Summary
هنا يصف لنا وضع بروتوكول لتصور استهداف محواري مع بروتين الفلورسنت في الساقين الكبار من المورفولوجية التثبيت والمتصاعدة، والتصوير، والتصوير بعد انتهاء الخطوات.
Abstract
نفذت معظم العمل لمواصفات الخلايا العصبية في نماذج أصعب وراثيا وفسيولوجيا مثل ج. ايليجانس، اليرقات المورفولوجية ، والأسماك، والتي جميعها الانخراط في حركات أوندولاتوري (مثل الزحف أو السباحة) كطريقة أساسية للحركة. ولكن أكثر تطورا فهم المواصفات الفردية الخلايا العصبية الحركية (مينيسوتا) – على الأقل فيما يتعلق بإبلاغ علاجات الأمراض – يطالب نظام يستهدف أيضا أفضل نماذج مخططات الحركة المعقدة القائمة على أطرافهم الفقاريات. النظام الحركي المورفولوجية الكبار المسؤولين عن المشي تلبي جميع هذه المعايير بسهولة، في هذا النموذج أنه من الممكن لدراسة مواصفات عدد صغير من الساق تمييزها بسهولة MNs (حوالي 50 MNs كل جولة) كلا استخدام واسعة مجموعة من الأدوات الوراثية قوية، وفي سياق الفسيولوجية لوضع خطة تحرك تستند إلى طرف من أطرافهم. هنا يصف لنا وضع بروتوكول لتصور تعصيب عضلة الساق في يطير الكبار.
Introduction
مثل الفقاريات أطرافهم، وساقه الكبار المورفولوجية ينقسم إلى شرائح. ويتضمن كل ساق يطير عضلات 14، كل منها يضم عدة ألياف العضلات1،2. تقع جثث خلية MNs الساق الكبار في T1 (بروثوراسيك)، T2 (ميسوثوراسيك)، والعقد T3 (ميتاثوراسيك) على كل جانب من الحبل البطني العصب (فنك)، هيكلي مشابه للحبل الشوكي الفقاريات (الشكل 1). وهناك ما يقرب من 50 MNs في كل العقد، التي تستهدف عضلات في أربعة أجزاء من الساق عن (كوكسا، تروتشانتير، وعظم الفخذ، والساق) (الشكل 1)3. الأهم من ذلك، يحتوي كل ساق الكبار الفردية MN هوية فريدة من نوعها مورفولوجية التي هي النمطية للغاية بين الحيوانات3،4. كل هذه MNs فريدة مستمدة من 11 من الخلايا الجذعية، يسمى نيوروبلاستس (مكتب الإحصاء الوطني) المنتجة للمحطة MNs خلال مراحل اليرقات3،4. في نهاية كل مراحل اليرقات تفرق MNs بوستميتوتيك غير ناضجة أثناء التحول للحصول على العرش الجذعية محددة وأهداف المحطة الطرفية محواري التي تعرف بهم مورفولوجيا فريدة من نوعها3،4. سابقا قمنا باختبار الفرضية القائلة بأن مدونة اندماجي لعوامل النسخ (TFs) تعين مورفولوجية فريدة من نوعها لكل ساق المورفولوجية الكبار MN5. كنموذج، قمنا باستخدام النسب ب أحد الأنساب NB 11 التي تنتج سبعة من أصل MNs وأثبتت أن مدونة اندماجي TFs المعرب عنها في الساق الكبار بوستميتوتيك MNs يملي على مورفولوجيس الفردية. قبل ريبروجرامينج مدونة TF MNs قد تمكنا من تبديل MN مورفولوجيس بطريقة يمكن التنبؤ بها. ونحن ندعو هذه TFs: mTFs (TFs المورفولوجية)5.
واحدة من أصعب الأجزاء من التحليلات المورفولوجية للكبار MNs تصور محاور عصبية عن طريق بشرة سميكة والسيارات-فلوري بدقة عالية. نحن عادة ما تسمية محاور عصبية مع معلم غشاء بروتينات فلورية خضراء التي يتم التعبير عنها في MNs مع نظام ثنائي تعبير، مثل دفجلوت-Gal4/UAS-mCD8::GFP أو دفجلوت-QF/QUAS mCD8::GFP، حيث دفجلوت تشكل دافعا قويا في 6من موتونيورونس. من خلال الجمع بين هذه الأدوات مع تقنيات الاستنساخ الأخرى مثل تحليل فسيفساء بعلامة ريبريسيبلي (ماركم)7، ورابطة الدول المستقلة-ماركم8أو ماركمبوو5، نحن يمكن تقييد التعبير التجارة والنقل للفئات السكانية الفرعية لإجراء تحليل المظهرية MNs من محاور عصبية أسهل. ونحن قد ولدت بروتوكول بغية إبقاء الساق مورفولوجيا محواري MN سليمة للتعمير 3D التصوير واللاحقة بمعالجة مسائل معينة مضمنة في الساق المورفولوجية الكبار مثل التثبيت (1) بشأن الهياكل الداخلية لفريق الخبراء البالغين دون التأثير على مورفولوجيا إكسون والتعبير الفلورسنت الذاتية، وعضلات الساق، (2) تركيب المحطة للمحافظة على الهيكل العام لإطار ساترة وفي الاتجاه المناسب للتصوير، و (3) معالجة للحصول على بشرة الصور الخلفية، فضلا عن إشارة الفلورسنت محواري. بينما هذا البروتوكول تفصيلي للكشف عن التعبير الفلورسنت في مينيسوتا محاور عصبية، أنه يمكن تطبيقها على تصور مكونات أخرى من الساق نيوروموسكولاتوري في المفصليات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-الساق التشريح والتثبيت
- تأخذ لوحة زجاج متعدد جيدا وتعبئة العدد المناسب من الآبار مع الإيثانول 70%. إضافة 15 – 20 CO2-الذباب تخديره (من الجنس وأي عمر) لكل منهما جيدا باستخدام فرشاة، بلطف ربت الذباب إلى الحل الإيثانول حتى الذباب مغمورة تماما.
ملاحظة: هذه الخطوة لإزالة hydrophobicity بشرة. عدم غسل لأكثر من 1 دقيقة، لأن هذا يزيد من السيارات-الأسفار بشرة. - شطف الذباب 3 مرات مع الحل المنظفات الفاعل النطاق 0.3% في 1 × الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). يبقى الذباب في هذا الحل لمالا يقل عن 10 دقيقة.
ملاحظة: أفضل ثابتة الساقين عندما بما في ذلك المنظفات، الذي من المرجح أن زيادة تغلغل مثبت داخل الساق. - ضع لوحة متعددة جيدا على الجليد جنبا إلى جنب مع أنبوب بارافورمالدهيد 4% (منهاج عمل بيجين).
ملاحظة: إعداد جديدة 4% منهاج العمل من 16% PFA إيثانول حرة أسهم حل أمر بالغ الأهمية. - استخدام الملقط لإزالة الرأس والبطن من الذباب دون إلحاق الضرر بالجزء المتعلق بالصدر أو الساقين.
ملاحظة: إزالة البطن يسهل عقد الطاير وتشريح الساقين. - تشريح الساقين من الجزء الصدري مع الملقط والساقين في الآبار التي تحتوي على 4% منهاج عمل بيجين. لهذا، دفع بلطف ولكن بحزم عند تقاطع كوكسا الصدر باستخدام طرف الملقط غرامة حتى ينفصل الساق.
- إصلاح ساقيه في 4% منهاج العمل بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية (حوالي 20 ح مجموع).
- تغسل الساقين مع 0.3% الفاعل النطاق الحل المنظفات في برنامج تلفزيوني 1 x، 5 x لمدة 20 دقيقة.
- استبدال غسالة المخزن المؤقت مع تصاعد المتوسطة. إبقاء الساق في وسط تصاعد لمدة يوم واحد على الأقل قبل تصاعد للسماح اختراق الساق كاملة.
ملاحظة: إذا كان متوسط التركيب عالية اللزوجة، تمييع المتوسط المتصاعدة إلى 80% مع برنامج تلفزيوني 1 x لأنه يمكن أن يسبب التغير المفاجئ في اللزوجة بشرة انهيار وتلف الهيكل العام لفريق الخبراء. اعتماداً على برنامج تشغيل Gal4 ، يمكن الحفاظ على الذباب 1 إلى 3 أسابيع في 4 درجات مئوية في تركيب وسائط حتى المتصاعدة.
2. تركيب المحطة
- وضع حوالي 20 ميليلتر من والغليسيرول 70% على الجانب الأيسر من الشريحة المجهر، والغطاء مع ساترة2 مربع 22 × 22 مم (الشكل 2 أ، ب). "الماصة؛" حوالي 10 ميليلتر من تصاعد المتوسطة على طول خط الموازي وعلى مسافة صغيرة من الحافة اليمنى لهذا ساترة. إضافة آخر ميليلتر 30 من تصاعد المتوسطة كذلك على الجانب الأيسر من الشريحة (الشكل 2).
ملاحظة: عند تطبيق ساترة على الساقين (انظر أدناه) المتوسطة المتصاعدة بلطف ستنتشر تحت ساترة وما حولها في الساقين دون تشريد لهم. - استخدام الملقط غرامة رفع الساق من الحل ووضعها بلطف على المتوسطة المتصاعدة قرب ساترة اليسرى. القيام بنفسه بالنسبة لكل ساق ومواءمتها من الأعلى إلى الأسفل (الشكل 2D).
- رفع ونقل الساقين في قطره متوسط الذي عقد بين كل النصائح الملقط. توجيه الساقين بطريقتين، هما: الجانب الخارجي لأعلى أو لأسفل.
- حالما يتم محاذاة بشكل صحيح جميع الساقين (حتى يمكن تركيبة على ساقيه إلى 6 – 8)، وضع ساترة ثانية أكثر الساقين أن هذا ساترة يعتمد قليلاً على ساترة الموضوعة سابقا (الشكل 2E) للسماح للفضاء بين ساترة والنسيج، وأن منع الساقين من الحصول على معطوب (الشكل 2).
ملاحظة: بدلاً من ذلك، استخدام الآبار ملصقا أو الشمع تقويم الأسنان لإنشاء مسافة بين ساترة والشريحة. - استخدام طلاء الأظافر تأمين موقف كوفيرسليبس في كل زاوية (الشكل 2 واو).
ملاحظة: الأنسجة جاهز الآن للصورة.
3-تصوير
- قم بإعداد مسار واحد على استخدام الليزر 488 نانومتر والكشف عن اثنين في نفس الوقت للحصول على كل من الأسفار بروتينات فلورية خضراء وبشرة السيارات-الأسفار. استخدام عنصر تحكم النطاق أو عرض شريط التمرير في الإطار الطيفية من إطار مسار الضوء من البرمجيات، وتعيين نطاق كشف واحد كاشف (كشف 1) بين 498 – 535 نانومتر والآخر (كاشف 2) بين 566-652 شمال البحر الأبيض المتوسط.
ملاحظة: عادة، الكاشف 1 يجب أن يكون جهاز كشف جاسب والكاشف 2 أنبوب ضوئي. قناة 498-535 على النحو الأمثل بالكشف عن إشارة بروتينات فلورية خضراء ولكن أيضا بالكشف عن السيارات الأسفار من بشرة. ومع ذلك، يكشف القناة 566 – 652 فقط صف السيارات من بشرة (الشكل 3A). - استخدام 20 X أو 25 X النفط الهدف الغمر، 1024 × 1024 بكسل، وعمق 12 بت، وتعيين تباعد ض 1 ميكرومتر. يسكن بكسل تعيين الوقت المايكروثانيه تقريبا 1.58، ومتوسط 2 إطارات/الصورة. استخدام الأهداف مع ارتفاع الفتحة العددية.
- قم بتعيين كافة الإعدادات الأخرى، اعتماداً على مجهر [كنفوكل] وبرامج التصوير المستخدمة.
- تأكد من الحصول على إشارة بشرة أكثر إشراقا من كاشف 566 – 652 بدلاً من كاشف 498 – 535. للقيام بذلك، استخدام القوة الليزر نفسه من 488-الليزر للكشف عن كلا. استخدام علامات الإشباع، أولاً ضبط كسب كاشف 1 للحصول على إشارة بروتينات فلورية خضراء مشرق بما يكفي (الشكل 3، د). ثم قم بضبط كسب كاشف 2 التأكد من أن بعض المناطق مع إشارة بشرة عالية (حواف الساقين والمفاصل) تنتج إشارة التشبع في هذا الكاشف (الشكل 3، E).
- حالة الساق ممتدة وكبيرة جداً بحيث يمكن تصويرها في إطار واحد، استخدم خيار بلاط أو الموقف من برامج التصوير المجهر.
- إعادة بناء الصور النهائية أما باستخدام المجهر الملكية برامج التصوير أو استخدام إيماجيج/فيجي مجانية (انظر أدناه).
4-وظيفة التصوير التجهيز
- افتح المكدس [كنفوكل] في إيماجيج/فيجي.
- استخدام البرنامج المساعد بيوفورماتس (الإضافات | بيو-تنسيقات | المستورد بيوفورماتس) في فيجي لفتح الصور التي ليست في. تنسيق TIF من الملكية التصوير حزم البرمجيات9.
- تقسيم القنوات عن طريق تحديد الصورة | لون | تقسيم القنوات.
ملاحظة: إذا قدمت الصور من عدة مواقع ويجب أن يكون معاد، استخدم في اقتران خياطة في فيجي من البرنامج المساعد (الإضافات > Stitching > خياطة بيرويس)10،11. - لاستقطاع إشارة بشرة من إشارة بروتينات فلورية خضراء، افتح "الحاسبة الصورة" (عملية | صورة الإله الحاسبة): حدد المكدس من كاشف 1 ك 1 صورة (بروتينات فلورية خضراء + بشرة) (الشكل 4A)، في إطار العملية حدد طرح، وحدد المكدس من كاشف 2 كصورة 2 (بشرة) (الشكل 4 باء). كنتيجة لذلك، يتم الحصول على فقط إشارة بروتينات فلورية خضراء الذاتية (التجارة والنقل) (الشكل 4).
- إعادة دمج هذا المكدس (بروتينات فلورية خضراء) مع مكدس 'بشرة فقط' التي تم الحصول عليها من كاشف 2 (الشكل 4 باء الصورة | لون | دمج القنوات) للحصول على صورة RGB تضم إشارة التجارة والنقل الخاصة بالانسجة، فضلا عن إشارة بشرة، مما يساعد على تحديد العرش إكسون داخل أجزاء الساق (الشكل 4).
- ضبط التباين والسطوع لكل صورة (صورة | ضبط | Brightness/Contrast) ومن ثم توليد صورة RGB واحدة (صورة | نوع | لون RGB).
ملاحظة: لإنشاء إسقاط الحد أقصى من Z-المكدس (صورة | مكدسات | المشروع Z...)، استخدم أقصى شدتها الإسقاط لإشارة بروتينات فلورية خضراء ومتوسط كثافة لبشرة، التي يمكن تعديلها ثم للسطوع قبل دمج القناتين.
- بدلاً من ذلك، استخدام ماكرو للطرح التلقائي ومعالجة الصور في إيماجيج/فيجي. نسخ النص في تكميلية 1 ملف في محرر الماكرو (الإضافات | جديد | الماكرو) وحفظ الماكرو في مجلد الإضافات وإعادة تشغيل إيماجيج/فيجي مرة واحدة لتكون قادرة على استخدام الماكرو.
- لاستخدام الماكرو، افتح المكدس [كنفوكل]، وفتح النافذة/السطوع (صورة | ضبط | Brightness/Contrast). ثم قم بتشغيل الماكرو (البرنامج المساعد | الماكرو | تشغيل) واتبع التعليمات.
- عندما طلب منه تحديد العملية (نافذة الحاسبة الصورة)، اختر الصورة 1 مكدس الذاكرة المؤقتة 1 (التجارة والنقل) والصورة 2 مكدس 2 (بشرة) و طرح.
ملاحظة: الماكرو تنشئ صورة إسقاط قصوى من إشارة بروتينات فلورية خضراء المجهزة (MAX_Result stack1)، إسقاط متوسط لبشرة (AVG_stack2)، نتيجة للطرح المكدس بشرة من المكدس التجارة والنقل (نتيجة stack1)، وغير المجهزة بشرة المكدس (stack2). - عندما طلب منه ضبط التباين، استخدم عناصر التحكم في نافذة التحكم بالسطوع/لضبط السطوع الصورة الإسقاط القصوى للتجارة والنقل، والإسقاط المتوسط لبشرة، لتوليد صورة RGB مدمجة لكلا إشارات تبين التجارة والنقل في الأخضر، وأهاب باللون الرمادي. دمج نتيجة stack1، و stack2، وبالمثل إنشاء كومة بروتينات فلورية خضراء وبشرة المجمعة التي يمكن استخدامها في المرحلة القادمة.
- تصور الساقين في ثلاثة أبعاد، استخدام البرمجيات 3D المتخصصة مع المكدسات الذي تم إنشاؤه حديثا (4E الشكل).
- افتح المكدس RGB باستخدام برنامج ثلاثي الأبعاد (انظر الجدول للمواد). في إطار حوار منبثق، حدد كافة القنوات في قسم التحويل وضع وإدخال حجم فوكسل (حجم بكسل).
ملاحظة: يرد كافة المعلومات الضرورية في ملفات الصور من برنامج المجهر الملكية أيا كانت قيد الاستخدام. - في القناة 2 وحدة نمطية (بروتينات فلورية خضراء إشارة)، انقر بالزر الأيمن واختر العرض | فولرين. ثم الأيسر في الوحدة النمطية فولرين. في المقطع خصائص (أسفل يسار الشاشة) انقر فوق يسار على تحرير وحدد volrengreen.col. في القناة 1 وحدة نمطية (بشرة إشارة) بزر الماوس الأيمن وحدد العرض | فولرين. ثم الأيسر في الوحدة النمطية فولرين. في الأيسر مقطع خصائص متقدمة و حدد التسريح وإعادة الإدماج (عرض شفافة مثل الأشعة)، ثم ضبط قيمة غاما لرؤية الخلفية بشرة (4E الشكل).
- لتوليد استدارة ثلاثية الأبعاد، انقر بالزر الأيمن على الوحدة النمطية مكدس الذاكرة المؤقتة للمشروع. ثم حدد تحريك | تدوير. الأيسر على الوحدة النمطية للتدوير.
- في خصائص المقطع انقر فوق استخدام مركز بوكس. في الوحدة النمطية تدوير زر الماوس الأيمن فوق وحدد حساب | صانع الفيلم. في الوحدة النمطية صانع الفيلم انقر فوق زر الماوس الأيسر. في المقطع خصائص الأيسر الأيسر على خيارات متقدمة (أعلى يمين المقطع خصائص).
- في الحقل اسم الملف ملء اسم تناوب الفيلم. في مجال نوعية الكتابة 1 (جودة كحد أقصى). ترك الإطار في 200 إذا كان هو المطلوب تناوب s 8.3 (هذا الرقم يمكن انخفض أو ارتفع إلى تعديل سرعة الدوران). ثم اضغط على تطبيق (الزر الأخضر، واليسار السفلي من المقطع خصائص (انظر الفيديو 1)).
- افتح المكدس RGB باستخدام برنامج ثلاثي الأبعاد (انظر الجدول للمواد). في إطار حوار منبثق، حدد كافة القنوات في قسم التحويل وضع وإدخال حجم فوكسل (حجم بكسل).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
كما هو موضح في الشكل 4، يسمح هذا الإجراء تصوير ممتازة من محاور عصبية المسمى بروتينات فلورية خضراء في الساقين المورفولوجية الكبار، جنبا إلى جنب مع بهم العرش المحطة الطرفية. الأهم من ذلك هو الحصول على إشارة بروتينات فلورية خضراء نظيفة دون أي تلوث من الأسفار تنبعث من بشرة الساق. ثم يمكن أن يقترن الإشارة من بشرة إشارة التجارة والنقل لتحديد الموضع من محاور عصبية في الساقين (4E الشكل، الشكل 1، والفيديو 1). خطيرة، من المهم الحصول على أرجل ثابتة جيدا. يبين الشكل 5 أمثلة حسن ثابت (الشكل 5A) وساق سيئة--ثابت (الشكل 5 (ب)). في الحالة الأولى الهياكل الداخلية داخل الساقين بلون موحد وتراتشيس، ومظلمة، تكون مرئية. تشغيل أنبوب القصبة الهوائية رئيسية في وسط كل قطعة من الساق (المجاورة لجذع العصب الرئيسي) وتشعبات كثيرة أرق مرئية أيضا. في الحالة الأخيرة، مادة مظلمة موجودة في طرسوس والساق والنظام الرغامى ليست واضحة للعيان في عظم الفخذ وكوكسا: في مثل هذه الحالات دائماً لوحظ أن الإشارة من البروتينات الفلورية المتدهورة بكثافة منخفضة أو منعدمة تماما. التشريح الثاني، دقيق الساقين أمر ضروري للحصول على جميع أجزاء الساق (من كوكسا إلى الساق) وتجنب الصدمات الميكانيكية في الساقين. ثالثا، يجب ترك الساقين في تصاعد المتوسطة طويلة بما يكفي لاختراق داخل الساقين. أحياناً تظهر أجزاء المحطة، لا سيما عظم الفخذ، أنهار – يمكن أن يكون هذا نظراً لعدم اختراق مثبت و/أو المتوسطة المتصاعدة. أخيرا، يجب استخدام أحد أهداف المجهر عالية الجودة، تصحيح للتسطيح ميدان، والمصممة خصيصا للأسفار و/أو اللازيغيه.
رقم 1: مخطط النظام المحرك الساق المورفولوجية الكبار- يتم ترجمة الهيئات الخلية في الساق الكبار MNs (الأخضر) في قشرة العقدة الصدرية لفنك (رمادي). MNs أربوريزي dendrites بهم في نيوروبيل الساق (الأزرق)، وإرسال على محاور عصبية في الساق يعصب إحدى عضلات الساق 14 (أحمر). لاحظ أن فقط الساقين T1 هي المخططة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: الإجراء جبل الساقين على شرائح المجهر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: التصوير الداخلي. (أ) الانبعاثات الأطياف للتجارة والنقل وبشرة الساق باستخدام 488 الإثارة ليزر الأرجون في شمال البحر الأبيض المتوسط، التي تم الحصول عليها باستخدام التصوير الطيفي للمقاطع الساقين معربا عن بروتينات فلورية خضراء وسيقان المورفولوجية التي لا تعبر عن التجارة والنقل على التوالي. علما بأن قد تم تطبيع كثافات الأسفار لا، مثلاً، من البيانات الأولية باستخدام نفس المعلمات (الهدف، تصاعد المتوسطة، طاقة الليزر، الفتحة [كنفوكل]، ومكاسب، والإزاحة) أما بالنسبة للمحطة التصوير الداخلي. كما هو موضح من windows للكشف عن استخدامه للتصوير على بروتينات فلورية خضراء + بشرة الفلورية (الكاشف 1: الأخضر) وبشرة (الكاشف 2: الوردي)، استناداً إلى الأطياف الخلفية بشرة مقابل التجارة والنقل. (ب، ج) القسم [كنفوكل] من الأرجل المسمى مع mCD8::GFP تحت سيطرة دفجلة-Gal4 الحصول عليها من كاشف 1 (ب) وكاشف 2 (ج). (د، ه) تشبع علامة الإعدادات المستخدمة للصورة (ب، ج) على التوالي (انظر نص الشرح): الأزرق لا تشبع إشارة حمراء. لاحظ أن في الكاشف 1 المسارات العصب الرئيسي المشبعة، بينما في كشف 2 بعض المناطق بشرة المشبعة (انظر الأسهم). شريط المقياس = 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: معالجة الصور باستخدام إيماجيج/فيجي- (أ) إسقاط ماكس مكدسات [كنفوكل] التي تم الحصول عليها من 498-535 نانومتر كاشف. (ب) الإسقاط ماكس المكدس [كنفوكل] تم الحصول عليها من 566-652 الكاشف شمال البحر الأبيض المتوسط. (ج) صورة مع بروتينات فلورية خضراء في إشارة فقط التي تم الحصول عليها عن طريق طرح (أ) من (ب). (د) دمج الصور من (ب) و (ج). (ﻫ) ثلاثي الأبعاد التعمير (ج). شريط المقياس = 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 5: عرض الطاقة المنخفضة من تشريح الساقين تظهر أمثلة جيدة (A) وسوء (ب) التثبيت. شريط المقياس = 200 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الفيديو 1: الفيلم المسمى بروتينات فلورية خضراء محاور عصبية (الأخضر) جنبا إلى جنب مع بشرة (رمادي) من leg. من فضلك انقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بالزر الأيمن التحميل.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
بشرة المورفولوجية الكبار والمفصليات الأخرى، التي تحتوي على العديد من الصبغات الداكنة، يشكل عقبة رئيسية لعرض هياكل داخل أجسامهم. وبالإضافة إلى ذلك، أنها بشدة الفلورسنت السيارات التي تتفاقم بالتثبيت. هاتان السمتان إشكالية جداً بالنسبة للملاحظات من الأصباغ الفلورية أو الجزيئات داخل الجسم للحيوانات مع الهيكل الخارجي.
الإجراء التي وصفناها، وأن نستخدم بشكل روتيني في المختبر غلة الصور نظيفة ومفصلة لمسارات إكسون وعلى النهايات الطرفية في الساقين المورفولوجية الكبار. الأهم من ذلك هو الحصول على إشارة بروتينات فلورية خضراء نظيفة دون أي تلوث من الأسفار تنبعث من بشرة الساق. هذه الميزة غير إلزامية من أجل أن تكون قادرة على تصور وقوانتيتاتي ميزات إكسون العرش باستخدام برامج 3D-التصوير ثلاثي الأبعاد. وبهذه الطريقة يمكن مقارنة البيانات التي تم الحصول عليها من عدة الساقين. الإجراء الذي يتم تكييفها بسهولة لمراقبة الإشارات من البروتينات الفلورية الأخرى، ويمكن استخدامها بسهولة في صورة محاور عصبية في سائر المفصليات الكبار.
الجوانب الحرجة اثنين للإجراء يتم ط) الحصول على إشارة قوية في التجارة والنقل، والتثبيت الثاني) سليم الساقين. لهذا الأخير بشكل روتيني نحصل على التثبيت جيدا، ومع ذلك بعض الساقين أحياناً ليست ثابتة بشكل صحيح. ولذلك، الإجراء الذي يحتاج إلى تحسين، ربما عن طريق إضافة العوامل التي تشجع على اختراق كواشف (مثل ديميثيلسولفوكسيدي)، أو وسائل أخرى للتثبيت (الميكروويف التثبيت، إذا فإنه يحافظ على الأسفار التجارة والنقل)، ولكن نحن لم استكشاف هذه الإمكانية وبصرف النظر عن استخدام خطوة بريينكوبيشن في برنامج تلفزيوني يتضمن تريتون (التي تحسنت بشكل ملحوظ التثبيت). من أجل الحصول على إشارة جيدة بروتينات فلورية خضراء نستخدم تشكل دافعا قويا دفجلوت-Gal4 (وتسمى أيضا OK371-Gal4). من الضروري أيضا أن استخدم مراسل جيد – ونحن نستخدم mCD8-التجارة والنقل، وحصلوا أيضا على إشارات جيدة مع هيولى بروتينات فلورية خضراء أو متشيري. بغض النظر، ونحن نستخدم الصحفيين التي تحتوي على عدة نسخ من المراسل الرئيسي (هيكساميريك) وعدد من النسخ من مواقع لكسو أو UAS .
حد من هذا الإجراء أنه ينطبق فقط على الأنسجة الثابتة. ونحن حاليا على وضع إجراءات للملاحظات في فيفو واختبار البدائل المختلفة (تركيب ومجاهر). الحد من استخدام الفحص المجهري [كنفوكل] أنه من الصعب لعرض عن طريق الساق كامل: وهذا يرجع لإشارات من المناطق العميقة الكذب مبعثرة الإشارة من التجارة والنقل من خلال الأنسجة السطحية. بدلاً من ذلك يسمح مجهر بيفوتون التصوير من خلال سمك الساق كاملة.
وأخيراً، استخدام أساليب أخرى أنواع مختلفة من تركيب وتثبيت4،12. أهمية وقوة لاجرائنا خطوة طرح فصل صحيح بروتينات فلورية خضراء إشارة من الإشارات الأخرى (cuticular أساسا) يتيح إعادة البناء ثلاثي الأبعاد ممتازة والتصور محاور عصبية وعلى العرش المحطة الطرفية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
ونحن نشكر رينار روبرت لإعداد الطعام ذبابة المتوسط. وكان هذا العمل مدعومة بمنحه المعاهد الوطنية للصحة NS070644 R.S.M. والتمويل من رابطة ALS (رقم 256) والعلاجات (#AJE20170537445) والبرنامج افينير ATIP على J.E.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol absolute | Fisher | E/6550DF/17 | Absolute analytical reagent grade |
| nonionic surfactant detergent | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100, for molecular biology |
| Fine forceps | Sigma-Aldrich | F6521 | Jewelers forceps, Dumont No. 5 |
| Glass multi-well plate | Electron Microscopy Sciences | 71563-01 | 9 cavity Pyrex, 100 mm x 85 mm |
| PFA | Thermofisher | 28908 | Pierc 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free |
| Glycerol | Fisher BioReagents | BP 229-1 | Glycerol (Molecular Biology) |
| Spacers | Sun Jin Lab Co | IS006 | iSpacer, four wells, around 12 μL working volume per well, 7 mm diameter, 0.18 mm deep |
| Square 22 mm x 22 mm coverslips | Fisher Scientific | FIS#12-541-B | No.1.5-0.16 to 0.19 mm thick |
| Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | Vectashield Antifade Mounting Medium |
| Confocal microscope | Carl Zeiss | LSM780; objective used LD LCI Plan-Apochromat 25X/0.8 Imm Korr DIC M27 (oil/ silicon/glycerol/water immersion) (420852-9871-000) |
|
| imaging software | Carl Zeiss | ZEN 2011 | |
| 3D-Image software | ThermoFisher Scientific | Amira 6.4 | |
| ImageJ | National Institutes of Health | https://imagej.nih.gov/ij/ | ImageJ/FIJI |
References
- Miller, A. The internal anatomy and histology of the imago of Drosophila melanogaster. Biology of Drosophila. Demerec, M. , John Wiley & Sons. New York, NY. 420-531 (1950).
- Soler, C., Ladddada, L., Jagla, K. Coordinated development of muscles and tendons of the Drosophila leg. Development. 131 (24), 6041-6051 (2004).
- Baek, M., Mann, R. S. Lineage and Birth Date Specify Motor Neuron Targeting and Dendritic Architecture in adult Drosophila. Journal of Neuroscience. 29 (21), 6904-6916 (2009).
- Brierley, D. J., Rathore, K., VijayRaghavan, K., Williams, D. W. Developmental origins and architecture of Drosophila leg motoneurons. Journal of Comparative Neurology. 520 (8), 1629-1649 (2012).
- Enriquez, J., Mann, R. S. Specification of Individual Adult Motor Neuron Morphologies by Combinatorial Transcription Factor Codes. Neuron. 86 (4), 955-970 (2015).
- Mahr, A., Aberle, H. The expression pattern of the Drosophila vesicular glutamate transporter: a marker protein for motoneurons and glutamatergic centers in the brain. Gene Expression Patterns. 6 (3), 299-309 (2006).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development. Trends in Neuroscience. 24 (5), 251-254 (2001).
- Enriquez, J., Rio, L. Q., Blazeski, R., Bellemin, S., Godement, P., Mason, C. A., Mann, R. S. Differing Strategies Despite Shared Lineages of Motor Neurons and Glia to Achieve Robust Development of an Adult Neuropil in Drosophila. Neuron. 97 (3), 538-554 (2018).
- ImageJ. Bio-Formats. , Available from: http://imagej.net/Bio-Formats (2018).
- ImageJ. Image Stitching. , Available from: http://imagej.net/Image_Stitching (2018).
- Preibisch, S., Saalfeld, S., Tomancak, P. Globally optimal stitching of tiled 3D microscopic image acquisitions. Bioinformatics. 25 (11), 1463-1465 (2009).
- Brierley, D. J., Blanc, E., Reddy, O. V., Vijayraghavan, K., Williams, D. W. Dendritic targeting in the leg neuropil of Drosophila: the role of midline signalling molecules in generating a myotopic map. PLoS Biology. 7 (9), e1000199 (2009).
