Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

Analyse van eiwitcomplexen thylakoïde membraan door blauwe inheemse gelelektroforese

Published: September 28, 2018 doi: 10.3791/58369

Summary

Een protocol voor het ontrafelen van plant thylakoïde eiwit complexe organisatie en samenstelling met blauwe inheemse polyacrylamide gel elektroforese (BN-pagina) en 2D-SDS-pagina wordt beschreven. Het protocol is geoptimaliseerd voor Arabidopsis thaliana, maar kan worden gebruikt voor andere plantensoorten met kleine wijzigingen.

Abstract

Fotosynthetische elektron overdracht keten (ETC) omgezet zonne-energie in chemische energie in de vorm van NADPH en ATP. Vier grote eiwitcomplexen ingebed in de thylakoïde membraan oogst zonne-energie rijden elektronen van water naar NADP+ via twee photosystems, en het verloop van de gemaakte proton gebruiken voor productie van ATP. Photosystem PSII, PSI, cytochroom b6f (Cyt b6f) en ATPase zijn alle multiprotein complexen met verschillende oriëntatie en dynamiek in het membraan van thylakoïde. Waardevolle informatie over de samenstelling en de interacties van de complexen van de eiwitten in het membraan van thylakoïde kan worden verkregen door het solubilizing van de complexen van de membraan integriteit door milde detergentia gevolgd door inheemse gel elektroforetische scheiding van de complexen. Blauwe inheemse polyacrylamide-gel-elektroforese (BN-pagina) is een analytische methode gebruikt voor het scheiden van eiwitcomplexen in hun geboorteland en functionele vorm. De methode kan worden gebruikt voor complexe eiwitreiniging voor meer gedetailleerde structurele analyse, maar het biedt ook een instrument om de dynamische interacties tussen de eiwitcomplexen ontleden. De methode heeft werd ontwikkeld voor de analyse van mitochondriale respiratoire eiwitcomplexen, maar sindsdien zijn geoptimaliseerd en verbeterd voor de dissectie van de thylakoïde eiwitcomplexen. Hier, bieden wij een gedetailleerde up-to-date protocol voor analyse van onstabiele fotosynthetische eiwitcomplexen en hun interacties in Arabidopsis thaliana.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Grote multisubunit eiwit complexen Fotosysteem PSI en PSII, Cyt b6f en ATPase coördineren de productie van NADPH en ATP in fotosynthetische licht reacties. In hogere planten chloroplasten, bevinden de complexen zich in de thylakoïde membraan, dat een structureel heterogene membraan structuur is, bestaande uit appressed grana en niet-appressed stroma ze. Blauwe inheemse polyacrylamide-gel-elektroforese (BN-pagina) is een veel gebruikte methode bij de analyse van grote multisubunit eiwitcomplexen in hun geboorteland en biologisch actieve vorm. De methode werd opgericht voor de dissectie van de mitochondriale membraan eiwit complexen1, maar is later aangepast voor de scheiding van eiwitcomplexen van de thylakoïde membraan netwerk3. De methode is geschikt is (i) voor de zuivering van individuele thylakoïde eiwitcomplexen voor structurele analyse, (ii) voor het bepalen van de inheemse interacties tussen eiwitcomplexen en (iii) voor de analyse van de algemene organisatie van de eiwitcomplexen op het veranderende milieu signalen.

Voorafgaand aan de scheiding, eiwitcomplexen worden geïsoleerd van het membraan met zorgvuldig gekozen nonionic detergentia die zijn over het algemeen mild en de inheemse structuur van de eiwitcomplexen behouden. Wasmiddelen bevatten hydrofobe en hydrofiele sites en de stabiele micellen vorm boven een bepaalde concentratie, een kritische micellaire concentratie (CMC) genoemd. Verhoging van het wasmiddel concentratie boven de CMC-resultaten in verstoring van de lipide-lipide-interacties en de solubilisatie van eiwitcomplexen. De keuze van wasmiddel is afhankelijk van de stabiliteit van het eiwit complex van belang en de capaciteit van de solubilisatie van het wasmiddel. Routinematig gebruikte detergentia omvatten α/β-dodecyl-maltoside en digitonin. Na de solubilisatie van eiwitcomplexen in hun geboortestaat, onoplosbaar materiaal wordt verwijderd door centrifugeren. In hogere planten, het membraan thylakoïde is zeer heterogenic in structuur en sommige wasmiddelen (b.v. digitonin) solubilize selectief slechts een specifiek deel van de membraan-3. Karakteriseren de complexe organisatie van eiwit of de interacties tussen de eiwitcomplexen, is het daarom cruciaal om altijd de solubilisatie capaciteit van het gekozen wasmiddel door het bepalen van de inhoud van de chlorofyl en de chlorofyl a/b verhouding van de bovendrijvende substantie te beoordelen het rendement en de vertegenwoordigde thylakoïde (sub) domein, respectievelijk van de ontbindend breuk. De chlorofyl a/b-verhouding in intact ze van groei-licht acclimated planten is meestal ongeveer 3, terwijl de chl een / b-waarde van thylakoïde breuken verrijkt in grana of stroma ze beneden (~ 2.5) of de waarde van het totaal (~ 4.5) overschrijdt thylakoiden, respectievelijk.

Om negatieve lading aan de eiwitcomplexen, wordt Coomassie briljant blauw (CBB) kleurstof toegevoegd aan het ontbindend monster. Als gevolg van de verschuiving van de lading, eiwitcomplexen migreren naar de anode en worden gescheiden op een helling van acrylamide (AA) volgens hun moleculaire massa en de vorm. Doeltreffend en met hoge resolutie scheiding wordt bereikt met behulp van een lineaire acrylamide concentratie verloop. Tijdens de elektroforese migreren de eiwitcomplexen naar de anode totdat ze hun grootte-afhankelijke porie-grootte limiet is bereikt. De porie-grootte van polyacrylamidegel hangt af van (i) de totale acrylamide /BIB- acrylamide concentratie (T) en (ii) op de cross-linker bis- acrylamide monomeer concentratie (C) ten opzichte van de totale monomeren4. Na de scheiding met BN-pagina, kunnen de eiwitcomplexen worden verder onderverdeeld in hun individuele eiwit subeenheden door tweede-dimensie (2D) - SDS - PAGE. Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor de analyse van thylakoïde membraan eiwitcomplexen door BN-/ 2D-SDS-pagina.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. voorbereiding BN Gel1,2,3

  1. De gel-wiel met 8 x 10 cm platen (rechthoekig glas en ingekeepte aluminiumoxide plaat) volgens de instructies van de fabrikant van met behulp van 0,75 mm afstandhouders instellen.
  2. Plaats een kleurovergang mixer op een roer-plaat en verbind deze met de peristaltische pomp door een slang. Een naald van de spuit hechten aan het andere uiteinde van de buis en plaats de naald tussen het glas en aluminium plaat. Magneetroerder plaats aan de "heavy" (H)-kamer.
  3. De 3,5% (v/v) en 12,5% (v/v) acrylamide (AA) oplossingen in 15 mL conische centrifuge buizen te bereiden voor de scheiding gel gradatie (Zie recepten in tabel 1). Voorkom vroegtijdige polymerisatie en houden de centrifuge buizen op ijs bij de voorbereiding van de oplossingen.
    Let op: Acrylamide is neurotoxische en kankerverwekkende, Draag beschermende kleding en handschoenen.
  4. Voeg 5% APS en TEMED recht vóór de oplossingen voor de kleurovergang mixer pipetteren. Pipetteer de 12,5%-oplossing voor de H-kamer.
    1. Verwijder luchtbellen uit het kanaal aansluiten van de "light" (L) en H-kamer door het openen van de klep aansluiten van de twee kamers waardoor oplossing om aan de L-kamer te gaan. Sluit de klep en Pipetteer die de sporen van oplossing terug naar H-kamer.
    2. Ten slotte, Pipetteer de 3,5%-oplossing voor de L-kamer.
  5. Overschakelen op de magneetroerder (de snelheid van het roer is niet kritisch, maar het moet goed mengen van de zware en lichte oplossingen), de kleppen open en zet de peristaltische pomp. Laat de gel oplossingen te stromen tussen het glas en aluminium plaat, het debiet moet ongeveer 0,5 mL/min. De naald moet boven de vloeistof op de hele tijd, het kan worden aangesloten op het bovenste gedeelte van de glasplaat met een tape.
  6. Wanneer de H - en L-kamers hebben leeggemaakt, vul ze met ultrazuiver water en water zachtjes het oppervlak van de gel overlay toestaan. De gel polymerisatie duurt ongeveer 1-2 uur op RT.
  7. Bereid de oplossing van 3% acrylamide (zie recept in tabel 1) voor het stapelen gel op RT. Pipet de stapelvolgorde gel op de top van de gepolymeriseerde scheiding gel (vóór gieten de stapelvolgorde gel, verwijder het water bedekken de oppervlakte van de gel) en plaats een monster gel kam tussen het glas en aluminium plaat vermijden luchtbellen.
    1. Laat 30-60 min RT. verwijderd de kam voorzichtig onder ultrazuiver water polymeriseren. Opslaan van de gel op + 4 ˚C.
      Pauze punt. De gel kan worden achtergelaten bij + 4 ˚C voor een paar dagen. De gel moet worden bewaard in vochtige omstandigheden om te voorkomen dat het drogen van de putten en het oppervlak van de gel.

2. thylakoïde solubilisatie1,2,3

Opmerking: Alle stappen moeten worden uitgevoerd onder zeer weinig licht. Houd de monsters en buffers op ijs.

  1. Geïsoleerde ze met ijskoude 25BTH20G buffer tot een definitieve chlorofylconcentratie van 1 mg/mL verdund. Voor 2D-BN-SDS-pagina analyse ongeveer 4-8 µg chlorofyl / monster is geschikt.
    Opmerking: Het thylakoiden gebruikt in de experimenten moeten worden geïsoleerd van verse bladeren (voor protocol van thylakoïde isolatie, Zie3)
  2. Voeg een gelijke hoeveelheid wasmiddel buffer, d.w.z. 2% β-DM (w/v) of 2% toe digitonin (m/v). Meng het wasmiddel aan het monster thylakoïde zachtjes met de pipet-tip en luchtbellen voorkomen. De uiteindelijke concentratie van het wasmiddel is 1% en dat van de ze 0.5 mg Chl/mL.
    1. Solubilize de thylakoiden gedurende 2 minuten op ijs (β-DM) of 10 minuten bij RT met continue Zacht mengen op een rocker/shaker (digitonin).
      Opmerking: Digitonin en β-DM zijn over het algemeen gebruikt voor de solubilisatie van een thylakoïde eiwitcomplexen. Als andere niet-ionogene wasmiddelen worden gebruikt, moeten de wasmiddel concentratie en de tijd van de solubilisatie worden eerst geoptimaliseerd. Meestal het wasmiddel concentratiebereik van 0,5% - 5% (v/v).
      Let op: Digitonin is toxisch, Draag beschermende kleding en handschoenen
  3. Het insolubilized materiaal verwijderen door centrifugeren bij 18.000 x g gedurende 20 minuten, bij + 4 ˚C.
  4. Het supernatant overbrengen in een nieuwe tube 1,5 mL en voeg 1/10 (v/v) van CBB buffer aan het monster.
    Opmerking: Wanneer de globale samenstelling van de thylakoïde membraan eiwitcomplexen wordt onderzocht, bepalen van het rendement en de vertegenwoordigde thylakoïde domein van ontbindend breuk wordt aanbevolen. Om te bepalen van het rendement van de ontbindend materiaal, neem 5 µL van het supernatans dat aan een nieuwe buis (alvorens toe te voegen CBB) en meet de Chl inhoud en Chl een / b verhouding5.

3. BN-PAGE1,2,3

  1. Instellen van de gel met een verticale elektroforese systeem (bijvoorbeeld Hoefer SE 250). Vul het bovenste buffer kamer met blauwe kathode buffer (Zie tabel 1) en giet anode buffer naar de tweede kamer van de buffer.
  2. Laad thylakoïde monster (bijvoorbeeld 5 µg van chlorofyl) in de putjes.
  3. Start de elektroforese en geleidelijk verhogen de spanning: 75 V voor 30 min 100 V voor 30 min, 125 V voor 30 min, 150 V voor 1 h en 175 V tot de complexen zijn volledig gescheiden. Voer de gel op + 4˚C, hetzij met behulp van een koude kamer of aanpassing van de temperatuur van de gel met een koelsysteem.
    Opmerking: Omzetten in de blauwe kathode buffer een duidelijke kathode buffer wanneer de steekproef voorkant ongeveer eenderde van de gel is gemigreerd.
  4. Na de elektroforetische run, de gel met een photoscanner voor het archiveren van de afbeelding te scannen.

4. 2D-SDS-PAGINA

  1. Het monteren van de Elektroforese van het verticale systeem (gel formaat 16 x 20 cm). Gebruik 1 mm afstandhouders.
  2. Bereiden standaard SDS gel (12% acrylamide, 6 M ureum, zie recept in tabel 2) met een 2D-kam (één groot goed voor de strip en één standaard goed voor moleculair gewicht marker).
  3. Knip de baan van BN-gel en plaatst u deze in een tube (5 mL). Voeg 2 mL Laemmli buffer (met 5% β-mercaptoethanol) en Incubeer de strip voor 45 min met zacht schudden op RT.
  4. Plaats de lane, met behulp van bijvoorbeeld een spacer, op de top van de gel om luchtbellen te voorkomen.
  5. Pipetteer 5 µL van moleculair gewicht markering op een smal stuk van filtreerpapier en plaats het papier aan de standaard goed.
  6. Om de strip BN-gel en het marker-papier, giet 0,5% agarose (in rijklare buffer) op de top van de gel-strip en laat het stollen.
  7. Elektroforese volgens standaard protocollen uitvoeren. Nadat de elektroforetische uitgevoerd, visualiseer de proteïnen met bijvoorbeeld Sypro Ruby vlek of zilver kleuring volgens6.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Een representatieve 2D-BN/SDS-pagina systeem in Figuur 1 toont de scheiding tussen digitonin en β-DM-ontbindend thylakoïde eiwitcomplexen en hun gedetailleerde eiwit subeenheid samenstelling. Het eiwit complex patroon van digitonin ontbindend ze (horizontale gel op de bovenkant aan de bovenkant van figuur 1A) bevat de PSII-LHCII-PSI megacomplex, twee grote PSII-LHCII supercomplexes (sc), PSI-LHCII supercomplex, PSI monomeer (m), PSII m/Cyt b6f, losjes gebonden (L)-LHCII trimeer (figuur 1A). De iets sterker wasmiddel, β-DM, lost het hele thylakoïde membraan (horizontale gel op de bovenkant van figuur 1B), maar is niet in staat voor het behoud van de zwakke wisselwerking tussen eiwitcomplexen. Thylakoïde solubilisatie met β-DM produceert doorgaans vier PSII-LHCII supercomplexes (met verschillende hoeveelheid LHCII antenne aangesloten), PSII dimeer (d) en PSI m, ATPase, PSII m en Cytb6f, M-LHCII, L-LHCII en LHCII monomeer (figuur 1B). In tegenstelling tot de β-DM produceert digitonin slechts een kleine hoeveelheid LHCII monomeer. Het eiwit complex patroon kan verschillen afhankelijk van de plant blootstelling aan verschillende lichtomstandigheden en kan ook verschillen tussen de mutant lijnen, aangezien de complexe eiwitinteractie dynamisch en afhankelijk van bijvoorbeeld proteïne fosforylatie zijn. SDS-PA gels onder de inheemse gel strips in Figuur 1 A en B vertegenwoordigen de polypeptide samenstelling van elke proteïne complexe aanvankelijk ontbindend met digitonin of β-DM.

Figure 1
Figuur 1. Een twee-dimensionale BN-/ SDS-pagina van Arabidopsis thylakoïde. Thylakoïde eiwitcomplexen ontbindend met (A) 1% digitonin en (B) 1% β-DM en gescheiden eerst door 1D-BN-pagina (de rijstroken op bovenkant) en vervolgens op 2D-SDS-pagina om aan te tonen van de individuele eiwit samenstelling van elk complex. Als gevolg van de incubatie van BN-strips met Laemmli buffer denaturering, de eiwit subeenheden van elk complex (in de strip BN) distantiëren en worden gescheiden in een verticale lijn tijdens de 2D-SDS-pagina. De eiwit identificatie is gebaseerd op de spectrometrische analyse in verwijzingen7,8. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Buffer Inhoud Opmerkingen
3,5% (T) Acrylamide (AA) BN scheiding gel 48% AA, 1,5% BIB-AA: 148 µL
3xGel Buffer: 700 µL
75% (m/v) glycerol: 140 µL
Ultrazuiver H2O: 1092 µL
5% APS: 15 ΜL
TEMED 3 ΜL
Opmerking: Acrylamide is neurotoxisch. Voeg APS en TEMED vlak voor gebruik. Het recept is voldoende voor het gieten van een kleine BN gel.
12,5% (T) Acrylamide (AA) BN scheiding gel 48% AA, 1,5% BIB-AA: 530 µL
3xGel Buffer: 700 µL
75% (m/v) glycerol: 560 µL
Ultrazuiver H2O: 290 µL
5% APS: 11 ΜL
TEMED 2ΜL
Opmerking: Acrylamide is neurotoxisch. Voeg APS en TEMED vlak voor gebruik. Het recept is voldoende voor het gieten van een kleine BN gel.
3% (T) Acrylamide (AA) BN stapelen gel 20% AA, 5% BIB-AA: 180 µL
3xGel Buffer: 500 µL
Ultrazuiver H2O: 800 µL
5% APS: 30 ΜL
TEMED 3 ΜL
Opmerking: Acrylamide is neurotoxisch. Voeg APS en TEMED vlak voor gebruik. Het recept is voldoende voor een kleine BN gel.
3 x Gel-buffer 1.5 M ACA
150mM BisTris/HCl (pH 7.0)
Winkel op + 4 ˚C.
CBB buffer 100 mM BisTris/HCl (pH 7.0) 0.5 M ACA
30% (g/v) sacharose
50 mg/ml Serva blauwe G
Winkel op + 4 ˚C
Anode buffer 50 mM BisTris/HCl (pH 7.0) Winkel op + 4 ˚C. Buffer kan bereid worden als 10 x-stockoplossing
Kathode buffer 50 mM Tricine
15 mM BisTris
0,01% Serva blauwe G
Winkel op + 4 ˚C. Buffer kan worden bereid als 10 x stockoplossing, voeg de kleurstof toe aan de oplossing 1 x
25BTH20G 25 mM BisTris/HCl (pH 7.0)
20% (m/v) glycerol
0,25 mg/ml Pefabloc (vers toevoegen)
10 mM NaF (vers toevoegen)
Buffer kan bereid worden als 2 X stockoplossing (opslag bij + 4 ˚C), maar Pefabloc en NaF vers toevoegen
Wasmiddel buffer 2% β-dodecyl maltoside/Digitonin (m/v)
25 mM BisTris/HCl (pH 7.0)
20% (m/v) van glycerol en
0,25 mg/ml Pefabloc (Voeg vers van de stockoplossing)
10 mM NaF (vers toevoegen)
Detergentia kunnen bereid worden als stamoplossingen van het 5-10% (in water). Als andere wasmiddelen worden gebruikt, moet de eindconcentratie wasmiddel worden geoptimaliseerd.

Tabel 1. Buffers en oplossingen voor inheemse gelelektroforese

Buffer Inhoud Opmerkingen
Laemmli buffer 138 mM Tris/HCL pH 6.8
6M ureum
22.2% (v/v) glycerol
4,4% SDS
Referentie: 9
12% Acrylamide, 6M ureum SDS scheiding gel 50% AA, 1,33% BIB-AA: 10,5 mL
20% SDS: 0,7 mL
1.5 M Tris-HCl (pH 8,8): 8.05mL
Ureum: 12.6 g
MQ-H2O: 6.16 mL
10% APS: 200 ΜL
TEMED 28 ΜL
Opmerking: Acrylamide is neurotoxisch. Het recept is geschikt voor het gieten van een grote SDS-gel.
6% Acrylamide, 6M ureum SDS stapelmogelijkheden gel 50% AA, 1,33% BIB-AA: 1,2 mL
20% SDS: 0,2 mL
0,5 M Tris-HCl (pH 6.8): 2,5 mL
Ureum: 3.6 g
MQ-H2O: 3,45 mL
10% APS: 100 ΜL
TEMED 10 ΜL
Opmerking: Acrylamide is neurotoxisch.
SDS uitvoeren buffer 19 mM Tris
2.5 mM Glycine
0,01% SDS

Tabel 2. Buffers voor 2D-SDS-pagina

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

De fotosynthetische energie conversie machine bestaat uit grote multisubunit eiwitcomplexen, die zijn ingebed in het membraan van thylakoïde. Dit protocol beschrijft een basismethode voor analyse van de plant thylakoïde eiwitcomplexen van Arabidopsis thaliana met BN-pagina gecombineerd met 2D-SDS-pagina. Het protocol is ook geschikt voor de analyse van eiwitcomplexen thylakoïde van tabak en spinazie ze, maar omvat wellicht kleine aanpassingen.

Voor de solubilisatie van membraan eiwitcomplexen, worden nonionic detergentia vaak gebruikt voor hun vermogen om voor het behoud van de complexen in hun oorspronkelijke vorm. Hier werden twee veelgebruikte detergentia β-DM en digitonin toegepast. Dodecyl maltoside lost individuele eiwitcomplexen, dat digitonin kan worden gebruikt voor de analyse van grotere eiwit complex assemblages10. De omvangrijke gestructureerde digitonin niet kan aanpassen aan de strak appressed grana partities en dus lost alleen de niet-appressed regio's van de thylakoïde membraan3,11. Het is daarom geschikt voor de analyse van stroma ze en grana marges. Echter, wanneer digitonin wordt gebruikt samen met aminocaproic zuur (ACA), de combinatie lost het hele thylakoïde membraan, waaronder ook de appressed grana ze12. Via een onbekend mechanisme kunt ACA digitonin toegang hebben tot de partitie kloof tussen aangrenzende grana membraan lagen. Nog belangrijker is, digitonin behoudt labile interacties tussen eiwitcomplexen en kan daarom worden gebruikt voor de analyse van labiele eiwitten super en megacomplexes, die meest overvloedig in de niet-appressed thylakoïde regio's8 zijn. Opgemerkt moet worden dat detergentia altijd met een aantal van de labiele interacties tussen de eiwitcomplexen doorkruisen en daarom het niet mogelijk is om volledig intact netwerk van eiwitcomplexen isoleren. Sommige van de complexen zijn dissociatie producten die hebben losgekoppeld van grotere eiwit complex verenigingen tijdens thylakoïde solubilisatie en de elektroforese. De kwaliteit van de BN-pagina scheiding is niet alleen op de bereiding van de monsters (eiwit complex solubilisatie), maar ook op de kwaliteit van de isolatie thylakoïde, die moet worden gedaan van verse bladeren. Indien geen speciale zorg is genomen, wordt de PSII-LHCII-supercomplexes meestal verslechteren tijdens de β-DM solubilisatie.

BN-pagina onderhoudt de integriteit van de ontbindend eiwitcomplexen. De scheidingscapaciteit van de gel BN hangt af van het verloop van acrylamide en het verloop moet worden geoptimaliseerd op basis van de complexen van de proteïne van belang. De porie-grootte van het polyacrylamidegel kan worden gewijzigd door het veranderen van de gradiënt van de concentratie (concentratie totaal acrylamide, T) of door de BIB- acrylamide concentratie (C) ten opzichte van het totale bedrag van acrylamide monomeren4passen. Het BN-PA gel verloop hier gebruikt is geoptimaliseerd en geschikt voor de analyse van grote eiwit super- en megacomplexes3. Bovenal moet porie-grootte van de stapelvolgorde gel groot zijn zodat alle complexen te voeren aan de scheiding-gel. Na eiwit kan complexe scheiding met BN-pagina, de samenstelling of de structuur van elke individuele eiwit complex band verder worden geanalyseerd. Voor structurele analyse het eiwit complex van belang moet worden geëlueerd uit de gel en meest onstabiele complexen kunnen worden vernietigd tijdens de elutie. Sacharose dichtheid verloop wordt daarom steeds vaker gebruikt voor de complexe eiwitreiniging voor structurele analyse. Voor de analyse van spectroscopische eigenschappen van de eiwitcomplexen in de gel, moet de clear-native pagina worden gebruikt in plaats van BN-pagina, aangezien de kleurstof Coomassie met dergelijke metingen interfereert. Voor analyse van de samenstelling van de subeenheid van de eiwitcomplexen, is een denatureren 2D-SDS-pagina hier beschreven. De subeenheden van elk complex worden gescheiden in een verticale lijn, en kunnen gemakkelijk worden geïdentificeerd. Er moet worden opgemerkt dat verschillende eiwitten aanwezig zijn in een enkele plek mogen en de subeenheden in dezelfde verticale lijn behoren kunnen om te scheiden van de complexen mede migreren in BN-pagina.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit onderzoek werd financieel ondersteund door de Academie van Finland (projectnummers 307335 en 303757) en zonne-energie in de subsidieovereenkomst biomassa (SE2B) Marie Skłodowska-Curie (675006). Het protocol is gebaseerd op referentie3.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6-aminocaproic acid (ACA) Sigma-Aldrich A2504
BisTris Sigma-Aldrich B4429
Sucrose Sigma-Aldrich S0389
Acrylamide (AA) Sigma-Aldrich A9099 Caution: Neurotoxic!
n-dodecyl-β-D-maltoside Sigma-Aldrich D4641
Tricine Sigma-Aldrich T0377
Tris Sigma-Aldrich T1503
SDS VWR 442444H
Urea VWR 28877.292
Glycerol J.T. Baker 7044
Sodium Fluoride (NaF) J.T. Baker 3688
EDTA disodium salt J.T. Baker 1073
Digitonin Calbiochem 300410 Caution:Toxic!
Pefabloc SC Roche 11585916001
Serva Coomassie Blue G Serva 35050
β-mercaptoethanol Bio-Rad 1610710
APS (Ammonium persulfate) Bio-Rad 161-0700
TEMED (Tetramethylethylenediamine) Bio-Rad 1610801
(N,N'-Methylene)-Bis-Acrylamide Omnipur 2610
Glycine Fisher G0800
Prestained Protein Marker, Broad Range (7-175 kDa) New England Biolabs P7708
Falcon, Conical Centrifuge Tubes 15 ml Corning 352093
Dual gel caster with 10 x 8 cm plates Hoefer SE215
Gradient maker SG5 Hoefer
0.75 mm T-spacers Hoefer SE2119T-2-.75
Sample gel comb, 0.75 mm Hoefer SE211A-10-.75
Mighty Small SE250 vertical electrophoresis system Hoefer SE250
IPC-pump Ismatec
Power supply, PowerPac HV Bio-Rad 164-5097
Centrifuge Eppendorf 5424R
Rocker-Shaker Biosan BS-010130-AAI

PROTEAN II xi Cell
Bio-Rad 1651813

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schägger, H., von Jagow, G. Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form. Analytical Biochemistry. 199, 223-231 (1991).
  2. Kügler, M., Jänsch, L., Kruft, V., Schmitz, U. K., Braun, H. -P. Analysis of the chloroplast protein complexes by blue-native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). Photosynthesis Research. 53, 35-44 (1997).
  3. Järvi, S., Suorsa, M., Paakkarinen, V., Aro, E. -M. Optimized native gel systems for separation of thylakoid protein complexes: novel super- and mega-complexes. Biochemical Journal. 439, 207-214 (2011).
  4. Strecker, V., Wumaier, Z., Wittig, I., Schägger, H. Large pore gels to separate mega protein complexes larger than 10 MDa by blue native electrophoresis: Isolation of putative respiratory strings or patches. Proteomics. 10, 3379-3387 (2010).
  5. Porra, R. J., Thompson, W. A., Kriedemann, P. E. Determination of accurate extinction coefficients and simultaneous equations for assaying chlorophylls a and b extracted with four different solvents: verification of the concentration of chlorophyll standards by atomic absorption spectroscopy. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 384-394 (1989).
  6. Blum, H., Beier, H., Gross, H. J. Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels. Electrophoresis. 8, 93-99 (1987).
  7. Aro, E. -M., et al. Dynamics of photosystem II: a proteomic approach to thylakoid protein complexes. Journal of Experimental Botany. 56, 347-356 (2005).
  8. Suorsa, M., et al. Light acclimation involves dynamic re-organization of the pigment-protein megacomplexes in non-appressed thylakoid domains. The plant journal for cell and molecular biology. 84, 360-373 (2015).
  9. Laemmli, U. K. Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
  10. Schägger, H., Pfeiffer, K. Supercomplexes in the respiratory chains of yeast and mammalian mitochondria. The EMBO Journal. 19, 1777-1783 (2000).
  11. Rantala, S., Tikkanen, M. Phosphorylation-induced lateral rearrangements of thylakoid protein complexes upon light acclimation. Plant Direct. 2, 1-12 (2018).
  12. Rantala, M., Tikkanen, M., Aro, E. -M. Proteomic characterization of hierarchical megacomplex formation in Arabidopsis thylakoid membrane. Plant Journal. 92, 951-962 (2017).
Analyse van eiwitcomplexen thylakoïde membraan door blauwe inheemse gelelektroforese
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rantala, M., Paakkarinen, V., Aro, E. M. Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis. J. Vis. Exp. (139), e58369, doi:10.3791/58369 (2018).More

Rantala, M., Paakkarinen, V., Aro, E. M. Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis. J. Vis. Exp. (139), e58369, doi:10.3791/58369 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter