Summary
ここでは、マウスに移植した蛍光に分類されたひと子宮内膜片のライブ イメージングのためのプロトコルを提案する.メソッドは、リアルタイムの蛍光レポーターによって放出される蛍光の定量化と監視によって子宮内膜症の病巣の大きさの選択の薬の影響を研究します。
Abstract
ここでは、子宮内膜症の進行を注入された異所性ひと子宮内膜組織によって放出される蛍光の非侵襲的モニタリングを通じてリアルタイムで評価される異種マウス モデルの実装のプロトコルについて述べる。このため、ひと子宮内膜の生検はドナー女性寄付継続的な卵から取得されます。ひと子宮内膜断片アデノ レポーター蛍光タンパク質 mCherry の cDNA を表現するために設計の前で培養されます。可視化、時に感染症はその後選ばれた受信者マウスに注入した後、蛍光の最適な速度と組織をラベル付けします。注入術前 1 週間は、受信者マウスが経時およびエストラジ オールのペレットは、生存と病変の成長を維持するために皮下配置されます。手術の日にマウスが麻酔をかけられたと腹膜キャビティ白線. (1.5 cm) の小さな切開を通してアクセス蛍光に分類されたインプラントが tweezed、簡単に接着剤に浸漬し、腹膜の層に接続されています。切開、縫合、動物と日のカップルのための回復します。臓インプラントによって放出される蛍光は通常非侵襲的インビボ イメージング システムと 4 週間毎の 3 日間が監視されます。臓インプラントのサイズの変化は、mCherry 信号と最大蛍光強度を示す初期の時点に対する正規化の数量化によるリアルタイムで推定できます。
子宮内膜症モデルの伝統的な臨床齧歯動物はリアルタイムで病変の非侵襲的モニタリングを許可しないが、むしろ終点で薬の効果の評価になります。このプロトコルは、リアルタイムで病変を追跡することができ、子宮内膜症モデルで臨床薬の治療の可能性を探索するより便利です。このように生成されたモデルの主な制限は、非侵襲的モニタリングが不可能である広告ウイルス episomal 式のための時間の長い期間にわたってです。
Introduction
子宮内膜症は、子宮腔外機能性子宮内膜の着床による慢性婦人科疾患です。異所性の病変は、成長し、慢性の骨盤の痛みや不妊症の1につながる炎症性プロセスを誘発します。10-15% の生殖年齢の女性には受けないこと endometriosis2、推定されている、不妊女性3の約 40-50% であります。子宮内膜症の現在の薬理学的治療法は病変を完全に根絶することができないと副作用4、5の自由ではないです。効率的な治療法の研究は人間の病変を適切にまねることができます、その化合物の他の中の病巣の大きさに及ぼす影響を密接に評価することができますこのような方法で子宮内膜症の既存の動物モデルの洗練が必要です。
打ち込むこと異所性病変の組織学的に同一と人間6,7,8; のように似たようなサイトでは、子宮内膜症を模倣する霊長類モデルを使用されています。ただし、倫理的な問題や高度の経済コストに関連する制限の霊長類での実験の使用9。その結果、子宮内膜症の生体モデルの実施のため特に齧歯動物、小動物の使用は、個人10,11の大きい数を用いる調査のためそれを支持する続けています。子宮内膜症によって誘導されうるこれらの動物の齧歯類子宮角 (「相同モデル」)12,13の部分または異所性サイト (異種モデル) ヒトの子宮内膜・子宮内膜症組織を移植14.人間と対照をなして齧歯動物は自分の子宮内膜組織を流したか、それにより子宮内膜症が開発されない自発的にこれらの種の。したがって、子宮内膜症のモデルと異所性マウス子宮組織を注入したという事実のために批判されている同種のマウスはひと子宮内膜症病変15の特性を反映しません。
子宮内膜症の適切な生理は、子宮内膜症免疫不全動物に新鮮なひと子宮内膜の断片を注入する、異種モデルでまねることができます。異種従来終了点では、興味の化合物の治療効果一般的ノギス16を使って病巣の大きさの評価によって評価されます。明白な制限など、エンドポイント動物モデルは許可されている注入ダイナミクスや時間の経過とともに子宮内膜症病変を勉強します。追加の制限は、キャリパーの使用は、病巣の大きさの正確な測定を許可しないことです。確かに、キャリパーによって提供される標準誤差は、サイズが実際の変化を検出するこれらのツールの容量を制限する、マウスに注入病変の大きさと同じ範囲 (ミリメートルなど) でです。
このような制限を克服するためにここで、我々 は移植人体組織が記者 m 桜の蛍光蛋白質を表現する設計は子宮内膜症の異種マウス モデルの生成をについて説明します。適切なイメージを用いた蛍光信号の検出は、リアルタイムでそのサイズの同時定量と病変の状態を非侵襲的監視できます。したがって、我々 のモデルは、病巣の大きさでより客観的、バリエーションの正確な推定を実行するリアルタイムの非侵襲的モニタリングの機会と可能性をもたらす、エンドポイントの従来モデルと比較して明確な利点を提供します。
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Protocol
人体標本の使用は、制度検討委員会と病院ウニベルシタリオ La Fe の倫理委員会によって承認されました。すべての患者には、書面によるインフォームド コンセントが用意されています。動物を含む研究は、セントロ ・ デ ・ Investigacion プリンシペ フェリペ ・ デ ・ バレンシア ・機関の動物の世話委員会によって承認され、すべてのプロシージャを行った国立衛生研究所からケアと哺乳類の使用に関するガイドラインに従う健康。
1. 子宮内膜組織の採取と前処理
- カニューレの吸引装置に接続されているを使用して人間の子宮内膜吸引の質の良い生検を取得します。生検を滅菌生理食塩水と穏やかな手動攪拌と洗浄を 10 mL の入ったフラスコに注ぐ。
注:質の良い生検を取得する手順については、前述の17をされています。 - 残っている血液や粘液の生検を洗います。組織がきれいに観察されるまで必要に応じてできるだけ多く歯新鮮な生理食塩水を含むフラスコにティッシュを注ぐことによって、プロセスを繰り返します。
- 溶液 10 mL に健康的な外観を持つ転送生検フラグメントは、10% の胎仔ウシ血清 (FBS) と 1% の抗生物質抗真菌薬ソリューション ダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) 培地を完了します。
- コンテンツを 10 cm シャーレに入れて、組織を刻んでメスのペアと 5-10 mm3個セットに進みます。
2. 子宮内膜の断片のアデノ ウイルス トランスフェクション
注:プロセスで使用しているすべての材料は事前にボンネットの導入必要があります。すべてのプロセスで使用し、漂白剤とフラスコを配置するつもりはないことを取る。アデノ ウイルスのベクトルと接触するすべての材料は、バイオハザード容器にそれを破棄する前の漂白剤で消毒する必要があります。
- 生検はみじん切りされている、新しいシャーレを取る。全体の料理全体に広がる複数の 30-50 μ l 添加 DMEM 滴をピペットします。彼らは接触に来ていないので滴間十分なスペースを残してください。
- 注射器の針で助けられ、それぞれの媒体の滴内のフラグメントの単一のピースを配置します。
注:各ドロップは、子宮内膜の単一部分を含める必要があります。 - ソリューションを準備、広告 mCherry 作業 1:20 mCherry アデノ ウイルス原液 [1 x 1010 pfu/mL] の希釈することによって) DMEM に抗生物質 (DMEM + 10 %fbs をフィルター選択) なし中。
- フラグメントがペトリ皿滴 (手順 2.2) で利用可能な多くの井戸を埋める 96 ウェル プレートのウェルあたり広告 mCherry ソリューションの 100-200 μ L を分注します。さらに、ネガティブ コントロールとしてアデノ ウイルス無料 DMEM 培地で少なくとも 3 井戸を埋めます。
- 注射器の針で助けられ、96 ウェル プレートで広告 mCherry ソリューションを含む井戸のそれぞれに各シャーレ (手順 2.2) でフラグメントを転送します。
- 16 時間で 5% CO2と 37 ° C の定温器に広告 mCherry ソリューションと子宮内膜の断片を含む 96 ウェル プレートを配置します。
- 残りのアデノ ウイルス完全 DMEM 培地に満ちて新しい 96 ウェル プレートに組織を転送することによって媒体のうち洗浄 (抗生物質・抗アデノ ウイルス無料) 24-48 h の 5% CO2と 37 ° C の孵化と。
注:すべてのウェル プレートとバイオハザード容器に捨てる前に広告ウイルスと接触したヒントを漂白剤でカバーしてください。 - インキュベーターからプレートを取り出して 568 で蛍光顕微鏡下に置く最適なラベリングをテストする nm (赤のチャネル)。
- 最も華麗なフラグメントを選択し、新鮮な完全 DMEM 培地と新しい 96 ウェル プレート (抗生物質・抗アデノ ウイルス無料)。
- プラスチック パラフィン フィルム、プレート シールおよび受信者動物への子宮内膜の破片の注入の動物無料病原体の特定の領域にそれをトランスポートします。
3. 子宮内膜症マウス モデルの生成
注:6-8 週を使用して-古い無胸腺ヌード (または同様の免疫系統) 受信者の動物として、特定の病原体-無料条件で雌マウス。ホルモンの周期依存性変動と同時にエストラジ オールと燃料病変の成長を避けるためには、動物、17 βeta-エストラジ オール (17 E2) の 18 mg を含む卵巣摘出とで配置されて 60 日リリース カプセルです。卵巣とペレットの配置は、受信者の動物に子宮内膜の断片を移植の前に、少なくとも 1 週間実行する必要。
-
卵巣摘出術
注:フードで手術滅菌材料を準備します。麻酔機器や手術後の回復ゾーンを同じ部屋で準備を準備します。- マウスあたり 5 mg/kg の用量でモルヒネ誘導体の皮下注射を行います。マウスの鎮痛剤として薬の効果が顕れてくるので注入後 30 分の残りの部分を聞かせてください。
- シール麻酔室に吸入麻酔装置と酸素とイソフルラン (2 %mg/kg) 流れ、数分間を接続します。
- イソフルラン麻酔室に動物をご紹介します。3-5 分待つし、動物が前足のいずれかを押すことによって完全に麻酔をチェックしてください。手術領域に動物を転送および呼吸気道を覆うイソフルラン麻酔ガスの連続的な流れでマスクを配置することによって麻酔を維持します。
- クロルヘキシジンを使用して領域を消毒した後に、鋭いハサミで股関節の高さで約横 0.5 cm の肋切開を実行します。
- 腹腔内へのアクセスを取得し、卵巣を囲む白い脂肪パッドを識別解剖鉗子で卵巣を撤回筋から皮膚を分離します。
- 吸収性縫合糸で卵管の周り結び目を卵巣を切除する前に適切な止血を確認して締めます。
- 6-0 吸収性縫合糸で筋層を終了し、6-0 の非吸収性縫合糸で皮膚を閉じます。消毒液で再び領域をクリーンアップします。
- 反対側の卵巣を削除する手順を繰り返します。
-
エストラジ オール ペレット インプラント
注:この時点でペレットを配置する卵巣摘出手術中に麻酔をかけられ、動物、世話をします。- 卵巣摘出術の手順の完了後すぐに首の周囲の消毒液で皮膚をきれいし、うなじに鋭いハサミで横皮下小 (0.5 cm) 切開を行います。
- はさみを使用すると、ペレットを配置するのに十分な大きさのポケットを作る筋肉から肌を分析します。
- 17 β-E2の 18 mg を含有ペレットを挿入し、6-0 の非吸収性縫合糸で皮膚を縫合します。消毒液で再び領域をクリーンアップします。
- 回復ゾーンの動物を置き、長期的な回復期間を緩和する鎮痛の至適投与量を管理します。
-
子宮内膜のインプラント手術
注:少なくとも子宮内膜片移植手術を開始する前に卵巣摘出術後後の動物の完全な回復を許可するように 7 日間の検疫期間を許可します。組織のラベリングに最適な同期は、生検植の長期培養を避けるために移植手術の前に 2-3 日を収集します。- 特定病原体フリー ゾーンで手術室の準備を事前に。またすべての必要な手術材料、麻酔機器や手術後の回復ゾーンとフードを準備します。
- 部屋に動物をもたらす、各マウスに 5 mg/kg の用量でモルヒネ誘導体の皮下注射を行います。マウス薬の鎮痛薬の効果が明らかにすることができますので注入後 30 分の残りの部分を聞かせてください。
- シール麻酔室に吸入麻酔装置と酸素とイソフルラン (2 %mg/kg) 流れ、数分間を接続します。
- 手術を開始する前に蛍光を有する板、ボンネットに (ステップ 2.10) からのフラグメントをラベルそれを開封し、フラグメントを扱いやすくするためのシャーレに注ぎを移動します。
- イソフルラン麻酔室に動物をご紹介します。3-5 分待つし、動物が前足のいずれかを押すことによって完全に麻酔をチェックしてください。手術領域に動物を転送および呼吸気道を覆うイソフルラン麻酔ガスの連続的な流れでマスクを配置することによって麻酔を維持します。
- 麻酔下の動物の場所が立ち向かいます。腹側領域を消毒します。鋭いハサミで腹部に縦 1.5 cm の切開を行うし、筋肉から皮膚を分離します。その後、腹腔内にアクセスする筋縦 1.5 cm の切開を実行します。
- ミニ鉗子で腹部の筋肉の壁の左端を押しながら外側に腹膜の内側の面を公開しようとすると、それを折る。
- ミニ ピンセットで子宮内膜のインプラントを取る、簡単に n ブチル シアノアクリ レート系接着剤に浸すし、腹膜に配置、それは接続を取得します。数秒で乾燥させます。3.3.6 と 3.3.7 腹膜の側にインプラントを配置する手順を繰り返します。
- 6-0 吸収性縫合糸で筋層を閉じるし、6-0 縫合糸と非吸収性皮膚を閉じます。消毒液で再び領域をクリーンアップします。
- 回復ゾーンの動物を置き、長期的な鎮痛の至適投与量を管理します。
4. の In Vivo イメージング システムと生体内蛍光イメージング
- インビボ イメージング システム デバイスをオンに、プログラムを初期化し、数分の冷却 CCD カメラを許可します。
- 吸入麻酔装置を準備します。イソフルラン麻酔チャンバーに分のカップルのための 2% 流れを開きます。後麻酔回復ゾーンを準備します。
- プログラムが開始され、CCD カメラが冷えてきた後は、イメージング ウィザードツールをクリックして: チュートリアルから始まる一連の連続したウィンドウ表示、各 1 つのいくつかの関心のパラメーターに対応するオプションを選択する利用可能対応するボックスをクリックします。各ウィンドウで適切なボックスを選択してチュートリアルに進むし、パラメーター、次の一連の次のセットに移動する[ok]ボタンをクリックします。
- 蛍光パラメーターのEpiluminescence ボックスをオン、フィルターのペアのパラメーターにmCherry ボックスをオンにします。写真モードとフォーカスの確認ボックスを確認、露出パラメーターの自動ボックスを選択します。
- 楽器が設定されている一度麻酔チャンバー内 1 匹の動物を移動します。完全に麻酔したとき、生体内でイメージ投射システム ケージの中の動物を転送、麻酔器に接続して尿細管中の頭側を上に置きます。蓋を閉めるし、監視の [取得] をクリックします。
- (合計 5 枚の画像、選択フィルターのペアごとに 1 つのイメージ) を表示される画像を取得し、名前を付けて保存] をクリックしてデータを保存します。後麻酔回復の領域にマウスを移動します。残りの動物とプロセスを繰り返します。
- 2 つの監視を繰り返す、または時間経過中に適切にフォロー アップ信号を週に 3 回します。
- CO2窒息によって時間のコースの終わりに動物を犠牲に進みます。
5.体内蛍光画像の定量化
-
実際の蛍光画像の分離を介しての分離:
- In Vivoイメージング解析結合ソフトウェア プログラムを開きます。
- 分析を開始する"Sequenceinfo"ファイルを選択します。2 つのウィンドウが表示されます:「シーケンス ビュー」と「ツール パレット」。ツール パレットを選択し、メニューが表示された後は、次のオプションを選択します。
- 修正を選択し、適応フロリダ背景差分の発光画像データから望ましくない蛍光信号を削除するボックスをクリックします。最大の関心のしきい値を選択し、設定をクリックします。
- スペクトル Unmixingをクリックして、関心の分離 (ライブラリ、ガイド付き、自動または手動) を選択する方法の波長を選択し、開始 Unmixをクリックします。
- MCherry 信号に対応するUnmixed画像を選択し、ダブルクリックします。新しいウィンドウは、目的の信号の最終的なイメージが表示されます。
- 5.1.3 のステップを繰り返します。
- オプション: unmix 結果の代表的なイメージ (JPEG) が必要な場合は、ツール パレットで目的の設定を選択します |。画像の調整(カラーテーブル、ビニング、コントラストなど).、しエクスポート グラフィックを unmix ウィンドウで現在のイメージ ビューをイメージとしてエクスポートするをクリックします。
- 混じり気のないファイルを保存:ファイル |付けて保存 |フォルダーを選択 、[ok]。
- 監視の日の残りの部分とすべての動物とプロセスを繰り返します。
-
Roi を設定し、信号の定量化
- 参照] をクリックし、混じり気のないファイルを選択 (ステップ 5.1.8 を参照) 分析する興味の。新しいウィンドウが表示されます。
- 異なる時点でそれぞれの動物から混じり気のないすべてのファイルをインクルードし、ロードとして A グループのクリックする一覧に追加をクリックします。すべての画像はする必要があります 1 つのシーケンスとして表示されます。
- ツール パレットのウィンドウに行く: 同じ規模ですべてのイメージを取得する個々のスケール ボックスをオフ クリックします。
- シーケンスの 1 つの画像をダブルクリックし、次のシーケンスを使用して興味のゾーンに投資収益率を作成します。ROI ツールに行くとコントゥールと自動 1オプションを選択、表示される円の図形をクリックして、蛍光信号を中心に置き、表示されているウィンドウの作成をクリックします。
注: これは自動的にバック グラウンド値 (すなわち, 病変) の上の蛍光の強度を持つピクセルを強調表示、アウトライン表示のピクセルを包含する領域を持つ図形を生成します。 - 作成した ROI の図形をコピーして貼り付けるバック グラウンド ゾーンに信号がないです。
- メジャー ・ ロワをクリックして |[すべての蛍光強度の値を表示します。マウスでデータ値を選択、右クリック、コピーを押して、スプレッドシートに貼り付けるに進みます。
6. データ (蛍光信号) の正規化
- 信号強度は最大最初の時間ポイントを選択します。数式を使用して時間の各ポイントで信号の正規化に進みます。
信号強度の時間の各ポイントで最大の信号強度が経過中にみ) x 100。
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Representative Results
ここで、非侵襲的なので子宮内膜症病変のアーキテクチャが、免疫不全マウスにひと子宮内膜の蛍光に分類された部分をはめ込むことによって保持されます異種モデルを作成するためのプロセスを説明します。病変の進行を監視できます。子宮内膜の断片のラベリングは、エクスプレス mCherry、近赤外領域の蛍光を発するタンパク質に設計されたアデノ ウイルスの感染によって実現されます。図 1、広告 mCherry に感染した人間の子宮内膜のフラグメントの画像は蛍光顕微鏡で観察した代表を紹介します。説明のためにラベルおよび非標識のフラグメントが含まれているので感染・非感染の組織 (蛍光) と蛍光の違いに注意することができます。MCherry の参照波長に加えて、監視中に蛍光画像は組織の特徴的な蛍光発光分布を定義する励起/蛍光波長フィルター (図 2) の異なるペアで撮影されます。このアクションの目的は、"unmix"から背景と宿主組織によって放出される蛍光の病変によって放出される実際の蛍光と瘢痕の手術の間にそれぞれ由来することです。Unmix プロセスの説明の例を図 3に示します。病巣の大きさの変動の推定は、定量化し、経過中に病変によって放射される蛍光信号の正規化によって実行されます。この目的のため各時点の中に動物によって放出される生の蛍光を含む監視の画像最初でまとめると正規化されていない (図 4) 単一のファイル。その後蛍光は混じり気のない、正規化と偽色のイメージ (図 5) として表されるです。最後に、Roi 特定の病変と背景が自動的にプログラムによって認識され、定量化を信号に対応する (図 6)。背景の ROI の信号強度が最大になる時点に対してポイントが正規化されたたびに病変 ROI シグナリングと強度の結果から減算されます (図 7)。監視プロセスの終わりに、数週間後手術マウスを犠牲にし、実行可能なインプラントを回復することができます添付マウス腹膜 (図 8)。
図 1: Ad mCherry 感染後蛍光顕微鏡で子宮内膜の断片の視覚化します。(A) ひと子宮内膜片肯定的なサンプルとして 24 h 中に広告 mCherry の 37 ° C、5% CO2で培養しました。(B) ひと子宮内膜のフラグメントは、否定的な制御サンプルとして広告 mCherry なしの 37 ° C および 5% の CO2で培養しました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: によって放出される生のイメージング蛍光標識マウスに注入したフラグメント。画像は、特定の時点で同じ動物によって放出される未加工の蛍光信号の代表的な画像を示しています。画像は、監視セッション中に生体内イメージング システム デバイスに結合されたソフトウェアを使用して得られたスクリーン ショットに対応します。マウス (左に 1-5 の番号) を含む各パネルは蛍光画像を取得するための異なる特定の励起/蛍光ペア フィルターを使用して観察に対応します。(ツール パレット) 右のパネルに表示画像の取得の選択した蛍光パラメーターこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 病変によって放出されるバック グラウンド vs 特定蛍光分離します。病変を用いたイメージング システムを使用してから実際の蛍光を分析する実行される分離プロセスの代表的なイメージ画像が表示は、ソフトウェアを結合しました。左側のパネルでグラフは、蛍光性の放出の正規化された特定のプロファイルを示すには瘢痕 (グリーン ライン、UMX1)、病変 (赤い線、UMX2)、ホスト組織 (青線、UMX3 パネル)。異なる発光波長 (x 軸) での蛍光強度は、放射効率 (y 軸) の単位で表されます。どのようにそれぞれの特定の構造 (すなわち、傷跡、病変およびホスト組織のラベル付き) を発する具体的にフォームを識別して、それらの分離を可能にする異なった蛍光性プロファイルお互いに注意してください。病変 (UMX2) とホスト組織 (UMX3) は右のパネルでは、瘢痕 (UMX1) の具体的な排出プロファイルの起動から生じる蛍光マウスの写真画像に重畳表示されます。複合材料 (コンポジット) のイメージは傷跡やホストの組織によって放出されるから病変によって放出される蛍光の分割を示す例示目的のため含まれています。中央のパネルは、インビボ イメージング デバイスに結合画像ソフトウェアが分離に対して選択したパラメーターを示していますこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: コースの病変によって放出される生の蛍光観察。パネルには、ラベルの付いた人間病変 (鮮やかな黄色の斑点) 経過中に注入したマウスのシングルによって放出される生の蛍光の代表的な画像が表示されます。術後監視が実行された時点では「日 (番号)」として示されます。排出広告励起ペア フィルターを監視するために使用、各パネル/画像で示されます。各パネルは、蛍光の取得の日付に関連する情報を含む上部に固有のコード (BKG) によって識別されます。
図 5: 病変によって放出される蛍光を正規化時間コース監視します。純粋に対応する代表的な画像、正規化蛍光シグナル人間病変 (虹色の斑点) 時間の間に単一のマウスの重畳によって放出されるコース (手術後日)。術後監視が実行された時点では「日 (番号)」として示されます。各パネルは、下部に蛍光が取得された日付に関連する情報を含む特定のコード (BKG) によって識別されます。右側の虹のパレットの色は、各時点での病変によって放射される蛍光強度 (放射効率) を識別します。経過中に初回ポイント (1, 5, 8 日に病変部に赤色など) の低下の間にどのように強力な蛍光強度に注意してください (すなわち,ブルー色病変 20, 25 日に)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6: 時間経過時病変における蛍光強度の定量化のための Roi の使用。図時間経過の間に単一のマウスの病変によって放出される正規化された蛍光画像のパネル (すなわち, 図 5) 蛍光強度の定量化・ ロワ (病変と背景の輪郭を描く) の追加。投資収益率 ROI 1・2 時間中に各 2 つの病変によって放出される蛍光量を特定します。BKG が経過中にホスト組織 (背景の蛍光性) によって放出される蛍光の量を識別します。背景の蛍光性は定量化のため・ ロワから差し引かれます。術後監視が実行された時点では「日 (番号)」として示されます。取得した (最初の 8 桁の (年 (2014-10) 月) と日 (31 に 10) の BKG 詳細データを次) は特定のコード (BKG) が蛍光で日付に関連する各 1 つ含む情報の下部にラベルの付いた各時点で取得した画像は、、個体識別コード (6 桁) と右側の分離 (UMX2) 虹パレット色に使用される蛍光性の放出の特定のプロファイルでの病変によって放射される蛍光強度 (放射効率) のビジュアル スケールを提供しています。各時間のポイント。注 2 病変 (ROI1 と ROI2) の蛍光強度値が高い初回ポイント (日 1、5) と時間ポイント最後に最小値に到達する経過中に崩壊 (20 と 25 日間)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 7: 経過中に蛍光強度の正規化します。上部の表は、注入マウス (R25) 病変 (ROI1 と ROI2) というラベルの付いた 2 つの mCherry によって放出される蛍光強度 (放射効率) の値の説明の例を示します。経過中に蛍光の監視 (D5 D25) の手術後、別の日に行った。D5 - 下部にあるグラフは、腐食の時間のコースの中に mCherry に感染して病変によって放出される正規化された蛍光の典型的なパターンを示しています。Y は、数式を使用して崩壊の割合を表現する正規化蛍光の値を示しています (信号強度各時点の最大信号強度が経過中にみ) x 100。時間ポイント (日 (Dx) 移植手術後) の蛍光をモニターしていたに x 軸に示されています。手術後最初の 24 時間中にシグナル伝達の最初の増加をメモ、病変、D1 D5 とその後続の崩壊時間コースの間に mCherry の episomal 式のため周りの蛍光強度のピークの安定化に対応するをクリックしてください。この図の拡大版を表示するのにはここで。
図 8: 注入の子宮内膜症病変の肉眼。代表画像表示犠牲に監視プロセスの終わりにマウスに注入した子宮内膜症の病変の肉眼この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
ここに詳細なプロトコル記述する子宮内膜症の病変のアーキテクチャのアーキテクチャによって維持される放出される蛍光のリアルタイム評価を同時にできるようにしながら mCherry の動物モデルの実装子宮内膜組織をラベル付けします。このプロトコルでは特定のインビボ イメージング システムとラベルの病変によって放出される蛍光を非侵襲的評価に関連するソフトウェアの使用をについて説明します。各ユーザーは、特定のイメージング デバイスと自らの研究機関で利用可能な関連するソフトウェアに応じてプロトコルを適応すべき。麻酔下の動物を用いたイメージング システムに結合イソフルラン麻酔ガス麻酔機を通じて行う監視します。傷によって放出される自動蛍光との干渉を避けるためには、病変蛍光注入手術後少なくとも 3 日間の監視を開始することをお勧めします。
子宮内膜症 1 つここに示すような異種マウス モデルは、緑色蛍光タンパク質 (GFP)18,19ラベルの付いた着床子宮内膜片から成る以前記載されています。ただし、人間の組織をタグ付けの記者として mCherry の使用で前者の強化組織普及のため GFP 優位。その大きな発光スペクトルと高い光安定性のため mCherry は腹腔内のフラグメントの可視化に適している明るい信号を出力します。
サイズが小さいためアデノ ウイルス感染症のための選択のベクトルである (すなわち、ラベリング) と全ティッシュ部分の 3 D 構造を許容可能な拡散を提供します。であってもそれと感染した細胞の割合は 30-35% 以上ではありません。したがって、このモデルの制限は、組織、さらに一過性発現アデノ ウイルスによる達成の非効率的なラベルに依存します。確かに、広告ウイルスの episomal 一過性発現により徐々 に消えていく、蛍光は 4-6 週間を超えて監視できません。ラベル付けの効率性とモニタリングの期間は、ドナー組織を混乱させると広告-ウイルス注入されている受信者マウス19,20前に隔離された単一上皮/間質細胞への感染によって増加するかもしれない。このようなアプローチは、しかし、動物モデルが子宮内膜症の生理学を模倣して異所性人間病変によく構造化ではなく単一の上皮/間質細胞の無秩序蓄積それが構成されていないことを範囲を縮小します。子宮内膜症の組織。
このプロトコルでは最も重要なステップは、特に広告ウイルスの最適な感染に必要な適切な濃度の定量組織とほとんどのラベルです。確かに、プロトコルで指摘 1 × 1010 pfu/mL の濃度は、主は私たちの経験に基づくコンセンサス/サンプル図です。最適な濃度は、種類および生検および/またはどのように迅速にこれを処理の品質に応じて各実験で異なる場合があります。したがって各実験で、少なくとも 3 つの異なる (2 倍) 抗体のテストを提案し、蛍光顕微鏡下で可視化に基づく最適な表示を提供する 1 つを選択します。
我々 のプロトコル/モデルは確立と子宮内膜症の病変の早期開発に関与するメカニズムの研究に有用です。監視の時間が拘束されて、モデルは研究、薬理学的化合物の抗血管新生や抗エストロゲン薬など時間の短い期間で病巣の大きさに劇的な効果を発揮することができるの影響を検出するのに役立ちます。前臨床モデル子宮内膜症における薬物の広い範囲の治療の可能性を探求する統合技術として非侵襲的モニタリングを普及より効率的かつ耐久性のあるヒト組織をラベリング手法の開発が期待されています。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この作品はスペイン経済省ミゲル サーブレット プログラム [CP13/00077] (欧州地域開発基金) のフェダーによって共同設立を通じて競争力に支え、授与カルロス III 健康研究所助成金によってと同様、R をゴメス博士に授与Dr R をゴメス [PI14/00547 と PI17/02329] して教授 A. カノ [PI12/02582]。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Endosampler™ | Medgyn | 22720 | Cannula for sampling the uterine endometrium |
| DMEM Medium | VWR | HYCLSH30285.FS | Medium |
| Ad-mCherry | Vector Biolabs | 1767 | Adenoviral vector expressing mCherry |
| PBS, 1x solution, sterile, pH 7.4 | VWR | E504-500ML | Buffer for washes |
| Pellets 17-B-Estradiol 18 mg/60 days | Innovative Research of America | SE-121 | Hormone pellets for rodents |
| Vetbond™ Tissue Adhesive | 3M | 780-680 | Tissue adhesive |
| Petri dishes in polystyrene crystal | Levantina | 367-P101VR20 | Petri dishes |
| Penicillin-Streptomicin | Sigma | P4333-100ML | Antibiotics |
| Syringes, medical 10 mL 0.5 ml | VWR | CODA626616 | Syringes |
| Nitrile gloves, powder-free | VWR | 112-2754 | Gloves |
| Soft swiss nude mice | Charles River | SNUSSFE05S | Mice for animal experiment |
| Ivis Spectrum In vivo Imaging system | Perkin Elmer | 124262 | In vivo Monitoring equipment |
| Living Image® (Ivis software) | Perkin Elmer | --- | In vivo monitoring software |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10082147 | Enrichment serum |
| 96-well cell culture treated plates | Life technologies | 167008 | Culture plates |
| Urine flasks | Summedical | 4004-248-001 | Flasks for washes |
| Sterile surgical blades | (Aesculap Division) Sanycare | 1609022-0008 | Surgical blades |
| Isovet 1,000 mg/g | B-BRAUN | --- | Isoflurane (Anesthetic) |
| Buprex® 0.3 mg | Schering Plough S.A. | --- | Buprenorphine (Analgesic solution) |
| Injectable morphine solution 10 mg/mL | B BRAUN | --- | Morphine (Analgesic solution) |
| Monofyl® Absorbable Sutures | COVIDIEN | --- | Sutures |
| Desinclor chlorhexidine | Promedic SA | --- | Antiseptic solution |
| Microscopy DMi8 | Leica Mycrosystems | --- | fluorescence microscope |
| Hera Cell 150 Incubator | Thermo Scientific | 51026282 | Incubator |
References
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