endometrio humanos injertado en ratones. El método permite estudiar los efectos de los fármacos de elección en el tamaño de la lesión endometriotic a través del monitoreo y cuantificación de la fluorescencia emitida por el reportero fluorescente en tiempo real
Aquí, describimos un protocolo para la implementación de un modelo de ratón heteróloga en la que la progresión de la endometriosis puede evaluarse en tiempo real a través de monitoreo no invasivo de la fluorescencia emitida por tejido endometrial humano ectópico implantado. Para ello, se obtienen biopsias de endometrio humano de donación de ovocitos curso de mujeres donantes. Fragmentos de endometrio humanos son cultivadas en presencia de adenovirus diseñados para expresar cDNA para el reportero proteína fluorescente mCherry. Sobre visualización, etiquetados como los tejidos con una tasa óptima de fluorescencia después de infección son posteriormente seleccionados para la implantación en ratones receptores. Una semana antes de la cirugía de implantación, ratones receptores son ooforectomizadas, y pastillas de estradiol se colocan subcutáneamente para mantener la supervivencia y el crecimiento de las lesiones. En el día de la cirugía los ratones son anestesia y peritoneal cavidad accedida a través de una incisión pequeña (1,5 cm) por la linea-alba. Fluorescencia de etiquetado implantes son tweezed, brevemente empapados en pegamento y Unidos a la capa peritoneal. Incisiones se suturan, y animales a la izquierda para recuperar un par de días. Fluorescencia emitida por implantes endometriotic generalmente no invasiva se controla cada 3 días durante 4 semanas con un sistema de proyección de imagen in vivo. Variaciones en el tamaño de los implantes endometriósicos se pueden estimar en tiempo real por la cuantificación de la señal mCherry y normalización contra el momento inicial que muestra la intensidad de la fluorescencia máxima.
Tradicionales roedores preclínicas de los modelos de la endometriosis no permiten monitoreo no invasivo de la lesión en tiempo real pero que permiten la evaluación de los efectos de las drogas analizadas en el punto final. Este protocolo permite un seguimiento de las lesiones en tiempo real y es más útil para explorar el potencial terapéutico de los fármacos en modelos preclínicos de la endometriosis. La principal limitación del modelo así generado es que el monitoreo no invasivo no es posible durante largos períodos de tiempo debido a la expresión episomal del Ad virus.
La endometriosis es un trastorno ginecológico crónico por la implantación del endometrio funcional fuera de la cavidad uterina. Lesiones ectópicas crecen y provocar procesos inflamatorios conduce a crónico pélvico dolor e infertilidad1. Se estima que hasta a 10 – 15% de las mujeres en edad reproductiva sufren de endometriosis2, y está presente en aproximadamente el 40-50% de las mujeres estériles3. Los tratamientos farmacológicos para la endometriosis son incapaces de erradicar completamente las lesiones y no están libres de efectos secundarios4,5. La investigación de terapias más eficientes requiere del refinamiento de los modelos existentes de animal de endometriosis de tal manera que las lesiones humanas pueden mímico apropiadamente y evaluar de cerca los efectos de compuestos en el tamaño de la lesión entre otros.
Modelos de primates se han utilizado para imitar la endometriosis implantación ectópicas lesiones histológicamente idénticas y en sitios similares como en los seres humanos6,7,8; sin embargo, preocupaciones éticas y los altos costos económicos relacionados con la experimentación con primates límite su uso9. En consecuencia, el uso de pequeños animales, especialmente roedores, para la implementación de modelos in vivo de la endometriosis sigue ser favorecido ya que estudios con un mayor número de individuos10,11. La endometriosis puede ser inducida en estos animales mediante el trasplante de pedazos de cuernos uterinos roedores “(modelos de homólogos”)12,13 o tejido endometrial/endometriotic humano a sitios ectópicos (modelos heterólogos)14 . A diferencia de los seres humanos, roedores no arrojar su tejido endometrial y así endometriosis puede no desarrollarse espontáneamente en estas especies. Por lo tanto, ratón homólogo modelos de la endometriosis han sido criticados debido a que implanta tejido uterino ratón ectópico no refleja las características de las lesiones endometriotic humana15.
Fisiología adecuado de la endometriosis se puede mímico en los modelos heterólogos de la endometriosis donde fragmentos de endometrio humanos frescos implantados en animales inmunodeficientes. En modelos convencionales heterólogos, los efectos terapéuticos de compuestos de interés se evalúan comúnmente en el punto final de la evaluación del tamaño de la lesión con el uso de pinzas16. Una limitación obvia es que, como tal, modelos animales extremo no permiten estudiar la dinámica de implantación o desarrollo de la lesión endometriotic con el tiempo. Una limitación adicional es que el uso de calibradores no permite mediciones precisas del tamaño de la lesión. De hecho, el error estándar proporcionado por pinzas es en el mismo rango (es decir, milímetros) como el tamaño de las lesiones en ratones, así limitar la capacidad de estas herramientas para detectar las variaciones reales en el tamaño.
Para superar tales limitaciones, adjunto, describimos a la generación de un modelo de ratón heterólogos de la endometriosis en la cual implantado tejido humano está diseñado para expresar una proteína fluorescente reportera m-Cherry. Detección de la señal fluorescente con un sistema apropiado de la imagen permite la monitorización no invasiva del estado de la lesión con cuantificación simultánea de su tamaño en tiempo real. Por lo tanto, nuestro modelo ofrece claras ventajas en comparación con los modelos convencionales de punto final que trae la oportunidad de en tiempo real monitoreo no invasivo y la posibilidad de hacer más objetiva y exacta estimación de las variaciones en el tamaño de la lesión.
El protocolo detallado en el presente documento describe la aplicación de un modelo animal de endometriosis en la cual la arquitectura de implantación de arquitectura de lesiones se conserva mientras que simultaneamente permite evaluación en tiempo real de la fluorescencia emitida por mCherry etiquetado el tejido endometrial. En este protocolo, describimos el uso de un sistema específico de proyección de imagen en vivo y programas relacionados con evaluación no invasiva fluorescencia emitida por la lesión marcada….
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue apoyado por el Ministerio de economía y competitividad a través del programa de Servet Miguel [CP13/00077] cofundado por el FEDER (Fondo Europeo de Desarrollo Regional) y concedió a Dr R. Gómez, así como por el Instituto de Salud Carlos III subvenciones concedidas Dr R Gómez [PI14/00547 PI17/02329] y Prof A. Cano [PI12/02582].
Endosampler™ | Medgyn | 22720 | Cannula for sampling the uterine endometrium |
DMEM Medium | VWR | HYCLSH30285.FS | Medium |
Ad-mCherry | Vector Biolabs | 1767 | Adenoviral vector expressing mCherry |
PBS, 1X solution, sterile, pH 7,4 | VWR | E504-500ML | Buffer for washes |
Pellets 17-B-Estradiol 18 mg/ 60 days | Innovative Research of America | SE-121 | Hormone pellets for rodents |
Vetbond™ Tissue Adhesive | 3M | 780-680 | Tissue adhesive |
Petri dishes in polystyrene crystal | Levantina | 367-P101VR20 | Petri dishes |
Penicillin-Streptomicin | Sigma | P4333-100ML | Antibiotics |
Syringes, medical 10 ml 0,5 ml | VWR | CODA626616 | Syringes |
Nitrile gloves, powder-free | VWR | 112-2754 | Gloves |
Soft swiss nude mice | Charles River | SNUSSFE05S | Mice for animal experiment |
Ivis Spectrum In vivo Imaging system | Perkin Elmer | 124262 | In vivo Monitoring equipment |
Living Image® (Ivis software) | Perkin Elmer | — | In vivo monitoring software |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 10082147 | Enrichment serum |
96-well cell culture treated plates | Life technologies | 167008 | Culture plates |
Urine flasks | Summedical | 4004-248-001 | Flasks for washes |
Sterile surgical blades | (Aesculap Division) Sanycare | 1609022-0008 | Surgical blades |
Isovet 1000 mg/g | B-BRAUN | — | Isoflurane (Anesthetic) |
Buprex® 0.3 mg | Schering Plough S.A. | — | Buprenorphine (Analgesic solution) |
Injectable morphine solution 10 mg/mL | B BRAUN | — | Morphine (Analgesic solution) |
Monofyl® Absorbable Sutures | COVIDIEN | — | Sutures |
Desinclor chlorhexidine | Promedic SA | — | Antiseptic solution |
Microscopy DMi8 | Leica Mycrosystems | — | fluorescence microscope |
Hera Cell 150 Incubator | Thermo Scientific | 51026282 | Incubator |