Summary
Qui, presentiamo un protocollo per l'imaging di vivere di frammenti endometriali umane fluorescente contrassegnati innestate nei topi. Il metodo permette di studiare gli effetti dei farmaci di scelta sulla dimensione della lesione endometriotic attraverso il monitoraggio e la quantificazione della fluorescenza emessa dal reporter fluorescente in tempo reale
Abstract
Qui, descriviamo un protocollo per l'attuazione di un modello di topo eterologo in cui progressione di endometriosi può essere valutata in tempo reale attraverso il monitoraggio non invasivo della fluorescenza emessa dal tessuto dell'endometrio umano ectopico impiantato. Per questo scopo, le biopsie dell'endometrio umano vengono ottenute dalla donazione di ovociti in corso donne di donatore. Frammenti dell'endometrio umani sono coltivate in presenza di adenovirus progettato per esprimere cDNA per il reporter proteina fluorescente mCherry. Al momento della visualizzazione, etichettato tessuti con un tasso ottimo di fluorescenza dopo infezione successivamente vengono scelti per l'impianto in topi destinatari. Una settimana prima dell'intervento di impianto, destinatari topi sono oophorectomized e pallini di estradiolo sono posizionati per via sottocutanea per sostenere la sopravvivenza e la crescita delle lesioni. Il giorno dell'intervento, i topi sono anestetizzate e peritoneale cavità accessibili attraverso un'incisione di piccole dimensioni (1,5 cm) da linea-alba. Impianti fluorescente contrassegnati sono tweezed, brevemente imbevuti di colla e attaccati allo strato peritoneale. Incisioni sono suturate e gli animali lasciati a recuperare per un paio di giorni. Fluorescenza emessa da impianti endometriosici solitamente non invasivo è monitorata ogni 3 giorni per 4 settimane con un sistema di imaging in vivo. Variazioni nelle dimensioni di impianti endometriosici possono essere stimate in tempo reale mediante la quantificazione del segnale mCherry e normalizzazione contro il tempo-punto iniziale che mostra l'intensità di fluorescenza massima.
Roditori tradizionale preclinici di modelli di endometriosi non consentono il monitoraggio non invasivo della lesione in tempo reale, ma piuttosto consentono la valutazione degli effetti di farmaci dosati al punto finale. Questo protocollo permette di tenere traccia di lesioni in tempo reale ed è più utile per esplorare il potenziale terapeutico di farmaci in modelli preclinici di endometriosi. Il limite principale del modello così generato è che il monitoraggio non invasivo non è possibile per lunghi periodi di tempo a causa dell'espressione episomal del annuncio-virus.
Introduction
L'endometriosi è un disturbo ginecologico cronico avviato tramite l'impianto dell'endometrio funzionale di fuori della cavità uterina. Le lesioni ectopiche crescono e inducono processi infiammatori che conduce a dolore e sterilità pelvica cronica1. Si stima che fino a 10-15% delle donne dell'età riproduttiva sono affetti da endometriosis2, ed è presente in circa il 40-50% delle donne infertili3. Gli attuali trattamenti farmacologici per endometriosi sono in grado di eliminare completamente le lesioni e non privo di effetti collaterali4,5. La ricerca di terapie più efficiente richiede del perfezionamento dei modelli animali esistenti di endometriosi in modo tale che le lesioni umane possono essere imitate in modo appropriato, e gli effetti dei composti sulla dimensione della lesione tra gli altri possono essere valutati molto attentamente.
Primate modelli sono stati utilizzati per simulare l'endometriosi di impiantare le lesioni ectopiche istologicamente identiche e a siti simili come in esseri umani6,7,8; Tuttavia, preoccupazioni etiche e gli elevati costi economici legate alla sperimentazione con primati limite loro uso9. Di conseguenza, l'uso di piccoli animali, specialmente roditori, per la realizzazione di modelli in vivo di endometriosi continua ad essere favorito in quanto consente di studi con i più grandi numeri di individui10,11. L'endometriosi può essere indotta in questi animali trapiantando o pezzi di roditore corni uterini "(modelli di omologhe")12,13 o tessuto umano dell'endometrio/endometriosiche per luoghi ectopici (modelli eterologhe)14 . In contrasto con gli esseri umani, roditori non versato il loro tessuto dell'endometrio e quindi l'endometriosi non possono essere sviluppata spontaneamente in queste specie. Pertanto, omologa mouse modelli di endometriosi sono state criticate in quanto impiantato tessuto uterino ectopica del mouse non riflette le caratteristiche delle lesioni endometriosiche umane15.
Fisiologia appropriata di endometriosi può essere imitato nei modelli eterologi di endometriosi dove frammenti endometriali umane fresche vengono impiantati in animali immunodeficienti. In modelli convenzionali eterologi, gli effetti terapeutici di composti di interesse sono comunemente valutati al punto finale dalla valutazione della dimensione della lesione con l'uso di pinze16. Una limitazione evidente è che, come tale, modelli animali dell'endpoint non consentono studiando l'impianto dynamics o lo sviluppo della lesione endometriotic nel corso del tempo. Un'ulteriore limitazione è che l'uso dei calibri non consente misure accurate della dimensione della lesione. Infatti, l'errore standard fornito da pinze è nella stessa fascia (cioè millimetri) come la dimensione delle lesioni impiantati nei topi, limitando così la capacità di questi strumenti per rilevare variazioni effettive dimensioni.
Al fine di superare tali limitazioni, qui, descriviamo la generazione di un modello murino eterologo di endometriosi in cui tessuto umano impiantato è costruita per esprimere una proteina fluorescente di reporter m-Cherry. Rilevamento del segnale fluorescente con un sistema di immagine appropriata consente il monitoraggio non invasivo dello status di lesione con quantificazione simultanea delle sue dimensioni in tempo reale. Così, il nostro modello fornisce chiari vantaggi rispetto ai modelli convenzionali endpoint in quanto porta l'opportunità di non invasivo di monitoraggio in tempo reale e la possibilità di eseguire più obiettivo e stima accurata delle variazioni nella dimensione della lesione.
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Protocol
L'uso di campioni di tessuto umano è stato approvato dal comitato etico dell'Ospedale Universitario La Fe e Institutional Review Board. Tutti i pazienti hanno fornito consenso informato scritto. Lo studio che coinvolgono gli animali è stato approvato dal comitato di cura animale istituzionale presso il Centro de Investigacion Principe Felipe de Valencia, e tutte le procedure sono state effettuate seguendo le linee guida per la cura e l'uso dei mammiferi da istituti nazionali della salute.
1. pre-trattamento e la raccolta di tessuto dell'endometrio
- Ottenere una biopsia di buona qualità dell'aspirato dell'endometrio umano utilizzando una cannula collegata a un dispositivo di aspirazione. Versare la biopsia in una bottiglia contenente 10 mL di sterile salina e lavare con movimentazione manuale delicata.
Nota: Le procedure su come ottenere biopsie di buona qualità sono state precedentemente descritte17. - Lavare la biopsia di qualsiasi restante sangue o muco. Ripetere il processo versando il tessuto per beute contenenti soluzione salina fresca come molti denti come richiesto, fino a quando il tessuto è osservato pulito.
- Frammenti di biopsia di trasferimento con un aspetto sano in una soluzione contenente 10 mL di completano medium (DMEM) esente per volta Eagle di Dulbecco con 10% siero bovino fetale (FBS) e 1% soluzione antibiotico antimicotico.
- Versare il contenuto in una capsula di Petri di 10 cm e procedere a tagliare il tessuto in pezzi di3 5 – 10 mm con una coppia di bisturi.
2. adenoviral transfezione di frammenti endometriali
Nota: Tutti i materiali che stanno per essere impiegati nel processo dovrebbero essere introdotto nella cappa in anticipo. Togliere tutto ciò che non sta per essere utilizzati nel processo e posizionare una boccetta con candeggina. Tutto il materiale che entra in contatto con il vettore adenovirale dovrà essere disinfettato con la candeggina prima di scartarlo nel contenitore di biohazard.
- Una volta che la biopsia è stata tagliata, prendere un nuovo piatto di Petri. Pipettare più 30-50 gocce DMEM µ l di diffusione in tutto il piatto intero. Lasciare spazio sufficiente tra gocce quindi non entrano in contatto.
- Aiutati con un ago collegato alla siringa, posizionare un pezzo singolo di frammento all'interno di ciascuna delle gocce medie.
Nota: Ogni goccia deve contenere un unico pezzo di endometrio. - Preparare la soluzione di lavoro annuncio-mCherry diluendo 01:20 della soluzione stock adenoviral mCherry [1 x 1010 pfu/mL]) in DMEM medio senza antibiotici (DMEM + 10% FBS di filtrato).
- Pipettare 100 – 200 μL della soluzione di annuncio-mCherry per pozzetto su una piastra a 96 pozzetti, riempimento come molti pozzi come frammenti sono disponibili nelle gocce di Petri (punto 2.2). Inoltre, riempire almeno 3 pozzetti con mezzo DMEM libero dell'adenovirus come controllo negativo.
- Aiutati con un ago collegato alla siringa, trasferire ciascuno dei frammenti in di Petri (punto 2.2) in ciascuna dei pozzetti contenenti annunci-mCherry soluzione nella piastra a 96 pozzetti.
- Posto il 96 pozzetti contenenti i frammenti dell'endometrio con annuncio-mCherry soluzione in un incubatore a 37 ° C con 5% CO2 per 16 h.
- Lavare l'adenovirus rimanenti nel mezzo di trasferimento di tessuti in una nuova piastra a 96 pozzetti riempita con terreno DMEM completo (con antibiotici azolici, gratuito dell'adenovirus) e incubare a 37 ° C con 5% CO2 per 24 – 48 h.
Nota: Ricordatevi di coprire con candeggina in tutti i pozzetti e suggerimenti che è venuto a contatto di Ad-virus prima di gettare nel contenitore di biohazard. - Prendere la piastra dall'incubatrice e posizionarlo sotto un microscopio a fluorescenza a 568 nm (canale rosso) per testare per l'etichettatura ottimale.
- Scegliere i frammenti più brillanti e inserirli in una nuova piastra a 96 pozzetti con terreno DMEM completo nuovo (con antibiotici azolici, gratuito dell'adenovirus).
- Sigillare la piastra con una pellicola di plastica paraffina e di trasporto nell'area di animali esenti da patogeni specifici per l'impianto di frammenti endometriali in animali destinatari.
3. generazione del modello del topo di endometriosi
Nota: Utilizzare 6 – 8 settimana-vecchio athymic nudo (o ceppi simili immunocompromessi) topi femmina ospitati in specifiche condizioni di agente patogeno – gratis, come destinatari animali. Per evitare variazioni ormonali del ciclo-dipendente e contemporaneamente alimentare la crescita lesione con estradiolo, sono animali ovariectomizzati e posizionato con 60 giorni di rilascio capsule contenenti 18 mg di βeta-estradiolo 17 (17 β-E2). Posizionamento di ovariectomia e pellet devono essere effettuate almeno una settimana di anticipo l'innesto di frammenti endometriali negli animali destinatari.
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Ovariectomia
Nota: Preparare materiale chirurgico sterilizzato in un cappuccio. Preparare l'anestesia attrezzature e una zona di recupero post-chirurgico pronta nella stessa stanza.- Eseguire un'iniezione sottocutanea del derivato di morfina alla dose di 5 mg/kg al mouse. Lasciate che i topi riposare per 30 min dopo l'iniezione, così come analgesici possono essere manifestati gli effetti del farmaco.
- Collegare l'inalazione anestesia attrezzature e lasciare che ossigeno e isoflurano (2% mg/kg) di flusso per qualche minuto in un alloggiamento sigillato l'anestesia.
- Introdurre l'animale nella camera di anestesia di isoflurane. Attendere per 3 – 5 minuti e controllare che gli animali sono completamente anestetizzati premendo una delle sue zampe. Trasferire l'animale per l'area di chirurgia e mantenere l'anestesia posizionando una maschera con flusso continuo di gas isoflurano che coprono le vie respiratorie.
- Dopo la disinfezione della zona con clorexedina, eseguire un'incisione costale trasversale 0,5 cm circa all'altezza dell'anca con forbici affilate.
- Separare la pelle dal muscolo per ottenere l'accesso alla cavità addominale, identificare il cuscinetto di grasso bianco che circonda l'ovaio e ritrarre l'ovaio con il forcipe di dissezione.
- Fare un nodo intorno ovidotto con sutura assorbibile e serrare per assicurare adeguata emostasi prima di asportare l'ovaio.
- Chiudere lo strato muscolare con sutura riassorbibile 6-0 e quindi chiudere la pelle con sutura non riassorbibile 6-0. Pulire l'area nuovo con soluzione antisettica.
- Ripetere la procedura per rimuovere l'ovaio laterale di contra.
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Estradiolo a pellet impianto
Nota: Fare attenzione che l'animale è anestetizzato durante l'intervento di ovariectomia per posizionare il pellet a quel punto.- Immediatamente dopo il completamento della procedura ovariectomia, pulire la cute con soluzione antisettica che circonda il collo e praticare un'incisione trasversale sottocutaneo piccolo (0,5 cm) con forbici affilate nella nuca.
- Utilizzare le forbici per sezionare la pelle dal muscolo, rendendo una tasca abbastanza grande da permettere l'immissione del pellet.
- Inserire il pallino che contiene 18 mg di 17 β-E2 e suturare la pelle con una sutura non riassorbibile 6-0. Pulire l'area nuovo con soluzione antisettica.
- Posizionare l'animale nella zona di recupero e amministrare una dose ottimale di analgesia di lunga durata per facilitare il periodo di recupero.
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Chirurgia implantare dell'endometrio
Nota: Consentire almeno un periodo di quarantena di sette giorni per consentire il pieno recupero degli animali dopo l'ooforectomia prima di iniziare l'intervento chirurgico di impianto di frammento dell'endometrio. Per la sincronizzazione ottimale con etichettatura del tessuto, raccogliere la biopsia 2 – 3 giorni prima dell'intervento chirurgico di impianto in modo da evitare la coltura a lungo termine degli espianti.- Preparatevi in anticipo per la sala operatoria nella zona libera di agente patogeno specifico. Preparare anche la cappa con tutto il materiale richiesto chirurgica, l'apparecchiatura di anestesia e la zona di recupero post-chirurgico.
- Portare gli animali in camera, un'iniezione sottocutanea di un derivato della morfina alla dose di 5 mg/kg () di eseguire in ogni mouse. Lasciate che i topi riposare per 30 min dopo l'iniezione, così gli effetti analgesici del farmaco possono essere manifestati.
- Collegare l'inalazione anestesia attrezzature e lasciare che ossigeno e isoflurano (2% mg/kg) di flusso per qualche minuto in un alloggiamento sigillato l'anestesia.
- Prima di iniziare l'intervento chirurgico, spostare la piastra che contiene fluorescente etichettati frammenti (dal punto 2.10) nel cofano, dissigillare esso e versare i frammenti in una capsula Petri per facilitarne la manipolazione.
- Introdurre l'animale nella camera di anestesia di isoflurane. Attendere per 3 – 5 minuti e controllare che gli animali sono completamente anestetizzati premendo una delle sue zampe. Trasferire l'animale per l'area di chirurgia e mantenere l'anestesia posizionando una maschera con flusso continuo di gas isoflurano che coprono le vie respiratorie.
- Posizionare l'animale anestetizzato verso l'alto. Disinfettare la zona ventrale. Eseguire un'incisione longitudinale 1,5 cm nell'addome con forbici affilate e separare la pelle dal muscolo. Quindi, eseguire un'incisione longitudinale 1,5 cm nel muscolo per accedere alla cavità peritoneale.
- Tenere il bordo sinistro della parete muscolare dell'addome con mini-pinze e piegarlo cercando di esporre la faccia interna del peritoneo all'esterno.
- Prendere un impianto dell'endometrio con mini pinzette, immergerlo brevemente in un adesivo cianoacrilato di n-butile e posizionarlo al peritoneo dove sarà ottenere attaccato. Lasciare asciugare per pochi secondi. Ripetere i passaggi 3.3.6 e 3.3.7 per inserire un impianto sul lato controlaterale del peritoneo.
- Chiudere lo strato muscolare con una sutura riassorbibile 6-0 e quindi chiudere la pelle con un non-assorbibile sutura 6-0. Pulire l'area nuovo con soluzione antisettica.
- Posizionare l'animale nella zona di recupero e amministrare una dose ottimale di analgesia di lunga durata.
4. in Vivo Imaging fluorescente con In Vivo Imaging System
- Attivare il dispositivo di sistema di imaging in vivo, inizializzare il programma e consentire la telecamera CCD raffreddare per qualche minuto.
- Preparare l'apparecchiatura di anestesia per inalazione. Aprire il flusso di isoflurane al 2% per un paio di minuti per riempire la camera di anestetica. Preparare la zona di recupero post-anestesia.
- Una volta avviato il programma e la telecamera si sono raffreddati, fare clic sullo strumento di Imaging guidata : un tutorial inizia con una serie di finestre consecutive visualizzata, ognuno corrispondente a un parametro di interesse con diverse opzioni disponibili a scelta Cliccando nella casella corrispondente. Spostarsi in avanti attraverso il tutorial selezionando le caselle appropriate in ogni finestra e fare clic sul pulsante OK per spostare il successivo set di parametri con la seguente sequenza.
- Selezionare la casella di Epiluminescenza per il parametro di fluorescenza, selezionare la casella di mCherry per il parametro di coppie di filtro. Selezionare le caselle di modalità di fotografia e di Messa a fuoco confermare e selezionare la casella per il parametro di esposizione automatica.
- Una volta che lo strumento è stato impostato, è possibile spostare un animale all'interno della camera di anestesia. Quando completamente anestetizzato, trasferire l'animale all'interno in vivo imaging gabbia sistema e posizionarlo rivolto verso l'alto con la sua testa all'interno di un tubulo collegato alla macchina di anestesia. Chiudere il coperchio e fare clic su Acquisisci per il monitoraggio.
- Acquisire le immagini che appaiono (un totale di cinque immagini, una sola immagine per ogni coppia di filtri selezionati) e salvare i dati facendo clic sul pulsante Salva con nome . Spostare il mouse nell'area di recupero post-anestesia. Ripetere il processo con gli animali restanti.
- Ripetere il monitoraggio di due o tre volte a settimana al follow-up il segnale in modo appropriato durante il corso di tempo.
- Procedere a sacrificare l'animale alla fine del corso tempo da CO2 asfissia.
5. quantificazione di In Vivo fluorescenza immagini
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Segregazione di fluorescenza effettivo attraverso immagine unmixing:
- Aprire il In Vivo Imaging analisi accoppiata programma Software.
- Scegliere il file "Sequenceinfo" per iniziare l'analisi. Verranno visualizzate due finestre: "Sequenza view" e "Tavolozza". Scegliere la Tavolozza degli strumenti e una volta che il menu è stato visualizzato selezionare le opzioni seguenti.
- Correzioni di selezionare e fare clic sulla casella Adaptive FL sfondo sottrazione per rimuovere i segnali fluorescenti indesiderabili dai dati dell'immagine luminescenti. Scegli la soglia di maggiore interesse e fare clic su imposta.
- Fare clic su Spectral Unmixing, selezionare le lunghezze d'onda di interesse, il metodo scelto per unmixing (biblioteca, visite guidata, automatico o manuale) e quindi fare clic su Start Unmix.
- Selezionare l'immagine di Unmixed corrispondente segnale mCherry e fare doppio clic. Verrà visualizzata una nuova finestra con l'immagine finale del segnale di interesse.
- Ripetere il punto 5.1.3.
- FACOLTATIVO: Se è necessaria un'immagine rappresentativa (JPEG) del risultato unmix, scegliete le impostazioni desiderate nella tavolozza degli strumenti | Regolazione della battuta (colore tavolo, binning, contrasto, ecc.) e quindi fare clic su Esporta grafica nella finestra unmix di esportare l'immagine attualmente visualizzata come un'immagine.
- Salvare il file non miscelato: File | Salvare come | Scegliere la cartella e Ok.
- Ripetere il processo con il resto dei giorni monitoraggio e con tutti gli animali.
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ROIs istituito e quantificazione del segnale
- Fare clic su Sfoglia e selezionare il file non miscelati (vedi passo 5.1.8) di interesse per essere analizzati. Apparirà una nuova finestra.
- Fare clic su Aggiungi all'elenco per includere tutti i file non miscelati da ciascun animale in diversi momenti e quindi fare clic su Carico come un gruppo. Tutte le immagini devono apparire come un'unica sequenza.
- Vai alla finestra Tavolozza degli strumenti : fare clic la casella scalandividual per ottenere tutte le immagini sulla stessa scala.
- Fare doppio clic in una sola immagine della sequenza e creare un ROI sulla zona di interesse utilizzando la seguente sequenza. Vai a Strumenti di ROI e selezionare contorno e Auto 1 opzione, fare clic sulla forma cerchio che appare, collocarlo al centro il segnale fluorescente e quindi fare clic su Crea nella finestra visualizzata.
Nota: Questo automaticamente evidenzia pixel con un'intensità di fluorescenza sopra i valori di priorità bassa (cioè, la lesione) e genera una forma in cui la zona abbraccia i pixel delineati. - La forma creata di ROI di copiare e incollare su un'area di sfondo dove non c'è nessun segnale.
- Fare clic su misura ROIs | Seleziona tutto per visualizzare i valori di intensità di fluorescenza. Procedere a selezionare i valori dei dati con il mouse, tasto destro, premere copia e incolla su un foglio di calcolo.
6. dati (segnale fluorescente) normalizzazione
- Selezionare il punto iniziale di tempo al quale segnale intensità è massima. Procedere per normalizzare il segnale in ogni punto del tempo utilizzando la formula:
Segnale di intensità in ogni punto del tempo / intensità di segnale massima osservata durante il corso di tempo) x 100.
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Representative Results
Qui, descriviamo il processo per la creazione di un modello eterologo di endometriosi che conserva l'architettura delle lesioni impiantando fluorescente contrassegnati pezzi di endometrio umano in topi immunocompromessi, consentendo in tal modo non invasivo monitoraggio della progressione della lesione. Etichettatura dei frammenti endometriali è raggiunto tramite l'infezione con l'adenovirus progettato per esprimere mCherry, una proteina che emettono fluorescenza nella regione del vicino infrarosso. In Figura 1, indichiamo rappresentante immagini dei frammenti dell'endometrio umani infettati da annuncio-mCherry osservati al microscopio a fluorescenza. A scopo esemplificativo, frammenti etichettati e non marcato sono inclusi quindi si notano differenze nella fluorescenza tra tessuti infetti e non infetti (autofluorescenza). Durante il monitoraggio, oltre la lunghezza d'onda di riferimento per mCherry, immagini fluorescenti sono prese con diverse coppie di filtri di eccitazione/emissione lunghezze d'onda (Figura 2) per definire il profilo caratteristico emissione fluorescente dei tessuti. Lo scopo di questa azione è quello di "unmix" effettivo fluorescenza emessa da lesioni da sfondo e autofluorescenza emessa da tessuti dell'ospite e la cicatrice che ha avuto origine durante la chirurgia, rispettivamente. Un esempio chiarificatore del processo unmix è illustrato nella Figura 3. Le stime di variazione nella dimensione della lesione viene eseguita da quantificare e normalizzante segnalazione fluorescente emessa dalle lesioni durante il corso di tempo. Per questo scopo, immagini di monitoraggio contenente crudo fluorescenza emessa dagli animali durante ogni punto di tempo sono in primo luogo ha riunito non normalizzati (Figura 4) in un unico file. Successivamente la fluorescenza è non miscelati, normalizzato e rappresentato come un'immagine a falsi colori (Figura 5). Infine, ROIs corrispondente alla lesione specifica e sfondo di segnalazione sono automaticamente riconosciuti dal programma e quantificati (Figura 6). Sfondo ROI segnalazione viene sottratta dalla lesione ROI segnalazione e risultati di intensità in ogni tempo punto vengono normalizzati contro il punto di tempo in cui l'intensità è massima (Figura 7). Alla fine del processo di monitoraggio, parecchie settimane dopo chirurgia topi sono sacrificati e vitali dell'impianto possa essere recuperato associata al peritoneo del mouse (Figura 8).
Figura 1: visualizzazione dei frammenti endometriali con microscopio a fluorescenza dopo infezione annuncio-mCherry. (A) frammento dell'endometrio umano incubato con annuncio-mCherry a 37 ° C e 5% CO2 durante 24 h come un campione positivo. (B) frammento dell'endometrio umano incubati a 37 ° C e 5% di CO2 senza annuncio-mCherry come un campione di controllo negativo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Raw imaging fluorescenza emessa da etichettato frammenti impiantati nei topi. L'immagine mostra rappresentativa formazione immagine di fluorescenza crudo segnale emesso dall'animale stesso in un momento specifico. Immagini corrispondono a screenshots ottenuti utilizzando software accoppiato ad un dispositivo di sistema di imaging in vivo durante una sessione di monitoraggio. Ogni pannello contenente topi (numerati da 1 – 5 nell'angolo sinistro) corrisponde alla fluorescenza osservata usando un filtro di accoppiamento eccitazione/emissioni specifiche differenti per l'acquisizione di immagini. Pannello di destra (tavolozza) Visualizza i parametri di fluorescenza selezionati per acquisizione di immagini Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Unmixing di fluorescenza specifica di fondo vs emessa dalle lesioni. Foto spettacoli immagini rappresentative del processo unmixing dissezionare effettivo fluorescenza da lesioni mediante il sistema di imaging in vivo accoppiata software. Grafico nel pannello sinistro denotano normalizzati profili specifici di emissione di fluorescenza di scar (linea verde, UMX1), lesioni (linea rossa, UMX2) e tessuto ospite (linea blu, pannello di UMX3). L'intensità di fluorescenza a lunghezze d'onda di emissione diversi (asse x) è rappresentato in unità di efficienza radiante (asse y). Basta notare come ogni struttura specifica (cioè, cicatrice, etichettati come lesioni e tessuto ospite) emette un profilo diverso di fluorescenza che permette di identificare e segregare loro in particolare forma a vicenda. Sul pannello di destra, fluorescenza derivanti dal lancio di profili di emissione specifici per la cicatrice (UMX1), lesioni (UMX2) e tessuto ospite (UMX3) sono mostrati sovrapposti sulle immagini di fotografia dei topi. Un composito immagine (composito) è anche incluso per scopi illustrativi denotare la segmentazione della fluorescenza emessa da lesioni da quella emessa dai tessuti della cicatrice o host. Pannello centrale mostra i parametri selezionati per unmixing con il software di immagine accoppiato al dispositivo di imaging in vivo Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: corso monitoraggio di crudo fluorescenza emessa dalle lesioni Time. Pannello Mostra immagini rappresentative di crudo fluorescenza emessa da un singolo mouse impiantato con lesioni umane con etichettate (macchie di giallo brillante) durante il corso di tempo. Punti di tempo dopo l'intervento chirurgico a cui è stato effettuato il monitoraggio sono indicati come "Giorno (numero)". Filtri di coppia eccitazione di emissione degli annunci utilizzati per il monitoraggio sono indicati in ogni pannello/immagine. Ogni pannello è identificato da un codice specifico (BKG) nella parte superiore contenente informazioni relazionati alla data in cui è stata acquisita la fluorescenza.
Figura 5: monitoraggio in corso tempo di normalizzato fluorescenza emessa dalle lesioni. Immagini rappresentative corrispondente non miscelati, normalizzato segnalazione fluorescente emessa da lesioni umane (macchie con colore dell'arcobaleno) sovrapposte in un unico mouse durante il periodo del corso (giorni dopo chirurgia). Punti di tempo dopo l'intervento chirurgico a cui è stato effettuato il monitoraggio sono indicati come "Giorno (numero)". Ogni pannello è identificato da un codice specifico (BKG) nella parte inferiore contenente informazioni relazionati alla data in cui è stata acquisita la fluorescenza. Colore della tavolozza arcobaleno sul lato destro identifica l'intensità di fluorescenza (efficienza radiante) emessa dalle lesioni in ogni momento. Si noti come forte intensità di fluorescenza durante le flessioni di punti (cioè, il colore rosso al centro delle lesioni giorni 1,5 e 8) di tempo iniziale durante il corso di tempo (cioè, di colore blu in lesioni nei giorni 20 e 25). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: utilizzo di ROIs per quantificazione dell'intensità di fluorescenza in lesioni durante il corso di tempo. Figura Mostra pannello di immagini di fluorescenza normalizzata emessa da lesioni in un unico mouse durante il corso di tempo (cioè, Figura 5) con l'aggiunta di ROIs (delineazione lesioni e sfondo) per la quantificazione dell'intensità di fluorescenza. ROI 1 e 2 di ROI identificare la quantità di fluorescenza emessa da ciascuno dei due lesioni durante il corso di tempo. BKG identificare la quantità di fluorescenza emessa da tessuto ospite (fluorescenza di fondo) durante il corso di tempo. Fluorescenza di fondo viene sottratto da ROIs per scopi di quantificazione. Punti di tempo dopo l'intervento chirurgico a cui è stato effettuato il monitoraggio sono indicati come "Giorno (numero)". Immagini acquisite in ogni momento sono etichettati con un codice specifico (BKG) nella parte inferiore di ogni uno che contiene informazioni relazionati alla data alla quale la fluorescenza è state acquistate (primi otto cifre seguenti dati dettaglio BKG per anno (2014)-mese (10) e - giorno (da 10 a 31)) , un codice di identificazione individuale (ultime 6 cifre) e i profili specifici di emissione di fluorescenza utilizzato per unmixing colore della tavolozza arcobaleno (UMX2) sul lato destro fornisce una scala visiva di intensità di fluorescenza (efficienza radiante) emessa dalle lesioni alle ogni punto del tempo. Nota come i valori di intensità di fluorescenza nelle due lesioni (ROI1 e ROI2) sono superiori al tempo iniziale punti (giorni 1 e 5) e decade durante il corso di tempo per raggiungere i valori più bassi alla fine punti temporali (giorni 20 e 25). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: normalizzazione dell'intensità di fluorescenza durante il corso di tempo. Tabella nella parte superiore Mostra esempio illustrativo dei valori di intensità di fluorescenza (efficienza radiante) emessa da due mCherry etichettato lesioni (ROI1 e ROI2) impiantate in un topo (R25). Controllo di fluorescenza è stato effettuato presso diversi giorni dopo l'intervento (D5-D25) durante il corso di tempo. D5 - grafico in basso illustra il tipico pattern di fluorescenza normalizzata emessa dalle lesioni infettate mCherry decadere nel corso del tempo. Asse y vengono visualizzati valori di fluorescenza normalizzata per esprimere la percentuale di decadimento utilizzando la formula (segnale di intensità in ogni punto del tempo / intensità di segnale massima osservata durante il corso di tempo) x 100. Tempo punti (giorni (Dx) dopo aver impiantato chirurgia) al quale la fluorescenza è stata monitorata sono indicate nell'asse x. Nota iniziale aumento di segnalazione durante le prime 24 ore dopo l'intervento chirurgico, corrispondente alla stabilizzazione della lesione, il picco di intensità di fluorescenza intorno D1-D5 e il suo successivo decadimento dovuto l'espressione episomal di mCherry durante il corso di tempo cliccate qui per visualizzare la versione ingrandita di questa figura.
Figura 8: apparenza macroscopica di lesioni endometriosiche impiantate. Rappresentante immagini visualizzando apparenza macroscopica di lesioni endometriosiche impiantati nei topi alla fine del processo di monitoraggio sacrificio Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il protocollo dettagliato nel presente documento viene descritta l'implementazione di un modello animale di endometriosi in cui l'architettura di impiantare architettura lesioni è conservata mentre simultaneamente permettendo la valutazione di tempo reale della fluorescenza emessa da mCherry con l'etichetta tessuto endometriale. In questo protocollo, descriviamo l'uso di un specifico sistema di imaging in vivo e relativo software per valutare in modo non invasivo fluorescenza emessa dalla lesione con etichetta. Ogni utente deve adattare il protocollo a seconda del dispositivo di imaging specifico e relativi software disponibile alla loro istituzione. Monitoraggio viene eseguito in animali anestetizzati attraverso una macchina di anestesia di gas isoflurano accoppiata ad un sistema di imaging in vivo. Per evitare interferenze con auto-fluorescenza emessa da ferite, è consigliabile avviare il monitoraggio fluorescenza lesioni almeno tre giorni dopo l'intervento di impianto.
Modelli murini eterologo di endometriosi simile a quello illustrato nel presente documento precedentemente sono stati descritti che consiste nei frammenti endometriali impianto etichettati con la proteina fluorescente verde (GFP)18,19. L'uso di mCherry come reporter per il tagging il tessuto umano fornisce tuttavia un vantaggio sopra GFP a causa della penetrazione di tessuto maggiore del precedente. Grazie alla sua più grande spettro di emissione e fotostabilità superiore mCherry emette un segnale luminoso che è più appropriato per la visualizzazione dei frammenti intraperitoneale.
Grazie alle sue piccole dimensioni gli adenovirus sono i vettori di scelta per l'infezione (cioè, etichettatura) di pezzi di tessuto intero come quelli fornire accettabile diffusione attraverso strutture 3D. Anche con questo non è supera a 30 – 35% la percentuale delle cellule del tessuto infettato. Pertanto, la limitazione di questo modello si basa sull'etichettatura inefficiente del tessuto e, inoltre, l'espressione transitoria realizzato da adenovirus. Infatti, fluorescenza non può essere monitorato di là di 4 – 6 settimane come si affievolisce progressivamente a causa dell'espressione transitoria episomal del virus dell'annuncio. Efficienza di etichettatura e il periodo di monitoraggio potrebbe essere aumentati da sconvolgere il tessuto del donatore e infettare le cellule epiteliali/stromal singole isolate con annuncio-virus prima di essere iniettato in topi destinatario19,20. Tale approccio, tuttavia, riduce l'entità a cui il modello animale imita la fisiologia dell'endometriosi purché ectopiche lesioni umane non consistono in un accumulo disorganizzato di singole cellule epiteliale/stromal, ma piuttosto in ben strutturato tessuto endometriotic.
In questo protocollo, il punto più critico è l'etichettatura del tessuto e più specificamente la determinazione della concentrazione appropriata di annuncio-virus necessaria per infezione ottima. Infatti, la concentrazione di pfu/mL10 di 1 x 10 sottolineata nel protocollo è principalmente una figura orientativi/consenso basata sulla nostra esperienza. La concentrazione ottimale potrebbe differire in ogni esperimento a seconda del tipo e qualità di biopsia e/o quanto velocemente questo viene elaborato. Vi suggeriamo pertanto di prova i diversi titoli (duplice) almeno tre in ogni esperimento e scegliendo quella che fornisce etichettatura ottimale basato su visualizzazione al microscopio a fluorescenza.
Il nostro modello di protocollo è utile per studiare i meccanismi implicati nella creazione e sviluppo precoce delle lesioni endometriosiche. Nonostante il periodo di tempo di monitoraggio è vincolato, il modello è ancora utile per studiare e rilevare gli effetti di composti farmacologici in grado di esercitare effetti drammatici sulla dimensione della lesione in un breve periodo di tempo come antiangiogenici o farmaci antiestrogenica. Lo sviluppo di metodi più efficienti e durevoli di etichettatura tessuti umani sono attesi per diffondere il monitoraggio non invasivo come una tecnica consolidata per esplorare il potenziale terapeutico di una vasta gamma di farmaci nell'endometriosi modello preclinico.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato dal Ministero spagnolo dell'economia e la competitività attraverso il Miguel Servet programma [CP13/00077] ha cofondato dal FESR (Fondo europeo di sviluppo regionale) e assegnato a Dr R. Gómez nonché da Carlos III Istituto superiore di sanità sovvenzioni conferite Dr R Gómez [PI14/00547 e PI17/02329] e Prof A. Cano [PI12/02582].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Endosampler™ | Medgyn | 22720 | Cannula for sampling the uterine endometrium |
| DMEM Medium | VWR | HYCLSH30285.FS | Medium |
| Ad-mCherry | Vector Biolabs | 1767 | Adenoviral vector expressing mCherry |
| PBS, 1x solution, sterile, pH 7.4 | VWR | E504-500ML | Buffer for washes |
| Pellets 17-B-Estradiol 18 mg/60 days | Innovative Research of America | SE-121 | Hormone pellets for rodents |
| Vetbond™ Tissue Adhesive | 3M | 780-680 | Tissue adhesive |
| Petri dishes in polystyrene crystal | Levantina | 367-P101VR20 | Petri dishes |
| Penicillin-Streptomicin | Sigma | P4333-100ML | Antibiotics |
| Syringes, medical 10 mL 0.5 ml | VWR | CODA626616 | Syringes |
| Nitrile gloves, powder-free | VWR | 112-2754 | Gloves |
| Soft swiss nude mice | Charles River | SNUSSFE05S | Mice for animal experiment |
| Ivis Spectrum In vivo Imaging system | Perkin Elmer | 124262 | In vivo Monitoring equipment |
| Living Image® (Ivis software) | Perkin Elmer | --- | In vivo monitoring software |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10082147 | Enrichment serum |
| 96-well cell culture treated plates | Life technologies | 167008 | Culture plates |
| Urine flasks | Summedical | 4004-248-001 | Flasks for washes |
| Sterile surgical blades | (Aesculap Division) Sanycare | 1609022-0008 | Surgical blades |
| Isovet 1,000 mg/g | B-BRAUN | --- | Isoflurane (Anesthetic) |
| Buprex® 0.3 mg | Schering Plough S.A. | --- | Buprenorphine (Analgesic solution) |
| Injectable morphine solution 10 mg/mL | B BRAUN | --- | Morphine (Analgesic solution) |
| Monofyl® Absorbable Sutures | COVIDIEN | --- | Sutures |
| Desinclor chlorhexidine | Promedic SA | --- | Antiseptic solution |
| Microscopy DMi8 | Leica Mycrosystems | --- | fluorescence microscope |
| Hera Cell 150 Incubator | Thermo Scientific | 51026282 | Incubator |
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