Summary
Aquí se describe un protocolo para visualizar la orientación axonal con una proteína fluorescente en piernas de adultos del Drosophila por fijación, montaje, proyección de imagen y la proyección de imagen de pasos.
Abstract
La mayoría del trabajo sobre la especificación neuronal se ha realizado en modelos genético y fisiológico manejables como C. elegans, Drosophila larvas y peces, que participan en movimientos ondulatorios (como gatear o natación) como su principal modo de locomoción. Sin embargo, una más sofisticación comprensión de la especificación de cada motoneurona (MN), por lo menos en cuanto a informar a terapias de la enfermedad, exige un sistema igualmente manejable que mejor modela los sistemas complejos basados en apéndices de locomoción de vertebrados. El adulto Drosophila aparato locomotor encargado de caminar cumple todos estos criterios con facilidad, ya que en este modelo es posible estudiar la especificación de un número pequeño de piernas fácilmente distinguido MNs (aproximadamente 50 minutos por pierna) usan una gran matriz de herramientas genéticas de gran alcance y en el contexto fisiológico de un sistema de locomoción basado en el apéndice. Aquí se describe un protocolo para visualizar la inervación del músculo de la pierna en una mosca adulta.
Introduction
Como la extremidad vertebrada, la pierna de adultos del Drosophila está organizada en segmentos. Cada pata de mosca contiene 14 músculos, cada uno de los cuales consta de múltiples fibras musculares1,2. Los cuerpos celulares de los MNs de pierna adulto se encuentran en la T1 (protorácico), T2 (mesotorácicos) y T3 (metathoracic) ganglios a cada lado de la cuerda ventral del nervio (VNC), un estructural análoga a la médula espinal vertebrada (figura 1). Hay aproximadamente 50 minutos en cada uno de los ganglios, cuyo objetivo los músculos en cuatro segmentos de la pierna ipsolateral (coxa, trocánter, fémur y tibia) (figura 1)3. Lo importante, cada pierna adulto individual MN tiene una única identidad morfológica que es altamente estereotipada entre animales3,4. Todos estos MNs únicas derivan de 11 células madre, llamadas neuroblastos (NBs) produciendo MNs de la pierna durante los estadios larvarios3,4. Al final de las etapas larvales todos los MNs postmitotic inmaduros diferencian durante la metamorfosis al adquirir sus árboles dendríticos específicos y objetivos terminal axonales que definen su morfología única3,4. Previamente hemos probado la hipótesis de que un código de combinatorio de factores de transcripción (TFs) especifica la morfología única de cada pata de adultos del Drosophila MN5. Como modelo, se utilizó el linaje B, uno de los 11 linajes NB que produce siete de los MNs y demostró que un código combinatorio de TFs en pierna adulto postmitotic MNs dicta sus morfologías individuales. Por reprogramación del código TF de MNs hemos podido cambiar morfologías MN de manera predecible. Llamamos estos TFs: SMN (morfológicos TFs)5.
Una de las partes más difíciles de los análisis morfológicos de adultos MNs es visualizar los axones a través de una cutícula gruesa y auto-fluorescente con alta resolución. Generalmente la etiqueta de axones con un GFP etiquetadas de membrana que se expresa en el MNs con un sistema binario de la expresión, como DVglut-Gal4/UAS-mCD8::GFP o DVglut QF / QUAS mCD8::GFP, donde DVglut es un fuerte conductor expresado en motoneurons6. Al combinar estas herramientas con otras técnicas clonales tales como análisis de mosaico con un marcador repressible (MARCM)7, MARCM cis8o MARCMbow5, podemos restringir la expresión de GFP en subpoblaciones de MNs haciendo el análisis fenotípico de axones más fácil. Hemos generado un protocolo para mantener la pierna morfología axonal MN intacto para la imagen y posterior reconstrucción 3D abordando cuestiones intrínsecas a la pierna de Drosophila adulta tales como (1) fijación de las estructuras internas de la pierna adulto sin afectar la morfología de axón, endógena expresión fluorescente y musculatura de la pierna, (2) montaje de la pierna para preservar la estructura general bajo un cubreobjetos y con la orientación adecuada para la proyección de imagen y (3) de procesamiento de imágenes para obtener la cutícula fondo como señal fluorescente axonal. Aunque este protocolo ha sido detallada para la detección de la expresión fluorescente en axones MN, puede aplicarse para visualizar otros componentes del neuromusculature de la pierna en los artrópodos.
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Protocol
1. disección y fijación de la pierna
- Tomar una placa de cristal de varios pocillos y número apropiado llenado de pozos con etanol al 70%. Añadir 15-20 CO2-moscas anestesiados (de cualquier sexo y cualquier edad) a cada uno bien y usando un cepillo, frote suavemente las moscas en la solución de etanol hasta que moscas son completamente sumergidas.
Nota: Este paso es eliminar la hidrofobicidad de la cutícula. No se lave durante más de 1 minuto, porque esto aumenta auto fluorescencia de la cutícula. - Enjuague las moscas 3 veces con solución de detergente de surfactante no iónico de 0,3% en el 1 x de tampón fosfato salino (PBS). Mantenga las moscas en esta solución durante al menos 10 minutos.
Nota: Las piernas se fijan mejor cuando incluyendo detergente que es probable que aumente la penetración del fijador en la pierna. - Coloque una placa multi-bien en el hielo junto con un tubo de 4% paraformaldehido (PFA).
Nota: La preparación del fresco 4% PFA de una solución stock libre 16% PFA etanol es crítico. - Utilizar pinzas para quitar la cabeza y el abdomen de las moscas sin dañar el segmento torácico o las piernas.
Nota: Quitar el abdomen hace más fácil mantener la mosca y diseccionar las piernas. - Diseccionar las piernas desde el segmento torácico con pinzas y coloque las patas en los pozos que contienen 4% PFA. Para ello, presione suavemente pero con firmeza en el cruce de cadera tórax con la punta de la pinza fina hasta que la pierna se separa.
- Fijar las patas en el 4% PFA durante la noche a 4 ° C (aproximadamente 20 h total).
- Lavar las piernas con detergente surfactante no iónico de 0.3% en PBS 1 x, 5 x 20 min.
- Vuelva a colocar el tampón de lavado con medio de montaje. Mantenga la pierna en medio de montaje para al menos un día antes del montaje para permitir su penetración total en la pierna.
Nota: Si el medio de montaje es altamente viscoso, diluir el medio de montaje al 80% con PBS 1 x debido al cambio repentino de viscosidad puede causar la cutícula y dañar la estructura global de la pierna. Según el conductor de Gal4 , moscas pueden conservarse durante 1 a 3 semanas a 4 ° C en los medios de montaje hasta el montaje.
2. pierna de montaje
- Colocar aproximadamente 20 μl de glicerol al 70% en el lado izquierdo de un portaobjetos y cubrir con un cubreobjetos de2 cuadrado 22 x 22 mm (figura 2A, B). Pipetear 10 μl de medio de montaje a lo largo de una línea paralela y a una pequeña distancia desde el borde derecho de este cubreobjetos. Añadir otro 30 μl de medio de montaje más a la derecha de la diapositiva (figura 2).
Nota: Cuando se aplica un cubreobjetos sobre las piernas (véase abajo) el medio de montaje suavemente extenderá bajo el cubreobjetos y alrededor de las piernas sin les desplazamiento de. - Con unas pinzas finas Levante la pierna de la solución y ponga suavemente en el medio de montaje cerca de cubreobjetos izquierdo. Lo mismo para cada pierna y alinearlos de arriba hacia abajo (Figura 2D).
- Levantar y transferir las piernas en una gota de medio entre ambas puntas de las pinzas. Orientar las piernas de dos maneras: lado externo hacia arriba o hacia abajo.
- Una vez que todas las patas (hasta 6 – 8 patas pueden montarse) estén alineadas correctamente, ponga un cubreobjetos segundo sobre las patas que este cubreobjetos descansa ligeramente sobre el cubreobjetos previamente colocado (Figura 2E) para permitir el espacio entre el cubreobjetos y el tejido y evitar que las piernas de conseguir dañado (figura 2).
Nota: Alternativamente, utilizar etiqueta pozos o cera de ortodoncia para crear espacio entre el cubreobjetos y la diapositiva. - Utilice un esmalte de uñas para fijar la posición de los cubreobjetos en cada esquina (figura 2F).
Nota: El tejido está ahora a la imagen.
3. la proyección de imagen
- Establecer una sola pista usando el láser de 488 nm y dos detectores simultáneamente para obtener la fluorescencia de GFP y cutícula auto-fluorescencia. Mediante el control de rango o la pantalla de control deslizante en la ventana espectral de la ventana de la trayectoria de la luz del software, establece el alcance de la detección de un detector (detector 1) entre 498 – 535 nm y la de la otra (detector 2) entre 566 652 nm.
Nota: Normalmente, el detector 1 debe ser un detector de GaAsP y el detector 2 un tubo fotomultiplicador. El canal de 498 535 óptimo detecta señal GFP pero también detecta fluorescencia automático desde la cutícula. Sin embargo, el canal de 566 – 652 detecta sólo la fluorescencia del auto de la cutícula (Figura 3A). - Use un 20 X o 25 X objetivo de inmersión, resolución de 1024 x 1024 Pixeles, 12 bits de profundidad de aceite y establecer el espaciado Z 1 μm. Set pixel detención tiempo como μs aproximadamente 1,58 y media imagen de Marcos 2. Utilizar objetivos con apertura numérica alta.
- Configurar todos los otros ajustes, dependiendo del microscopio confocal y software de uso.
- Asegúrese de obtener una señal más brillante de la cutícula del detector 566-652 en lugar del detector 498 – 535. Para ello, utilice la misma energía del laser del laser de 488 para ambos detectores. Primero usando los marcadores de saturación, ajustar la ganancia del detector 1 para obtener una señal lo suficientemente brillante de GFP (figura 3B, D). Ajuste la ganancia del detector 2 para asegurarse de que algunas áreas con señal de alto de la cutícula (bordes de las piernas, articulaciones) producen una señal saturada en este detector (figura 3, E).
- Si la pierna es extendida y demasiado grande para ser reflejada en un solo cuadro, utilice la opción posición de azulejo o desde el software de proyección de imagen del microscopio.
- Reconstruir las imágenes finales ya sea usando el microscopio patentado software de imágenes o utilizar ImageJ/FIJI freeware (véase abajo).
4. post procesamiento de imágenes
- Abra la pila confocal en ImageJ/FIJI.
- Usar el plugin de Bioformats (Plugins | Bio-formatos | Importador bio-Formats) en FIJI para abrir imágenes que no están en. Formato TIF de propietario de paquetes de software9.
- Dividir los canales seleccionando imagen | Color | Dividir canales.
Nota: Si imágenes de varias posiciones se hicieron y deben ser recombinadas, utilice los pares plugin en FIJI de la costura (Plugins > costura > Pairwise costura)10,11. - Para restar la señal de la cutícula de la señal de la GFP, abrir la calculadora de imagen (proceso | Calculadora de la imagen): seleccione la pila del detector 1 imagen 1 (GFP + cutícula) (Figura 4A), en la ventana de operación seleccione restary seleccionar la pila del detector 2 imagen 2 (cutícula) (Figura 4B). Como resultado, sólo la señal endógena de la GFP (GFP) se obtiene (figura 4).
- Unir nuevamente esta pila (GFP) con la pila 'sólo cutícula' obtenida de detector 2 (Figura 4B imagen | Color | Combinar canales) para obtener una imagen RGB que consta de la señal GFP de tejidos específicos, así como la señal de la cutícula, que ayuda a identificar los cenadores del axón dentro de los segmentos de la pierna (figura 4).
- Ajustar contraste y brillo de cada imagen (imagen de| Ajustar | Brightness/Contrast) y luego generar una sola imagen RGB (imagen de| Tipo | Color RGB).
Nota: Para generar una proyección máxima de la pila de Z (imagen | Pilas | Proyecto Z...), uso de proyección de máxima intensidad para la GFP señal y la intensidad media de la cutícula, que luego se puede ajustar para brillo antes de la fusión de los dos canales.
- Alternativamente, utilice una macro para resta automático y procesamiento de imágenes ImageJ/Fiji. Copiar el texto suplementario 1 archivo en el editor de macros (Plugins | Nuevo | Macro), guardar la macro en la carpeta de Plugins y reiniciar ImageJ/FIJI una vez para poder utilizar la macro.
- Para utilizar la macro, abra la pila confocal y la ventana de brillo/contraste (imagen de| Ajustar | Brightness/Contrast). Ejecute la macro (Plugin | Macro | Ejecutar) y siga las instrucciones.
- Cuando se le preguntó para especificar la operación (ventana de la calculadora de imagen), seleccione 1 imagen como pila 1 (GFP), imagen 2 como pila 2 (cutícula) y restar.
Nota: La macro genera una imagen de la proyección máxima de la señal procesada de GFP (MAX_Result de stack1), una proyección media de la cutícula (AVG_stack2), el resultado de la resta de la pila de la cutícula de la pila GFP (resultado de stack1) y los no procesados pila de cutícula (stack2). - Cuando se le preguntó a ajustar el contraste, utilice los controles en la ventana de control de brillo para ajustar el brillo/contraste de la imagen de la proyección máxima de GFP y de la proyección media de la cutícula, para generar una imagen fusionada de RGB de ambas señales mostrando la GFP en verde y la cutícula en gris. Combinar resultado de stack1 y stack2, asimismo generar una combinado pila GFP y cutícula que puede ser utilizada en la siguiente etapa.
- Para visualizar las piernas en tres dimensiones, utiliza software 3D especializado con las pilas recién generadas (figura 4E).
- Abra la pila RGB con software 3D (véase Tabla de materiales). En la ventana de diálogo emergente, seleccione todos los canales en la sección de conversión de modo e introduzca el tamaño de un voxel (volumen de un píxel).
Nota: Toda la información necesaria está contenida en los archivos de imagen de cualquier software propietario microscopio uso. - El módulo de canal 2 (señal GFP), haga clic derecho y seleccionar pantalla | volren. A continuación, haga clic en el módulo volren. En la sección de propiedades (parte inferior izquierda de la pantalla) haga clic en izquierda en editar y seleccione volrengreen.col. El módulo de canal 1 (señal de cutícula) con el botón derecho y seleccione pantalla | volren. A continuación, haga clic en el módulo volren. En la sección de propiedades haga clic en avanzadas y seleccione ddr (una pantalla de radiografía como transparente), luego ajuste el valor de gamma para ver el fondo de la cutícula (figura 4E).
- Para generar un giro 3D, haga clic en el módulo de pila de proyecto. A continuación, seleccione animar | girar. Haga clic en el módulo de gire.
- En las propiedades de sección haga clic en utilizar bbox centro. En el módulo de rotación con el botón derecho y seleccione computar | cineasta. En el módulo de cineasta haga clic en el botón izquierdo del ratón. En la sección de propiedades haga clic izquierdo en Advanced (parte superior derecha de la sección de propiedades).
- En el campo de nombre de archivo llene el nombre de la rotación de la película. En cuanto a calidad , escriba 1 (máxima calidad). Deja marco a 200 si se desea una rotación s 8.3 (este número puede ser reducido o aumentado para modificar la velocidad de la rotación). Continuación, pulse aplicar (botón verde, parte inferior izquierda de la sección de propiedades (ver Video 1)).
- Abra la pila RGB con software 3D (véase Tabla de materiales). En la ventana de diálogo emergente, seleccione todos los canales en la sección de conversión de modo e introduzca el tamaño de un voxel (volumen de un píxel).
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Representative Results
Como se muestra en la figura 4, este procedimiento permite la proyección de imagen excelente de axones GFP marcado en piernas de Drosophila adultas, junto con sus cenadores del terminal. Lo importante es que se obtiene una señal limpia de GFP sin ninguna contaminación de la fluorescencia emitida por la cutícula de la pierna. La señal de la cutícula puede combinarse entonces con la señal de la GFP para identificar el posicionamiento de los axones en las piernas (figura 4E, figura 1y 1 de Video). Críticamente, es importante obtener piernas bien fijas. Figura 5 se muestran ejemplos de un bien fijo (figura 5A) y una pierna mal fijo (figura 5B). En el caso anterior las estructuras internas dentro de las patas son de un color uniforme y el traquear, que es oscuras, es visibles. Un tubo traqueal principal funciona en el centro de cada segmento de la pata (adyacente al tronco principal del nervio) y muchas ramificaciones más finas también son visibles. En el segundo, material oscuro está presente en el tarso y la tibia y el sistema traqueal no es claramente visible en el fémur y la cadera: en estos casos siempre se observa que la señal de proteínas fluorescentes se degrada siendo de baja intensidad o ausentes en conjunto. En segundo lugar, cuidadosa disección de las piernas es necesaria para obtener todos los segmentos de la pierna (de cadera a la tibia) y evitar golpes en las piernas. En tercer lugar, las piernas deben quedar lo suficientemente larga para penetrar en el interior de las patas del medio de montaje. A veces segmentos de la pierna, especialmente el fémur, aparecerán colapsados, esto puede ser debido a la falta de penetración del fijador o medio de montaje. Finalmente, uno debe utilizar objetivos de microscopio de alta calidad, corregido para la llanura del campo y especialmente diseñado para fluorescencia o apocromática.
Figura 1: esquema del adulto Drosophila pierna sistema del motor. Los cuerpos celulares de la pierna adulto MNs (verde) se localizan en la corteza (gris) de los ganglios torácicos de la VNC. MNs arborize sus dendritas en el neuropil pierna (azul) y envían sus axones en la pierna para estimular uno de los músculos de la 14 pata (rojo). Tenga en cuenta que sólo las patas de la T1 están esquematizadas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: procedimiento para montar las patas en portaobjetos de microscopio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: procedimiento de la proyección de imagen. (A) espectros de emisión de GFP y de cutícula de pierna con 488 excitación de láser de argón de nm, obtenidos mediante la proyección de imagen espectral de las secciones de piernas expresando GFP y de las patas de Drosophila que no expresan GFP respectivamente. Tenga en cuenta que las intensidades de fluorescencia no han sido normalizadas, por ejemplo, de datos usando los mismos parámetros (objetivo, medio, energía del laser, abertura confocal, ganancia, offset de montaje) en cuanto a la pierna de procedimiento. También se muestran las ventanas de detector usadas para la proyección de imagen la GFP + cutícula fluorescencia (detector 1: verde) y cutícula (detector 2: color de rosa), basándose en los espectros de fondo GFP vs la cutícula. (B, C) Confocal sección de piernas con mCD8::GFP bajo el control de DVGlut-Gal4 obtenido detector 1 (B) y detector de 2 (C). (D, E) Configuración del marcador de saturación utilizado a la imagen (B, C) respectivamente (véase texto para explicación): no azul saturación de la señal, rojo. Tenga en cuenta que en detector 1 las vías nerviosas principales están saturadas, mientras que en el detector 2 que algunas regiones de la cutícula son saturados (vea las flechas). Barra de escala = 100 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: procesamiento de imágenes ImageJ/FIJI. (A) proyección máxima de las pilas confocales de detector de 498 535 nm. (B) proyección máxima de la pila confocal de detector de 566 652 nm. (C) imagen con sólo señal GFP obtenida restando (A) de (B). (D) combina imágenes de (B) y (C). (E) 3D reconstrucción de (C). Barra de escala = 100 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: vista de baja potencia de piernas disecadas mostrando ejemplos de buena (A) y mala (B) fijación. Barra de escala = 200 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Video 1: película de axones GFP marcado (verde) junto con la cutícula (gris) de una Leg Por favor haga clic aquí para ver este video. (Clic derecho para descargar)
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Discussion
La cutícula de la Drosophila adulta y de otros artrópodos, que contiene muchos pigmentos oscuros, es un obstáculo importante para la visualización de estructuras dentro de su cuerpo. Además, es fuertemente auto fluorescente que es hecho peor por la fijación. Estas dos características son muy problemáticas para las observaciones de colorantes fluorescentes o moléculas dentro del cuerpo de los animales con un exoesqueleto.
El procedimiento que hemos descrito y que habitualmente utilizamos en el laboratorio arroja imágenes limpias y detalladas de las trayectorias del axón y de sus conclusiones terminales en las patas de Drosophila adultas. Lo importante es que se obtiene una señal limpia de GFP sin ninguna contaminación de la fluorescencia emitida por la cutícula de la pierna. Esta función es obligatoria para poder visualizar y cuantificar las características tridimensionales de cenadores del axón mediante programas de proyección de imagen 3D. De esta manera se pueden comparar datos obtenidos de varias patas. El procedimiento se adapta fácilmente a la observación de las señales de otras proteínas fluorescentes y podría usarse fácilmente para axones de imagen en otros artrópodos adultos.
Los dos aspectos críticos del procedimiento son i) obtener una señal fuerte de GFP y ii) adecuada fijación de las piernas. En este último caso habitualmente obtenemos buena fijación, sin embargo algunos las piernas de vez en cuando no se fijan correctamente. Por lo tanto, el procedimiento debe mejorarse, tal vez mediante la adición de agentes que promueven la penetración de los reactivos (como el dimetilsulfóxido) u otros medios de fijación (fijación del microondas, si conserva la fluorescencia de GFP), pero no hemos explorado esta posibilidad Aparte de utilizar un paso de preincubación en PBS con un Tritón (que mejoró significativamente la fijación). Para obtener una buena señal GFP utilizamos un controlador DVglut-Gal4 fuerte (también llamado OK371-Gal4). También es necesario utilizar un buen reportero, utilizamos mCD8-GFP y también han obtenido buenas señales con citoplásmico GFP o mCherry. A pesar de todo, utilizamos reporteros que contienen varias copias del reportero principal (hexamérica) y varias copias de sitios LexO o UAS .
Una limitación de este procedimiento es que se aplica sólo al tejido fijo. Actualmente se están desarrollando procedimientos para la observación en vivo y están probando distintas alternativas (montaje y microscopios). Una limitación mediante microscopía confocal es que es difícil ver a través de la pierna entera: esto es porque las señales de las zonas profundas la señal GFP se dispersa a través del tejido que lo recubre. Alternativamente un microscopio bifotón permite la proyección de imagen a través del espesor de la pierna entera.
Por último, otros métodos utilizan diferentes tipos de montaje y fijación4,12. La importancia y la fuerza de nuestro procedimiento es que un paso resta separar la verdadera señal GFP de otras señales (principalmente cuticulares) permite excelente reconstrucción 3 dimensional y visualización de axones y sus cenadores del terminal.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a Robert Renard para preparar medio mosca alimentos. Este trabajo fue apoyado por una subvención del NIH NS070644 a la R.S.M. y financiación de la Asociación de ELA (#256), FRM (#AJE20170537445) y programa de ATIP-Avenir a J.E.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol absolute | Fisher | E/6550DF/17 | Absolute analytical reagent grade |
| nonionic surfactant detergent | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100, for molecular biology |
| Fine forceps | Sigma-Aldrich | F6521 | Jewelers forceps, Dumont No. 5 |
| Glass multi-well plate | Electron Microscopy Sciences | 71563-01 | 9 cavity Pyrex, 100 mm x 85 mm |
| PFA | Thermofisher | 28908 | Pierc 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free |
| Glycerol | Fisher BioReagents | BP 229-1 | Glycerol (Molecular Biology) |
| Spacers | Sun Jin Lab Co | IS006 | iSpacer, four wells, around 12 μL working volume per well, 7 mm diameter, 0.18 mm deep |
| Square 22 mm x 22 mm coverslips | Fisher Scientific | FIS#12-541-B | No.1.5-0.16 to 0.19 mm thick |
| Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | Vectashield Antifade Mounting Medium |
| Confocal microscope | Carl Zeiss | LSM780; objective used LD LCI Plan-Apochromat 25X/0.8 Imm Korr DIC M27 (oil/ silicon/glycerol/water immersion) (420852-9871-000) |
|
| imaging software | Carl Zeiss | ZEN 2011 | |
| 3D-Image software | ThermoFisher Scientific | Amira 6.4 | |
| ImageJ | National Institutes of Health | https://imagej.nih.gov/ij/ | ImageJ/FIJI |
References
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