Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

Analys av Thylakoid membran proteinkomplex med blå infödda gelelektrofores

Published: September 28, 2018 doi: 10.3791/58369

Summary

Ett protokoll för förtydligandet av växten tylakoida protein komplex organisation och sammansättning med blå infödda polyakrylamid gel elektrofores (BN-sidan) och 2D-SDS-PAGE beskrivs. Protokollet är optimerad för Arabidopsis thaliana, men kan användas för andra växtarter med smärre ändringar.

Abstract

Fotosyntetiska elektron överföringen kedjan (ETC) omvandlar solenergi till kemisk energi i form av NADPH och ATP. Fyra stora proteinkomplex inbäddad i den tylakoida membran skörd solenergin att köra elektroner från vatten till NADP+ via två fotosystem och använda den skapade Protonlutning för produktion av ATP. Photosystem PSII, PSI, cytokrom b6f (Cyt b6f) och ATPas är alla multiprotein komplex med distinkta orientering och dynamiken i tylakoida membran. Värdefull information om sammansättning och interaktioner av proteinkomplex i tylakoida membran kan erhållas genom solubilizing komplex från membran integriteten av milda tvättmedel följt av infödda gel elektroforetisk separation av de komplex. Blå infödda polyakrylamid gelelektrofores (BN-sidan) är en analysmetod som används för separation av proteinkomplex i deras infödda och funktionell form. Metoden kan användas för protein komplex rening för mer detaljerad strukturanalys, men det ger också ett verktyg för att dissekera dynamiska samspelet mellan proteinkomplex. Metoden har utvecklades för analys av mitokondrie respiratoriska proteinkomplex, men sedan dess optimerad och förbättrats för dissekering av tylakoida proteinkomplex. Här ger vi en detaljerad aktuell protokoll för analys av labila fotosyntetiska proteinkomplex och deras interaktioner i Arabidopsis thaliana.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Stora multisubunit protein komplex fotosystem PSI och PSII, Cyt b6f och ATPas samordna produktionen av NADPH och ATP i fotosyntetiska ljus reaktioner. I högre växt kloroplaster, är komplexen belägna i det tylakoida membranet, som är en strukturellt heterogena membranstruktur, bestående av appressed grana och icke-appressed stroma thylakoids. Blå infödda polyakrylamid gelelektrofores (BN-sidan) är en omfattande metod i analysen av stora multisubunit proteinkomplex i deras infödda och biologiskt aktiva form. Metoden var etablerat för dissektion av mitokondriella membranet protein komplex1, men senare har anpassats för separation av proteinkomplex från tylakoida membran nätverk3. Metoden är lämplig för rening av enskilda tylakoida proteinkomplex för strukturanalys, (ii) för att fastställa infödd interaktioner mellan proteinkomplex och (iii) för analys av övergripande organisation av proteinkomplex vid förändras miljön ledtrådar.

Innan separationen är proteinkomplex isolerade från membranet med noga utvalda Nonjonaktivt rengöringsmedel, som är vanligtvis milda och bevara den ursprungliga strukturen av proteinkomplex. Tvättmedel innehåller hydrofoba och hydrofil platser och bildar stabila miceller över en viss koncentration, kallas en kritisk micellar koncentration (CMC). Ökar den tvättmedel koncentrationen över CMC resultaten i störningar av lipid-lipid interaktioner och lösbarhet av proteinkomplex. Valet av tvättmedel beror på stabiliteten av protein komplex av intresse och lösbarhet kapacitet av tvättmedel. Rutinmässigt används rengöringsmedel inkluderar α/β-dodecyl-maltoside och digitonin. Efter lösbarhet av proteinkomplex i sitt ursprungliga tillstånd, olösligt material tas bort genom centrifugering. I högre växter, tylakoida membranet är mycket heterogen struktur och vissa rengöringsmedel (t.ex. digitonin) solubilize selektivt bara en specifik del av membran3. För att karakterisera den protein komplex organisationen eller samspelet mellan proteinkomplex, är det därför avgörande att alltid bestämma lösbarhet kapaciteten av det valda tvättmedlet genom att bestämma halten klorofyll och klorofyll a/b förhållandet av supernatanten att bedöma avkastningen och den föreställda tylakoida (sub) domänen, respektive av den solubilized fraktionen. Klorofyll a/b förhållandet i intakt thylakoids av tillväxt-ljus acklimatiserad växter är vanligen omkring 3, medan chl en / b värdet av tylakoida fraktioner berikad antingen i grana eller stroma thylakoids understiger (~ 2,5) eller överskrider (~ 4.5) värdet av totalen thylakoids, respektive.

För att ge negativ laddning till proteinkomplex, tillsätts Coomassie brilliant blue (CBB) färgämne solubilized provet. På grund av kostnad skiftet, proteinkomplex migrera mot anoden och separeras på en akrylamid (AA) lutning enligt deras molekylärt samlas och form. Effektiv och högupplösta separation uppnås med hjälp av en linjär akrylamid koncentrationsgradient. Under elektrofores migrera proteinkomplex mot anoden tills de når sin storlek-beroende porstorlek gräns. Polyakrylamidgelen por-storlek beror på (i) den totala akrylamid /bis- akrylamid koncentration (T) och (ii) på cross-linker bis- akrylamid monomer koncentrationen (C) i förhållande till den totala monomerer4. Efter separationen med BN-sida, kan proteinkomplex ytterligare delas in i deras individuella proteinsubenheter med andra-dimension (2D) - SDS - PAGE. Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för analys av tylakoida membran proteinkomplex av BN-/ 2D SDS sida.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. förbereda BN Gel1,2,3

  1. Ställa in gel caster med 8 x 10 cm plattor (rektangulära glas och spårat aluminiumoxid plattan) enligt tillverkarens anvisningar med hjälp av 0,75 mm distanser.
  2. Placera en gradient mixer på en uppståndelse tallrik och ansluta den med den peristaltiska pumpen genom en slang. Bifoga en sprutans nål till den andra änden av slangen och placera nålen mellan glas och aluminium plattan. Plats magnetomrörare till den ”tungt” (H)-kammare.
  3. Förbereda 3,5% (v/v) och 12,5% (v/v) akrylamid (AA) lösningar i 15 mL koniskt centrifugrör för separation gel övertoningen (se recept i tabell 1). För att förhindra förtidig polymerisation, hålla Centrifugera rören på is medan du förbereder lösningarna.
    Varning: Akrylamid är neurotoxiska och cancerframkallande, bär skyddande kläder och handskar.
  4. Lägg till 5% APS och TEMED rätt före pipettering lösningarna till gradient mixern. Pipettera 12,5% lösningen till H-kammaren.
    1. Avlägsna luftbubblor från den kanal som förbinder ”light” (L) och H-kammare genom att öppna ventilen ansluta de två kamrarna som möjliggör lösning att komma in till L-avdelningen. Stäng ventilen och Pipettera tracesna av lösningen tillbaka till H-kammare.
    2. Slutligen Pipettera 3,5% lösningen till L-avdelningen.
  5. Slå på magnetomröraren (hastigheten på uppståndelse är inte kritisk, men det bör säkerställa korrekt blandning av tunga och lätta lösningar), öppna ventilerna och slå på den peristaltiska pumpen. Tillåta de gel lösningarna mellan glas och aluminium plattan, flödet bör vara ungefär 0,5 mL/min. Nålen måste vara ovanför vätskan hela tiden, det kan kopplas till den övre delen av glasplattan med ett band.
  6. När H - och L-avdelningar har tömt, fylla dem med ultrarent vatten och att vattnet försiktigt radarbild gel ytan. Gel polymerisation tar cirka 1-2 timmar på RT.
  7. Förbered en 3% akrylamid lösning (se recept i tabell 1) för stapling gel på RT. Pipettera stapling gelen ovanpå den polymeriserat separationsgelen (innan gjutning stapling gelen, bort vattnet överliggande gel ytan) och placera en prov gel kam mellan glas och aluminium plattan att undvika luftbubblor.
    1. Tillåta för att polymerisera 30-60 min vid RT. ta bort kammen försiktigt under ultrarent vatten. Lagra gelen vid + 4 ˚C.
      Pausa punkt. Gelen kan förvaras vid + 4 ° c för ett par dagar. Gelen bör hållas i fuktiga förhållanden att undvika uttorkning av brunnarna och gel ytan.

2. tylakoida lösbarhet1,2,3

Obs: Alla åtgärder bör utföras under mycket svagt ljus. Håll prover och buffertar på is.

  1. Späd isolerade thylakoids med iskall 25BTH20G buffert till slutliga klorofyll koncentrationen 1 mg/mL. För 2D-BN-SDS-PAGE analys ungefär 4-8 µg klorofyll / prov är lämplig.
    Obs: Den thylakoids som används i experiment måste isoleras från färska blad (för protokollet av tylakoida isolering, se3)
  2. Tillsätt en motsvarande volym av rengöringsmedel buffer, dvs 2% β-DM (w/v) eller 2% digitonin (w/v). Blanda tvättmedlet som tylakoida provet försiktigt med Pipettera spetsen och undvika att göra luftbubblor. Den slutliga koncentrationen av tvättmedel är 1% och i thylakoids 0,5 mg Chl/mL.
    1. Solubilize thylakoids i 2 min på is (β-DM) eller 10 minuter vid RT med kontinuerlig mild blandning på en rocker/shaker (digitonin).
      Obs: Digitonin och β-DM används generellt för lösbarhet av tylakoida proteinkomplex. Om andra icke-joniskt rengöringsmedel används, måste tvättmedel koncentration och lösbarhet tiden först optimeras. Vanligt tvättmedel koncentration spänna från 0,5-5% (v/v).
      Varning: Digitonin är giftiga, bär skyddande kläder och handskar
  3. Ta bort det insolubilized materialet genom centrifugering vid 18.000 x g i 20 min, vid + 4 ˚C.
  4. Överför supernatanten till en ny 1,5 mL tub och tillsätt 1/10 (v/v) av CBB buffert.
    Obs: När den totala sammansättningen av de tylakoida membran proteinkomplex undersöks, att bestämma räntan och den föreställda tylakoida domänen i solubilized bråk rekommenderas. För att fastställa avkastningen av det solubilized materialet, ta 5 µL av supernatanten till en ny tub (innan du lägger till CBB) och mät Chl innehåll och Chl en / b baserat på5.

3. BN-sidan1,2,3

  1. Ställa in gelen till ett vertikal elektrofores-system (t.ex. Hoefer SE 250). Fyll övre buffert kammaren med blå katoden buffert (se tabell 1) och häll anod buffert till lägre buffert kammaren.
  2. Ladda tylakoida prov (t.ex. 5 µg klorofyll) i brunnar.
  3. Starta elektrofores och gradvis öka spänningen: 75 V för 30 min, 100 V för 30 min, 125 V för 30 min, 150 V för 1 h och 175 V tills komplexen har separerats helt. Kör på gel på + 4˚C, antingen med hjälp av ett kallt rum eller justera gel temperaturen med ett kylsystem.
    Obs: Ändra blå katoden bufferten till en tydlig katod buffert när provet framsidan har migrerat omkring en tredjedel av gelen.
  4. Efter elektrofores flykt, avsöka gelen med en photoscanner för bilden arkivering.

4. 2D-SDS-PAGE

  1. Montera ihop vertikal elektrofores-systemet (gel storlek 16 cm x 20 cm). Använd 1 mm distanser.
  2. Förbereda standard SDS gel (12% akrylamid, 6 M Urea, se recept i tabell 2) med en 2D-kam (enkel stora väl för remsan och en standard väl för molekylvikt markör).
  3. Skära lanen från BN-gel och placera den i en (5 mL) tub. Tillsätt 2 mL av Laemmli buffert (som innehåller 5% β-merkaptoetanol) och inkubera remsan för 45 min med varsam skakning på RT.
  4. Placera lanen, med en hjälp av exempelvis en spacer, ovanpå gelen att undvika luftbubblor.
  5. Pipettera 5 µL av molekylvikt markör på en smal bit av filterpapper och Placera papperet att standarden väl.
  6. För att försegla BN-gel remsan och markör papper, häll 0,5% agaros (i körklart buffert) ovanpå gel remsan och låt stelna.
  7. Utför elektrofores enligt standardprotokoll. Efter den elektroforesiska kör, visualisera de proteiner med exempelvis Sypro Ruby fläcken eller silver färgning enligt6.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

En representativ 2D-BN/SDS-PAGE-systemet i figur 1 visar separering av digitonin och β-DM-solubilized tylakoida proteinkomplex och deras detaljerade protein subenhet sammansättning. Den protein komplexa mönstret av digitonin solubilized thylakoids (horisontella gel överst på toppen av figur 1A) innehåller PSII-LHCII-iska megacomplex, två stora PSII-LHCII supercomplexes (sc), PSI-LHCII supercomplex, PSI monomerer (m), PSII m/Cyt b6f, löst bunden (L)-LHCII trimer (figur 1A). Den något starkare rengöringsmedel, β-DM, solubilizes hela tylakoida membranet (horisontell gel på toppen av figur 1B), men är inte att bevara svaga interaktioner mellan proteinkomplex. Tylakoida lösbarhet med β-DM producerar vanligtvis fyra PSII-LHCII supercomplexes (med olika mängd LHCII antenn ansluten), PSII dimer (d) och PSI m, ATPas, PSII m och Cytb6f, M-LHCII, L-LHCII och LHCII monomer (figur 1B). Till skillnad från β-DM producerar digitonin endast mindre mängd LHCII monomer. Den protein komplexa mönstret kan variera beroende på växten exponering för olika ljusförhållanden och kan också variera mellan mutant linjer, eftersom protein komplexa växelverkan är dynamisk och beroende av dvs protein fosforylering. SDS-PA geler nedanför infödda gel remsorna i figur 1 A och B utgör polypeptid sammansättningen av varje proteinkomplex initialt solubilized med digitonin- eller β-DM.

Figure 1
Figur 1. En tvådimensionell BN-/ SDS sida av Arabidopsis tylakoida. Tylakoida proteinkomplex solubilized med (A) 1% digitonin och (B) 1% β-DM och åtskilda först av 1D-BN-sida (köer på toppen) och därefter på 2D-SDS-PAGE att visa enskilda protein sammansättningen av varje komplex. På grund av inkubering av BN-strips med denatureringen Laemmli buffert, protein subunitsna av varje komplex (i BN remsan) separera och separeras i en lodrät linje under den 2D-SDS-PAGE. Protein identifiering är baserad på masspektrometri analys presenteras i referenser7,8. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Buffert Innehåll Kommentarer
3,5% (T) akrylamid (AA) BN separationsgelen 48% AA, 1,5% bis-AA: 148 µL
3xGel buffert: 700 µL
75% (w/v) glycerol: 140 µL
Ultrarena H2O: 1092 µL
5% APS: 15 ΜL
TEMED 3 ΜL
Obs: Akrylamid är neurotoxiska. Lägga till APS och TEMED omedelbart före användning. Receptet räcker för gjutning en liten BN gel.
12,5% (T) akrylamid (AA) BN separationsgelen 48% AA, 1,5% bis-AA: 530 µL
3xGel buffert: 700 µL
75% (w/v) glycerol: 560 µL
Ultrarena H2O: 290 µL
5% APS: 11 ΜL
TEMED 2ΜL
Obs: Akrylamid är neurotoxiska. Lägga till APS och TEMED omedelbart före användning. Receptet räcker för gjutning en liten BN gel.
3% (T) akrylamid (AA) BN stapling gel 20% AA, 5% bis-AA: 180 µL
3xGel buffert: 500 µL
Ultrarena H2O: 800 µL
5% APS: 30 ΜL
TEMED 3 ΜL
Obs: Akrylamid är neurotoxiska. Lägga till APS och TEMED omedelbart före användning. Receptet räcker till en liten BN gel.
3 x Gel buffert 1,5 M ACA
150mM BisTris/HCl (pH 7,0)
Förvaras vid + 4 ° c.
CBB buffert 100 mM BisTris/HCl (pH 7,0) 0,5 M ACA
30% (w/v) sackaros
50 mg/ml Serva blå G
Förvaras vid + 4 ° c
Anod buffert 50 mM BisTris/HCl (pH 7,0) Förvaras vid + 4 ° c. Bufferten kan förberedas som 10 x stamlösning
Katod buffert 50 mM Tricine
15 mM BisTris
0,01% Serva blå G
Förvaras vid + 4 ° c. Bufferten kan förberedas som 10 x stamlösning, lägger till färgämnet i 1 x lösningen
25BTH20G 25 mM BisTris/HCl (pH 7,0)
20% (w/v) glycerol
0,25 mg/ml Pefabloc (Lägg nymalen)
10 mM NaF (Lägg nymalen)
Bufferten kan förberedas 2 X stamlösning (förvaras vid + 4 ° c), men lägga till Pefabloc och NaF nymalen
Rengöringsmedel buffer 2% β-dodecyl maltoside/Digitonin (w/v)
25 mM BisTris/HCl (pH 7,0)
20% (w/v) glycerol och
0,25 mg/ml Pefabloc (Lägg färska från stamlösning)
10 mM NaF (Lägg nymalen)
Rengöringsmedel kan förberedas som 5-10% lager lösningar (i vatten). Om andra rengöringsmedel används, har slutliga tvättmedel koncentration ska optimeras.

Tabell 1. Buffrar och lösningar för infödda gelelektrofores

Buffert Innehåll Kommentarer
Laemmli buffert 138 mM Tris/HCL pH 6,8
6M Urea
22,2% (v/v) glycerol
4,4% SDS
Referens: 9
12% akrylamid, 6M Urea SDS separationsgelen 50% AA, 1,33% bis-AA: 10,5 mL
20% SDS: 0,7 mL
1,5 M Tris-HCl (pH 8,8): 8.05mL
Urea: 12,6 g
MQ-H2O: 6,16 mL
10% APS: 200 ΜL
TEMED 28 ΜL
Obs: Akrylamid är neurotoxiska. Receptet är lämplig för gjutning en stor SDS-gel.
6% akrylamid, 6M Urea SDS stapling gel 50% AA, 1,33% bis-AA: 1,2 mL
20% SDS: 0,2 mL
0,5 M Tris-HCl (pH 6,8): 2,5 mL
Urea: 3,6 g
MQ-H2O: 3,45 mL
10% APS: 100 ΜL
TEMED 10 ΜL
Obs: Akrylamid är neurotoxiska.
SDS kör buffert 19 mM Tris
2,5 mM glycin
0,01% SDS

Tabell 2. Buffertar för 2D-SDS-PAGE

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Fotosyntetiska energi konvertering maskiner består av stora multisubunit proteinkomplex, som är inbäddade i membranet som tylakoida. Det här protokollet beskriver en grundläggande metod för analys av de växt tylakoida proteinkomplex från Arabidopsis thaliana med BN-sida kombinerat med 2D-SDS-PAGE. Protokollet är också lämplig för analys av tylakoida proteinkomplex från tobak och spenat thylakoids, men kan kräva små justeringar.

För lösbarhet av membran proteinkomplex används Nonjonaktivt rengöringsmedel ofta för sin förmåga för att bevara komplex i sin ursprungliga form. Här, tillämpades två vanliga rengöringsmedel β-DM och digitonin. Dodecyl maltoside solubilizes enskilda proteinkomplex, medan digitonin kan användas för analys av större protein komplex församlingar10. Den skrymmande strukturerade digitonin är inte passa till tätt appressed grana partitioner och därför solubilizes endast icke-appressed regioner i tylakoida membran3,11. Det är därför lämpad för analys av stroma thylakoids och grana marginaler. Men när digitonin används tillsammans med aminokapronsyra (ACA), solubilizes kombinationen hela tylakoida membranet, bland annat också appressed grana thylakoids12. Genom en okänd mekanism tillåter ACA digitonin att ha tillgång till partition klyftan mellan intilliggande grana membran lager. Ännu viktigare, digitonin bevarar labila interaktioner mellan proteinkomplex och kan därför användas för analys av labila protein super och megacomplexes, som är vanligast förekommande i icke-appressed tylakoida regioner8. Det måste noteras att tvättmedel alltid störa vissa av labila interaktion mellan de proteinkomplex och därför är det inte möjligt att isolera helt intakt nätverk av proteinkomplex. Några av komplexen är dissociation produkter som har kopplats från större protein complex föreningar under tylakoida lösbarhet och elektrofores. Kvaliteten på BN-sida separation beror inte bara på provberedningen (protein komplex lösbarhet), men också på kvaliteten på den tylakoida isolering, som måste göras från färska blad. Om särskild försiktighet inte tas, försämra de PSII-LHCII supercomplexes vanligtvis under β-DM lösbarhet.

BN-sida upprätthåller integriteten för de solubilized proteinkomplex. Avskiljande förmåga av BN gel beror på akrylamid övertoningen, och lutningen bör optimeras baserat på de proteinkomplex av intresse. Polyakrylamidgelen por-storlek kan ändras genom att ändra koncentrationsgradient (totala akrylamid koncentration, T) eller genom justering av bis- akrylamid koncentrationen (C) i förhållande till den totala mängden akrylamid monomerer4. BN-PA gel toningen som används här är optimerad och väl lämpad för analys av stora protein super- och megacomplexes3. Allt, måste por-storlek av stapling gelen vara stora för att tillåta alla komplex ange till separationsgelen. Efter protein kan komplexa separation med BN-sida, sammansättning eller struktur för varje enskild protein complex band analyseras ytterligare. För strukturanalys proteinet komplex av intresse måste vara elueras från gelen och mest labila komplex kan förstöras under elueringen. Därför används oftare sackaros täthetlutning för protein komplex rening för strukturanalys. För analysen i spectroscopic egenskaper av de proteinkomplex i gel, måste clear-native sidan användas i stället för BN-sida, eftersom färgämnet Coomassie stör sådana mätningar. För analys av subenhet sammansättning av proteinkomplex beskrivs en denatureringen 2D-SDS-PAGE här. Subunitsna av varje komplex separeras i en lodrät linje och lätt kan identifieras. Det måste noteras att flera proteiner kan förekomma i en enda plats och subunitsna i samma vertikala linje kan tillhöra separata komplex samarbete migrerar i BN-sida.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Denna forskning stöddes ekonomiskt av Finlands Akademi (projektnummer 307335 och 303757) och solenergi i biomassa (SE2B) Marie Skłodowska-Curie bidragsavtalet (675006). Protokollet är baserat på referens3.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6-aminocaproic acid (ACA) Sigma-Aldrich A2504
BisTris Sigma-Aldrich B4429
Sucrose Sigma-Aldrich S0389
Acrylamide (AA) Sigma-Aldrich A9099 Caution: Neurotoxic!
n-dodecyl-β-D-maltoside Sigma-Aldrich D4641
Tricine Sigma-Aldrich T0377
Tris Sigma-Aldrich T1503
SDS VWR 442444H
Urea VWR 28877.292
Glycerol J.T. Baker 7044
Sodium Fluoride (NaF) J.T. Baker 3688
EDTA disodium salt J.T. Baker 1073
Digitonin Calbiochem 300410 Caution:Toxic!
Pefabloc SC Roche 11585916001
Serva Coomassie Blue G Serva 35050
β-mercaptoethanol Bio-Rad 1610710
APS (Ammonium persulfate) Bio-Rad 161-0700
TEMED (Tetramethylethylenediamine) Bio-Rad 1610801
(N,N'-Methylene)-Bis-Acrylamide Omnipur 2610
Glycine Fisher G0800
Prestained Protein Marker, Broad Range (7-175 kDa) New England Biolabs P7708
Falcon, Conical Centrifuge Tubes 15 ml Corning 352093
Dual gel caster with 10 x 8 cm plates Hoefer SE215
Gradient maker SG5 Hoefer
0.75 mm T-spacers Hoefer SE2119T-2-.75
Sample gel comb, 0.75 mm Hoefer SE211A-10-.75
Mighty Small SE250 vertical electrophoresis system Hoefer SE250
IPC-pump Ismatec
Power supply, PowerPac HV Bio-Rad 164-5097
Centrifuge Eppendorf 5424R
Rocker-Shaker Biosan BS-010130-AAI

PROTEAN II xi Cell
Bio-Rad 1651813

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schägger, H., von Jagow, G. Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form. Analytical Biochemistry. 199, 223-231 (1991).
  2. Kügler, M., Jänsch, L., Kruft, V., Schmitz, U. K., Braun, H. -P. Analysis of the chloroplast protein complexes by blue-native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). Photosynthesis Research. 53, 35-44 (1997).
  3. Järvi, S., Suorsa, M., Paakkarinen, V., Aro, E. -M. Optimized native gel systems for separation of thylakoid protein complexes: novel super- and mega-complexes. Biochemical Journal. 439, 207-214 (2011).
  4. Strecker, V., Wumaier, Z., Wittig, I., Schägger, H. Large pore gels to separate mega protein complexes larger than 10 MDa by blue native electrophoresis: Isolation of putative respiratory strings or patches. Proteomics. 10, 3379-3387 (2010).
  5. Porra, R. J., Thompson, W. A., Kriedemann, P. E. Determination of accurate extinction coefficients and simultaneous equations for assaying chlorophylls a and b extracted with four different solvents: verification of the concentration of chlorophyll standards by atomic absorption spectroscopy. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 384-394 (1989).
  6. Blum, H., Beier, H., Gross, H. J. Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels. Electrophoresis. 8, 93-99 (1987).
  7. Aro, E. -M., et al. Dynamics of photosystem II: a proteomic approach to thylakoid protein complexes. Journal of Experimental Botany. 56, 347-356 (2005).
  8. Suorsa, M., et al. Light acclimation involves dynamic re-organization of the pigment-protein megacomplexes in non-appressed thylakoid domains. The plant journal for cell and molecular biology. 84, 360-373 (2015).
  9. Laemmli, U. K. Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
  10. Schägger, H., Pfeiffer, K. Supercomplexes in the respiratory chains of yeast and mammalian mitochondria. The EMBO Journal. 19, 1777-1783 (2000).
  11. Rantala, S., Tikkanen, M. Phosphorylation-induced lateral rearrangements of thylakoid protein complexes upon light acclimation. Plant Direct. 2, 1-12 (2018).
  12. Rantala, M., Tikkanen, M., Aro, E. -M. Proteomic characterization of hierarchical megacomplex formation in Arabidopsis thylakoid membrane. Plant Journal. 92, 951-962 (2017).
Analys av Thylakoid membran proteinkomplex med blå infödda gelelektrofores
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rantala, M., Paakkarinen, V., Aro, E. M. Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis. J. Vis. Exp. (139), e58369, doi:10.3791/58369 (2018).More

Rantala, M., Paakkarinen, V., Aro, E. M. Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis. J. Vis. Exp. (139), e58369, doi:10.3791/58369 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter