Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

Analyse av Thylakoid membran Protein komplekser av blå innfødt Gel geleelektroforese

Published: September 28, 2018 doi: 10.3791/58369

Summary

En protokoll for utviklingen av anlegget thylakoid protein kompleks organisasjonen og komposisjon med blå innfødt polyakrylamid gel geleelektroforese (BN-side) og 2D-SDS-side er beskrevet. Protokollen er optimalisert for Arabidopsis thaliana, , men kan brukes for andre plantearter med mindre modifikasjoner.

Abstract

Fotosynteseaktiviteten elektronet transport kjeden (ETC) konverterer solenergi til kjemisk energi i form av NADPH og ATP. Fire store protein komplekser innebygd i thylakoid membran høste solenergi kjøre elektroner fra vann til NADP+ via to photosystems, og bruke opprettet proton gradient for produksjon av ATP. Photosystem PSII, PSI, cytochrome b6f (Cyt b6f) og ATPase er alle multiprotein komplekser med forskjellig retning og dynamikk i thylakoid membranen. Verdifull informasjon om sammensetningen og interaksjoner av protein komplekser i thylakoid membranen kan fås ved solubilizing komplekser fra membranen integriteten av milde vaskemidler etterfulgt av innfødte gel electrophoretic separasjon av den komplekser. Blå innfødt polyakrylamid gel geleelektroforese (BN-side) er en analytisk metode brukes for separasjon av protein komplekser i sin innfødt og funksjonell form. Metoden kan brukes for protein kompleks rensing for mer strukturelle analysen, men det gir også et verktøy for å analysere dynamisk samspillet mellom protein komplekser. Metoden har ble utviklet for analyse av mitokondrie åndedretts protein komplekser, men siden blitt optimalisert og forbedret for Disseksjon av thylakoid protein komplekser. Her gir vi en detaljert oppdatert protokoll for analyse av labilt fotosynteseaktiviteten protein komplekser og samhandlingen mellom Arabidopsisthaliana.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Store multisubunit protein komplekser photosystem PSI og PSII, Cyt b6f og ATPase koordinere produksjon av NADPH og ATP i fotosynteseaktiviteten lys reaksjoner. I høyere anlegget chloroplasts ligger komplekser i thylakoid membran, som er et strukturelt heterogene membran struktur, bestående av appressed grana og ikke-appressed stroma thylakoids. Blå innfødt polyakrylamid gel geleelektroforese (BN-side) er en mye brukt i analysen av store multisubunit protein komplekser i sin innfødt og biologisk aktive form. Metoden ble etablert for Disseksjon av mitokondrie membran protein komplekser1, men har senere blitt tilpasset for separasjon av protein komplekser fra thylakoid membran nettverk3. Metoden er egnet (i) for rensing av personlige thylakoid protein komplekser for strukturell analyse, (ii) for å bestemme innfødt interaksjoner mellom protein komplekser og (iii) for analyse av organisasjonen av protein komplekser ved endring miljømessige signaler.

Før separasjon er protein komplekser isolert fra membranen med nøye utvalgte ikke-ionisert vaskemidler, som er vanligvis milde og beholde den opprinnelige strukturen av protein komplekser. Vaskemidler inneholder hydrofobe hydrofile områder og skjemaet stabil micelles over en viss konsentrasjon, kalt en kritisk micellar konsentrasjon (CMC). Økende vaskemiddel konsentrasjonen over CMC resultatene i avbrudd av lipid-lipid interaksjoner og solubilization av protein komplekser. Valg av vaskemiddel avhenger stabiliteten av protein kompleks av interesse og solubilization kapasitet vaskemiddel. Rutinemessig brukes vaskemidler inkluderer α/β-dodecyl-maltoside og digitonin. Etter solubilization av protein komplekser i sin opprinnelige tilstand fjernes uløselig materiale med sentrifugering. I høyere planter, thylakoid membranen er svært heterogenic i struktur og legger (f.eks digitonin) solubilize selektivt bare en bestemt del av membran3. Derfor betegner protein kompleks organisasjonen eller samspillet mellom protein komplekser, er det avgjørende å alltid bestemme solubilization kapasiteten til den valgte vaskemiddel ved å bestemme hva klorofyll og klorofyll a/b forholdet mellom nedbryting å vurdere avkastning og representert thylakoid (sub) domene, henholdsvis i solubilized brøken. Klorofyll a/b i intakt thylakoids vekst lys acclimated planter er vanligvis rundt 3, mens chl en / b-verdien av thylakoid fraksjoner beriket i grana eller stroma thylakoids faller under (~ 2,5) eller overskrider (~ 4.5) verdien av totalt thylakoids, henholdsvis.

For å gi negativ ladning til protein komplekser, er Coomassie briljant blå (CBB) fargestoff lagt til solubilized prøven. Følge av kostnad forskyvning, protein komplekser migrere mot anoden og skilles på en akrylamid (AA) gradert etter deres molekylær masse og form. Effektiv og høy oppløsning separasjon er oppnådd ved hjelp av en lineær akrylamid konsentrasjon gradient. Under geleelektroforese migrere protein komplekser mot anoden til de når deres størrelse-avhengige pore-størrelse grense. Pore-størrelse av polyakrylamid gel avhenger av (i) den totale akrylamid /bis- akrylamid konsentrasjon (T) og (ii) på kryss-linker bis- akrylamid monomer konsentrasjonen (C) i forhold til den totale monomerer4. Etter separasjonen BN side, kan protein komplekser videre deles inn i deres personlige protein underenheter andre dimensjon (2D) - SDS - side. Her beskriver vi en detaljert protokoll for analyse av thylakoid membran protein komplekser av BN-side/2D-SDS-side.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. klargjør BN Gel1,2,3

  1. Definere gel caster med 8 cm x 10 cm plater (rektangulær glass og hakk alumina plate) i henhold til produsentens instruksjoner bruke 0,75 mm avstandsstykker.
  2. Plassere en gradient mikser på en røre tallerken og koble den med peristaltiske pumpen ved et rør. Knytte en sprøyte nål til den andre enden av slangen og plasser nålen mellom glass og aluminium plate. Sted magnetisk rørestang til "tung" (H)-kammeret.
  3. Forberede 3,5% (v/v) og 12,5% (v/v) akrylamid (AA) løsninger i 15 mL konisk sentrifuge rør for separasjon gel forløpningen (se oppskrifter i tabell 1). For å hindre tidlig polymerisasjon, holde sentrifuge rørene på is klargjøring løsninger.
    FORSIKTIG: Akrylamid er neurotoxic og kreftfremkallende, beskyttende klær og hansker.
  4. Legg til 5% APS og TEMED rett før pipettering løsninger på gradient mikseren. Pipetter 12,5% løsningen H-kammeret.
    1. Fjerne luftbobler fra kanal connecting "lys" (L) og H-kammer ved å åpne ventilen kobler de to kamrene slik at løsningen til å angi L-kammeret. Lukke ventilen og Pipetter spor av løsningen tilbake til H-kammer.
    2. Endelig Pipetter 3,5% løsningen til L-kammeret.
  5. Slå på magnetisk rørestang (hastigheten på rør er ikke kritisk, men det sikrer riktig blanding av tunge og lette løsninger), åpne ventiler og slå på peristaltiske pumpen. Tillate gel løsninger til å flyte mellom glass og aluminium plate, hastigheten skal være ca 0,5 mL/min. Nålen må være over væsken hele tiden, kan det være festet til den øvre delen av glassplate med et bånd.
  6. Når H - og L-kamrene har tømt, fylle dem med ultrapure vann og vannet kan forsiktig overlegg gel overflaten. Gel polymerisasjon tar rundt 1-2 timer på RT.
  7. Forberede 3% akrylamid løsningen (se oppskrift i tabell 1) for stablingsrekkefølgen gel på RT. Pipetter stabling gel på polymerized separasjon gel (før avstøpning stabling gel, fjerne vannet overliggende gel overflaten) og plassere en prøve gel kam mellom i glass og aluminium plate unngå luftbobler.
    1. La danner 30-60 minutter til RT. Fjern kammen forsiktig under ultrapure vann. Lagre gel på 4 grader.
      Pause poeng. Gelen kan lagres på 4 grader for et par dager. Gel bør holdes i fuktige forhold å unngå tørking av brønnene og gel overflaten.

2. Thylakoid Solubilization1,2,3

Merk: Alle trinnene bør utføres under svært dårlig lys. Hold prøver og buffere på is.

  1. Fortynne isolert thylakoids med iskald 25BTH20G buffer til en siste klorofyll konsentrasjon av 1 mg/mL. For 2D-BN-SDS-side analyse omtrent 4-8 µg av klorofyll / prøven er egnet.
    Merk: Thylakoids som brukes i forsøkene må isoleres fra friske blader (for protokollen thylakoid isolasjon, se3)
  2. Legge til en lik mengde vaskemiddel buffer, dvs. 2% β-DM (w/v) eller 2% digitonin (w/v). Bland vaskemiddel til thylakoid prøven forsiktig med Pipetter spissen og unngå å gjøre luftbobler. Siste konsentrasjonen av vaskemiddel er 1%, og at av thylakoids 0,5 mg Chl/mL.
    1. Solubilize thylakoids i 2 minutter på isen (β-DM) eller 10 minutter på RT kontinuerlig mild blande på en rocker/shaker (digitonin).
      Merk: Digitonin og β-DM er vanligvis brukt til solubilization av thylakoid protein komplekser. Hvis andre ikke-ioniske vaskemidler, må vaskemiddel konsentrasjon og solubilization tiden først optimaliseres. Vanligvis de vaskemiddel konsentrasjon varierer fra 0,5% - 5% (v/v).
      FORSIKTIG: Digitonin er giftige, bære beskyttende klær og hansker
  3. Fjern insolubilized materialet med sentrifugering 18.000 x g for 20 min, på 4 grader.
  4. Overføre nedbryting til en ny 1,5 mL tube og Legg til 1/10 (v/v) CBB bufferen til prøven.
    Merk: Når samlede sammensetningen av thylakoid membran protein komplekser er undersøkt, bestemme avkastningen og representert thylakoid domenet solubilized brøkdel anbefales. For å finne avkastningen av solubilized, ta 5 µL nedbryting av en ny tube (før du legger til CBB) og måle Chl innhold og Chl en / b forholdet5.

3. BN side1,2,3

  1. Definere gel til et loddrett geleelektroforese system (f.eks Hoefer SE 250). Fyll den øvre buffer kammeret med blå katoden buffer (se tabell 1) og hell anode buffer til lavere buffer kammeret.
  2. Legg thylakoid eksempel (f.eks 5 µg av klorofyll) i brønnene.
  3. Start geleelektroforese og gradvis øke spenningen: 75 V i 30 min 100 V for 30 min 125 V i 30 min, 150 V 1t og 175 V til komplekser har vært separert helt. Kjøre den gel + 4 ˚c høyere, bruke en kjølerom eller justere gel temperaturen med et kjølesystem.
    Merk: Endre blå katoden bufferen til en klar katoden bufferen når prøven foran har overført omtrent en tredjedel av gel.
  4. Etter electrophoretic kjøre, skanne gel med en photoscanner for bildearkivering.

4. 2D-SDS-SIDE

  1. Samle loddrett geleelektroforese systemet (gel størrelse 16 cm x 20 cm). Bruk 1 mm avstandsstykker.
  2. Forberede standard SDS gel (12% akrylamid, 6 M Urea, se oppskrift i tabell 2) med en 2D-kam (single store for stripen og en standard godt for molekylvekt markør).
  3. Kuttet kjørefelt fra BN-gel, og plasser den i et (5 mL) rør. Legg 2 mL Laemmli buffer (inneholder 5% β-mercaptoethanol) og ruge stripen for 45 min med mild rister på RT.
  4. Plass kjørefelt, en hjelp av f.eks en spacer, over gel unngå luftbobler.
  5. Pipetter 5 µL av molekylvekt merketråden på en smal filter papir og plasser papiret til standard godt.
  6. For å besegle BN-gel stripen og markør papir, hell 0,5% agarose (i kjører buffer) over gel stripen og tillate for å stivne.
  7. Utføre geleelektroforese ifølge standardprotokoller. Når den electrophoretic kjørt, visualisere proteiner med f.eks Sypro Ruby flekken eller sølv flekker etter6.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

En representant 2D-BN/SDS-side system i figur 1 viser skillet mellom digitonin og β-DM-solubilized thylakoid protein komplekser og detaljert protein delenhet sammensetningen. Protein kompleks mønster av digitonin solubilized thylakoids (vannrett gel øverst på figur 1A) inneholder PSII-LHCII-PSI megacomplex, to store PSII-LHCII supercomplexes (sc), PSI-LHCII supercomplex, PSI monomer (m), PSII m/Cyt b6f, løst bundet (L)-LHCII trimer (figur 1A). Den litt vaskemiddel, β-DM, solubilizes hele thylakoid membranen (vannrett gel på figur 1B), men ikke beholde svake interaksjoner mellom protein komplekser. Thylakoid solubilization med β-DM vanligvis produserer fire PSII-LHCII supercomplexes (med ulike mengden LHCII påmontert), PSII dimer (d) og PSI m, ATPase, PSII m og Cytb6f, M-LHCII, L-LHCII og LHCII monomer (figur 1B). I motsetning til β-DM produserer digitonin bare mindre mengde LHCII monomer. Protein kompleks mønsteret kan variere avhengig av anlegget eksponering for forskjellige lysforhold og kan være forskjellig mellom mutant linjer, siden protein komplekse samspillet er dynamisk og avhenger for eksempel protein fosforylering. SDS-PA gels under innfødt gel strimler i figur 1 A og B representerer polypeptid sammensetningen av hver proteinet først solubilized med digitonin eller β-DM.

Figure 1
Figur 1. En todimensjonal BN-side/SDS side av Arabidopsis thylakoid. Thylakoid protein solubilized med (A) 1% digitonin og (B) 1% β-DM og atskilt først med 1D-BN-side (baner på toppen) og deretter på 2D-SDS-side vise individuelle protein sammensetningen av hvert kompleks. Inkubasjonstiden for BN-strips med denaturing Laemmli buffer, protein underenheter av hver kompleks (i BN stripen) distansere og skilles i en loddrett linje under 2D-SDS-siden. Protein identifikasjon er basert på massespektrometri analyse presentert i referanser7,8. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Buffer Innhold Kommentarer
3,5% (T) akrylamid (AA) BN separasjon gel 48% AA, 1,5% bis-AA: 148 µL
3xGel Buffer: 700 µL
75% (w/v) glyserol: 140 µL
Ultrapure H2O: 1092 µL
5% APS: 15 ΜL
TEMED 3 ΜL
Merk: Akrylamid er nevrotoksiske. Legge til APS og TEMED umiddelbart før bruk. Oppskriften er tilstrekkelig for støping en liten BN gel.
12,5% (T) akrylamid (AA) BN separasjon gel 48% AA, 1,5% bis-AA: 530 µL
3xGel Buffer: 700 µL
75% (w/v) glyserol: 560 µL
Ultrapure H2O: 290 µL
5% APS: 11 ΜL
TEMED 2ΜL
Merk: Akrylamid er nevrotoksiske. Legge til APS og TEMED umiddelbart før bruk. Oppskriften er tilstrekkelig for støping en liten BN gel.
3% (T) akrylamid (AA) BN stabling gel 20% AA, 5% bis-AA: 180 µL
3xGel Buffer: 500 µL
Ultrapure H2O: 800 µL
5% APS: 30 ΜL
TEMED 3 ΜL
Merk: Akrylamid er nevrotoksiske. Legge til APS og TEMED umiddelbart før bruk. Oppskriften er tilstrekkelig for en liten BN gel.
3 x Gel buffer 1,5 M ACA
150mM BisTris/HCl (pH 7.0)
Butikken på + 4 grader.
CBB buffer 100 mM BisTris/HCl (pH 7.0) 0,5 M ACA
30% (w/v) sukrose
50 mg/ml Serva blå G
Butikken på + 4 grader
Anode buffer 50 mM BisTris/HCl (pH 7.0) Butikken på + 4 grader. Bufferen kan tilberedes som 10 x lager løsning
Katode buffer 50 mM Tricine
15 mM BisTris
0,01% Serva blå G
Butikken på + 4 grader. Bufferen kan være forberedt som 10 x lagerløsning, legge fargestoff til 1 x løsningen
25BTH20G 25 mM BisTris/HCl (pH 7.0)
20% (w/v) glyserol
0,25 mg/ml Pefabloc (Legg til fersk)
10 mM NaF (legge fersk)
Bufferen kan tilberedes som 2 X lagerløsning (butikken på + 4 grader), men legge til Pefabloc og NaF ferske
Vaskemiddel buffer 2% β-dodecyl maltoside/Digitonin (w/v)
25 mM BisTris/HCl (pH 7.0)
20% (w/v) glyserol og
0,25 mg/ml Pefabloc (legge fersk fra lager løsning)
10 mM NaF (legge fersk)
Vaskemidler kan tilberedes som 5-10% lager løsninger (i vann). Hvis andre vaskemidler, må siste vaskemiddel konsentrasjonen optimaliseres.

Tabell 1. Buffere og løsninger for native gel geleelektroforese

Buffer Innhold Kommentarer
Laemmli buffer 138 mM Tris/HCL pH 6.8
6M Urea
22.2% (v/v) glyserol
4,4% SDS
Referanse: 9
12% akrylamid, 6M Urea SDS separasjon gel 50% AA, 1,33% bis-AA: 10,5 mL
20% SDS: 0,7 mL
1,5 M Tris-HCl (pH 8,8): 8.05mL
Urea: 12.6 g
MQ-H2O: 6.16 mL
10% APS: 200 ΜL
TEMED 28 ΜL
Merk: Akrylamid er nevrotoksiske. Oppskriften er egnet for støping en stor SDS-gel.
6% akrylamid, 6M Urea SDS stabling gel 50% AA, 1,33% bis-AA: 1,2 mL
20% SDS: 0,2 mL
0,5 M Tris-HCl (pH 6.8): 2,5 mL
Urea: 3,6 g
MQ-H2O: 3,45 mL
10% APS: 100 ΜL
TEMED 10 ΜL
Merk: Akrylamid er nevrotoksiske.
SDS kjører buffer 19 mM Tris
2,5 glysin
0,01% SDS

Tabell 2. Bufferne for 2D-SDS-side

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Fotosynteseaktiviteten energi konvertering maskiner består av store multisubunit protein kompleksene, som er innebygd i thylakoid membranen. Denne protokollen beskriver en grunnleggende metode for analyse av anlegget thylakoid protein komplekser fra Arabidopsis thaliana med BN side kombinert med 2D-SDS-side. Protokollen er også egnet for analyse av thylakoid protein komplekser fra tobakk og spinat thylakoids, men kan kreve små justeringer.

For solubilization av membran protein komplekser brukes ikke-ionisert vaskemidler vanligvis for deres evne til å bevare komplekser i sin opprinnelige form. Her, ble to vanlige vaskemidler β-DM og digitonin brukt. Dodecyl maltoside solubilizes personlige protein komplekser, mens digitonin kan brukes til analyse av større protein kompliserte samlinger10. Den store strukturert digitonin ikke passer til tett appressed grana partisjonene og derfor solubilizes bare ikke-appressed områdene av thylakoid membran3,11. Det er derfor egnet for analyse av stroma thylakoids og grana margene. Men når digitonin brukes sammen med aminocaproic syre (ACA), solubilizes kombinasjonen hele thylakoid membran, blant annet også appressed grana thylakoids12. Gjennom en ukjent mekanisme tillater ACA digitonin å ha tilgang til partisjonen gapet mellom tilstøtende grana membran lag. Viktigere, digitonin bevarer labil interaksjoner mellom protein komplekser og kan derfor brukes til analyse av labilt protein super og megacomplexes, som er mest rikelig i ikke-appressed thylakoid regioner8. Det må bemerkes at vaskemidler alltid påvirke noen av labilt samspillet mellom protein komplekser, og derfor er det ikke mulig å isolere helt intakt nettverk av protein komplekser. Noen av komplekser er dissosiasjon produkter som har blitt koblet fra større protein kompleks foreninger under thylakoid solubilization og geleelektroforese. Kvaliteten på BN side separasjon avhenger ikke bare prøve utarbeidelse (protein kompleks solubilization), men også kvaliteten på thylakoid isolasjon, som må gjøres fra friske blader. Hvis spesiell omsorg ikke er tatt, redusere PSII-LHCII-supercomplexes vanligvis under β-DM solubilization.

BN side opprettholder integriteten til solubilized protein komplekser. Separasjon kapasitet BN gel avhenger av akrylamid graderingen og forløpningen skal være optimalisert basert på protein komplekser rundt. Pore-størrelse av polyakrylamid gel kan endres ved å endre konsentrasjon gradient (totalt akrylamid konsentrasjon, T) eller ved å justere bis- akrylamid konsentrasjonen (C) i forhold til den totale mengden akrylamid monomerer4. BN-PA gel graderingen som brukes her er optimalisert og godt egnet for analyse av store protein super- og megacomplexes3. Viktigere, må pore-størrelse av stabling gel være store tillate alle komplekser til til separasjon gel. Etter protein kan kompleks separasjon med BN side, komposisjon eller strukturen til hvert individuelle protein kompleks band bli ytterligere analysert. For strukturell analyse protein kompleks av interesse må være elut fra gel og mest labil komplekser kan bli ødelagt under tilsettes. Derfor er sukrose tetthet gradert oftere brukt for protein kompleks rensing for strukturell analyse. For analyse av spektroskopiske egenskaper av protein komplekser i gel, må siden klar-innfødt brukes i stedet for BN-side, siden Coomassie fargestoff forstyrrer slike målinger. For analyse av delenhet sammensetningen av protein komplekser beskrives en denaturing 2D-SDS-side her. Underenheter av hver komplekse skilles i en loddrett linje og kan lett identifiseres. Det må bemerkes at flere proteiner kan finnes i en enkelt sted og underenheter i samme vertikale linjen kan tilhøre for å skille komplekser co migrere BN-siden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Denne forskningen ble økonomisk støttet av Academy i Finland (prosjektnumre 307335 og 303757) og solenergi biomasse (SE2B) Marie Skłodowska-Curie grant avtale (675006). Protokollen er basert på referanse3.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6-aminocaproic acid (ACA) Sigma-Aldrich A2504
BisTris Sigma-Aldrich B4429
Sucrose Sigma-Aldrich S0389
Acrylamide (AA) Sigma-Aldrich A9099 Caution: Neurotoxic!
n-dodecyl-β-D-maltoside Sigma-Aldrich D4641
Tricine Sigma-Aldrich T0377
Tris Sigma-Aldrich T1503
SDS VWR 442444H
Urea VWR 28877.292
Glycerol J.T. Baker 7044
Sodium Fluoride (NaF) J.T. Baker 3688
EDTA disodium salt J.T. Baker 1073
Digitonin Calbiochem 300410 Caution:Toxic!
Pefabloc SC Roche 11585916001
Serva Coomassie Blue G Serva 35050
β-mercaptoethanol Bio-Rad 1610710
APS (Ammonium persulfate) Bio-Rad 161-0700
TEMED (Tetramethylethylenediamine) Bio-Rad 1610801
(N,N'-Methylene)-Bis-Acrylamide Omnipur 2610
Glycine Fisher G0800
Prestained Protein Marker, Broad Range (7-175 kDa) New England Biolabs P7708
Falcon, Conical Centrifuge Tubes 15 ml Corning 352093
Dual gel caster with 10 x 8 cm plates Hoefer SE215
Gradient maker SG5 Hoefer
0.75 mm T-spacers Hoefer SE2119T-2-.75
Sample gel comb, 0.75 mm Hoefer SE211A-10-.75
Mighty Small SE250 vertical electrophoresis system Hoefer SE250
IPC-pump Ismatec
Power supply, PowerPac HV Bio-Rad 164-5097
Centrifuge Eppendorf 5424R
Rocker-Shaker Biosan BS-010130-AAI

PROTEAN II xi Cell
Bio-Rad 1651813

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schägger, H., von Jagow, G. Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form. Analytical Biochemistry. 199, 223-231 (1991).
  2. Kügler, M., Jänsch, L., Kruft, V., Schmitz, U. K., Braun, H. -P. Analysis of the chloroplast protein complexes by blue-native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). Photosynthesis Research. 53, 35-44 (1997).
  3. Järvi, S., Suorsa, M., Paakkarinen, V., Aro, E. -M. Optimized native gel systems for separation of thylakoid protein complexes: novel super- and mega-complexes. Biochemical Journal. 439, 207-214 (2011).
  4. Strecker, V., Wumaier, Z., Wittig, I., Schägger, H. Large pore gels to separate mega protein complexes larger than 10 MDa by blue native electrophoresis: Isolation of putative respiratory strings or patches. Proteomics. 10, 3379-3387 (2010).
  5. Porra, R. J., Thompson, W. A., Kriedemann, P. E. Determination of accurate extinction coefficients and simultaneous equations for assaying chlorophylls a and b extracted with four different solvents: verification of the concentration of chlorophyll standards by atomic absorption spectroscopy. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 384-394 (1989).
  6. Blum, H., Beier, H., Gross, H. J. Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels. Electrophoresis. 8, 93-99 (1987).
  7. Aro, E. -M., et al. Dynamics of photosystem II: a proteomic approach to thylakoid protein complexes. Journal of Experimental Botany. 56, 347-356 (2005).
  8. Suorsa, M., et al. Light acclimation involves dynamic re-organization of the pigment-protein megacomplexes in non-appressed thylakoid domains. The plant journal for cell and molecular biology. 84, 360-373 (2015).
  9. Laemmli, U. K. Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
  10. Schägger, H., Pfeiffer, K. Supercomplexes in the respiratory chains of yeast and mammalian mitochondria. The EMBO Journal. 19, 1777-1783 (2000).
  11. Rantala, S., Tikkanen, M. Phosphorylation-induced lateral rearrangements of thylakoid protein complexes upon light acclimation. Plant Direct. 2, 1-12 (2018).
  12. Rantala, M., Tikkanen, M., Aro, E. -M. Proteomic characterization of hierarchical megacomplex formation in Arabidopsis thylakoid membrane. Plant Journal. 92, 951-962 (2017).
Analyse av Thylakoid membran Protein komplekser av blå innfødt Gel geleelektroforese
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rantala, M., Paakkarinen, V., Aro, E. M. Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis. J. Vis. Exp. (139), e58369, doi:10.3791/58369 (2018).More

Rantala, M., Paakkarinen, V., Aro, E. M. Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis. J. Vis. Exp. (139), e58369, doi:10.3791/58369 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter