Summary
我们提出了一种方法来检测 3-硝基酪氨酸化学修饰大气蛋白质与6毫米直径的圆形从空气采样器预过滤器切割使用高效液相色谱-电化学检测器 (hplc-ecd)。
Abstract
3-硝基酸 (3-nt) 是通过与臭氧 (o3) 和二氧化氮 (no) 的反应而产生的大气生物气溶胶蛋白中的酪氨酸残留量.稳定的3-nt 是氧化损伤的一个特定标记, 据报道, 有促进过敏的作用。在本研究中, 我们报告了一种高度敏感的检测方法, 用于量化空气采样器中的3-nt 过滤器, 以收集从城市环境空气中 < 2.5μm 的颗粒物 (pm2.5), 包括生物气溶胶。该方法从空气采样器的过滤器中切割出直径为6毫米的圆孔, 并与非特异性蛋白酶鸡尾酒混合, 以水解蛋白质。使用高效液相色谱-电化学检测器 (hplc-ecd) 对3-nt 消化到氨基酸水平的蛋白质样品进行了测试。在4.5 至7.3μm 尺寸 pm 的预过滤器中检测到了最大的3-nt 含量, 检出限为 1.13 pg/m3。
Introduction
气溶胶或空气中的 pm 含有来自各种生物来源的蛋白质, 包括病毒、原核生物、真菌、植物 (花粉) 和动物 (昆虫、人类) 1。在 pm 中的蛋白质含量的比例估计接近 5%, 这被认为是空气中的过敏原2的主要作用.最近的报告表明, 不同大小的城市环境气溶胶中含有氨基酸, 其比率在0.5% 至2% 之间.此外, pm 蛋白的化学修饰被认为是由蛋白质与各种污染物 (如 o3、二氧化氮 (no 2) 和二氧化硫 (so2)4等的反应所产生的。
3-nt--蛋白质修饰--是由酪氨酸残基的硝化产生的。在伪大气空间 5 , 6 中, o 3 和 no2的浓度较高,促进了蛋白质分子的硝化。多肽链中酪氨酸残基的硝化增强了花粉蛋白的过敏性潜力7。因此, 对机载3-nt 的量化和评估是解决环境健康问题的一个重要方面。
3-nt 也被称为氧化和非硝化应激的生物标志物8。一个新出现的证据表明, 3-nt 含量与几种人类疾病有显著关联.由于其有害影响, 生物样本中3-nt 的检测和定量估计对确定个人健康状况具有重要意义。近年来, 采用了多种方法来估计3-nt 的含量, 包括酶联免疫吸附法、高效液相色谱法和 lcn/ms11 法。在前面的研究中, 我们报告了一种使用 hplc-ecd 技术的检测方法, 与以前的方法相比, 它具有多种优点。例如, hplc-ecd 不需要提取或衍生化程序, 这使得它成为一个相对简单的检测系统12。我们已经证实, 这种方法适用于检测生物样本 (人和大鼠的血浆) 中的3-nt。
虽然许多调查都强调在生物样本中检测 3-nt, 但在非生物样本中检测到的方法仍然遥遥无期, 因此本研究一直在进行中。事实上, 为了评估空气中的3-nt 的有害影响, 需要一种定量的方法, 有助于直接从空气中的颗粒检测 3-nt;因此, 我们应用现有的 hplc-ecd 方法从在玻璃纤维过滤器上采集的 pm2.5检测3-nt。通过使用该技术, 可以直接从 pm 收集过滤器中检测到样品的小块 (直径为6毫米的圆孔)。进一步评估了不同 pm 尺寸的3-nt 含量, 并测量了3-nt 的检出限。本文提出了一种高灵敏度、高通量的方法, 可以直接从非生物样品和生物样品中检测3-nt。
Protocol
1. 总悬浮粒子、pm2.5或 pm7 的收集, 以及 pm 蛋白的水解方法
- 从预筛选器或备份筛选器收集 pm。
- 在收集总悬浮颗粒 (tsp)、pm2.5和 pm7之前, 对石英滤清器进行称重。
注: 鉴于 pm 蛋白和肽的污染不应影响酪氨酸硝化的检测 (因为它们缺乏这样的硝基组), 我们在测量前没有在高温下处理石英过滤器。此外, 石英滤清器中的3-nt 含量低于 hplc-ecd 确定的检测极限。 - 将石英滤清器设置在具有粒径选择器的大容量空气采样器上, 以 1, 000 lmmin 的流量连续收集 pm7 , 持续为 7d (图 1 b)。tsp 可以在没有尺寸选择器的石英过滤器上收集 (图 1a)。
- 使用小体积空气采样器收集 pm 2.5, 其尺寸分类单元连续为 116 lmin, 流量为 7d. 使用该装置, 颗粒可分为 pm4.5-2.5、pm7.5-4.5、pm 15-7.3 和 tspp-pm15并收集到石英过滤器进行分类。pm2.5可以收集到备份筛选器 (图 1c)。
- 记录筛选器收集时的总流量。通过从收集后的权重中减去预紧重量, 测量过滤器上 tsp、pm2.5和 pm7的重量。将过滤器密封在塑料袋中, 并将其存放在-30°c, 直到下一步 (见第2节)。
- 在收集总悬浮颗粒 (tsp)、pm2.5和 pm7之前, 对石英滤清器进行称重。
- 蛋白质溶解样品。
- 用 0.1 m 醋酸盐缓冲液 (ph 7.4) 溶解非特异性蛋白酶鸡尾酒。将溶液放入透析膜 (分子量截止 = 5, 000 达) 中, 在4°c 下搅拌, 将其浸入1升 0.1 m 醋酸盐缓冲液中。每12小时更换2倍缓冲液, 然后在夜间进行透析, 以去除内源性3-nt 和亚硝酸盐 (no2-)。透析后, 采用双氯酸 (bca) 蛋白法收集溶液, 测定蛋白质浓度。
- 从预过滤器或备用滤清器中打出6毫米的圆圆, 并将其放入微管中。分析最多可使用 5个6毫米分数的部分 (图 2)。
- 在试管中加入 300μl 0.1 m 醋酸盐缓冲液, 其中含有50微克的蛋白质, 1.2.1 步骤制备), 在50°c 时旋转16小时水解 pm 蛋白。
注: 要从非特异性蛋白酶鸡尾酒溶液中减去内源性 3-nt, 有必要制备和消化仅有特异性蛋白酶的鸡尾酒样本。 - 由于在膜中污染了类似于 3 nt 的化学物质, 通过添加 0.1 m 醋酸盐缓冲液和离心 (10, 000 x g 30秒; 确切速度取决于膜), 将超滤膜及其供应的管冲洗。重复冲洗1x。
- 在蛋白质溶解后, 将样品以 2, 500 x 克的速度离心 10分钟, 将上清液装入超滤膜, 并以 10, 000 x 克和4°c 的温度离心进行超滤 (mwco = 10, 000), 直到收集到足够的洗脱量。将凹漆存放在4°c 的黑暗中。
注意: 由于在自旋柱中检测到与3-nt 相似的峰值, 因此在使用前必须用干净的水或使用高效液相色谱水和 0.1 m 醋酸盐缓冲液等缓冲液将其洗好。
2.通过高效液相色谱和电化学检测 (hplc-ecd) 系统测定 tsp、pm2.5和 pm7中的3-nt 含量
注意: 请参见图 3。
- 准备移动阶段。
- 制备 0.2 m 磷酸盐缓冲液 (ph 值 2.5), 含有 50 mg/l edta。测量98卷缓冲液和两卷乙腈 (hplc 级), 将其倒入干净的玻璃瓶中, 并与瓶盖大力混合。
- 在室温下设置流动阶段数小时, 直到溶解的空气变平。
注意: 如果系统启动较早, 移动相位可以在真空下进行声纳和脱气。然而, 过度脱气会通过蒸发改变水和有机相之间的比例。
- hplc-ecd 系统由泵、高效液相色谱柱、脱气器、ecd 和喷油器组成。平衡移动相位, 稳定系统, 减少背景和噪音。
- 在高效液相色谱系统中安装流动相和高效液相色谱柱。打开高效液相色谱泵, 在25°c 柱温度下, 从开始的前一天起, 将流动相的柱稳定在500μlmmin 的温度下。
- 第二天, 点燃 ecd 并设置参数 (降低电压为-900 mv, 励磁电压为 400 mv)。稳定它至少3小时。
- 测量下午7中的3-nt 浓度。
- 在 0.1 m 醋酸盐缓冲液中制备各种浓度的3-nt 标准 (5-500 nm) 和空白 (没有3-nt 标准和非特异性蛋白酶鸡尾酒, 以确保小瓶和缓冲液都不被污染)。
- 运行高效液相色谱数据处理器。
- 将样品瓶放入自动喷射器中, 并将注射体积设置为 25μl. 操作步骤2.2.1 中提到的相同的移动相位和流速条件。
注: 如果样品制备完成, 应该有样品、标准样品 (5-500 nm)、仅有非特异性蛋白酶鸡尾酒的样品和一个空白小瓶。 - 确保色谱图中的基线为平坦, 并开始样品注射。
注: 一般情况下, 3-nt 在20-21分钟内被检测到;但是, 建议使用大约30分钟作为每个样品注入的运行时间。否则, 污染物峰值将包括在下一次运行中。
3. pm 中3-nt 含量的色谱分析和定量 7
- 检查色谱图中的3-nt 峰值并计算内容。
- 数据收集完成后, 使用分析软件打开色谱数据文件。
- 从平坦基线绘制一条穿过3-nt 峰值的线, 并从绘制的线读取峰值高度。
注: 定量极限约为 5 nm (25μl 注射中的 125 fmol)。
注意: ecd 中的电极会慢慢耗尽, 并且由于 sw 比的原因, 电极的极限会很高。 - 从3-nt 标准峰值准备一条回归线, 计算斜率, 并拦截。
- 将这些常数分配到下面的公式中, 并计算样本中的3-nt 内容, 如下所示。
样本 3–nt (nm) = [样品峰–截距]/斜率 eq. (1)
注: 标准曲线应很好地表示为 5 nm 和 500 nm 之间的直线。
- 计算空气环境中的3-nt 和样品小瓶中的 pm 7。
- 将3-nt 浓度乘以反应体积 (和稀释系数 (如果有的话), 并从圆圈中评估 pm 7 中的绝对3-nt 含量。
- 测量收集的过滤面积, 并通过以下公式计算总 pm 7 过滤器中的3-nt 含量。
总 pm7 = [3-nt 含量在 pm7的圆] x [pm7过滤面积与圆面积的比率] x 226.19 (在摩尔转换为克的情况下) eq (2) - 通过将 pm 7 除以总气流量或 pm7重量 (按步骤1.1.3 记录 ) 来评估空气环境中的3-nt 含量或 pm7 。
Representative Results
hplc-ecd 原理很简单。用高效液相色谱柱和流动相分离含有目标的样品, 在电化学检测器中减少和氧化分离的目标化合物。
在 hplc-ecd 系统中, 大约22分钟内检测到3-nt 峰值。ecd (pec-510 和 htec-500) 在 hplc 生产线上串联在一起。第一 ecd 减少了化合物中的羟基, 下一种方法氧化了还原的化学物质。ecd 具有 10-15 m 的高度敏感检测范围。hplc-ecd 系统的检测极限为 1.13 pg/m, 计算为10部分 x 3 的平均基部信号 (mv)。
图 4显示了代表性色谱图。通过分析纯3-nt 标准, 可以检测到具有稳定基线的确定峰 (图 4 a)。在下午7的3-nt 也测量使用6毫米, 圆形样品 (图 4b)。
在3-nt 检测能力的准确性方面, 在高效液相色谱中注入3-nt 标准时, 在20分钟的保留时间内检测到与3-nt 相对应的峰值。在 pm 样品中, 从其他物质中分离出 3-nt, 并在与标准相同的保留时间检测到独立峰。典型的标准曲线如图 5所示, 其中线性度在5到 40 nm 之间。线性度可达 500 nm (未显示数据)。
表 1显示了大气中的3-nt 含量, 计算为 pgm 3空气。在 #3 (pm7.3-4.5)中, pm2.5预过滤器中3-nt 的最高浓度。
图 1: tsp、pm7和 pm2.5的收集方案.(a) 总悬浮颗粒 (tsp) 直接收集到收集过滤器上 (流量为 1, 000 l/min)。(b) 收集 pm7时, 大颗粒由大小选择器排除 (流速为 1, 000 lmmin)。(c) pm2.5通过四个预过滤器收集 (流量为 116 lp min)。石英滤清器通常用作 pm7和 pm 2.5 的备份滤波器, 或作为 tsp的集合滤波器, 如下图所示。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 准备一个6毫米圆的圆圈.收集过滤器是使用直径为6毫米的空心冲床工具切割的。然后, 样品被储存在一个 1.5 ml 的微管中。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: hplc-ecd 系统示意图.在流动相流动的高效液相色谱柱中分离出注射样品中的3-nt。3-nt 被还原为氨基肌酸, 氧化为咪亚氨酸, 并在检测器中检测到电化学。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4: hplc-ecd 系统中的典型色谱图.(a) 由 hplc-ecd 系统进行纯3-nt 分析。(b) 用于检测3-nt 的 pm 7过滤器中的6毫米圆样品。一个3-nt 的峰值由一个箭头表示。请点击这里查看此图的较大版本.
图 5: 纯3-nt 样品的标准曲线.浓度较低的结果在另一张图中显示。请点击这里查看此图的较大版本.
| 主题 | 的天数 收集 |
点 | 3-nt (3 空气) |
|
| pm2。5 | 预过滤器 #1 | 27 | 4个 | 8.25±0.37 |
| 预过滤器 #2 | 27 | 4个 | 29.66±1.94 | |
| 预过滤器 #3 | 27 | 4个 | 74.37±4.09 | |
| 预过滤器 #4 | 27 | 4个 | 32.70±0.75 | |
| 背光 | 7。 | 5 | 4.21±0.91 | |
| pm7 | 背光 | 7。 | 1 | 8916±6.36 |
| Tsp | 滤波器 | 7。 | 1 | 10.34±2.09 |
表 1:3-nt 在大气中的 hplc-ecd 系统测量.利用 hplc-ecd 系统测量了每个滤清器的6毫米圆点。在同一时期收集了预过滤器 #1-#4。请注意, 空气中3-nt 的浓度受各种因素的影响, 如收集的日期、年份或位置。数据 (n = 3-10) 表示为标准误差的均值±。
Discussion
本文介绍了一种利用高灵敏度的 hplc-ecd 技术对石英滤清器上采集的机载 pm 中的3-nt 进行定量评价的方法。
一般情况下, 3-nt 测量方法已发展成为人类疾病氧化应激的生物标志物。基于抗体的方法 (例如, 酶联免疫吸附法) 被认为是半定量的, 因为没有严格的检测验证, 很难评估测试的可靠性。高效液相色谱法采用电化学检测 (ecd) 和质谱分析, 对 3-nt13的定量具有足够的灵敏度。虽然它们是敏感的质谱方法, 如 gc-ms 或 gc-msms 需要氨基酸的衍生, 而衍生化过程往往导致伪影14的形成.
与气相色谱和 lc 技术相比, hplc-ecd 的成本相对较低, 对测量3-nt 有足够的敏感性. 此外, gc-ms 和 lc-ms 的衍生步骤通常需要更多的时间。虽然这里介绍的方法需要16个小时的蛋白质消化步骤, 但它可以进行一夜之间 (如上所述, 每个样本大约需要30分钟的动手时间)。使用自动采样器进行自动重复测量可以提供高通量测量系统。此前的研究报告了在下午2,7中测量3-nt 的免疫学方法;然而, 由于下午1 5日的3-nt 含量较低, 这种方法在冬季无法检测到3-nt。
与其他标准方法相比, hplc-ecd 方法具有额外的优势;例如, (i) 这种方法不需要提取工艺, (二) 它完全不含洗涤剂, (三) 它的样品要求很小, 重要的是, 它具有较高的灵敏度。收集到过滤器上的粒子经常用声纳分离, 以便进一步研究, 包括对各种成分进行量化。洗涤剂还可用于从过滤器中分离出 pm 结合蛋白。然而, 这些额外的步骤增加了污染的风险, 样品损失, 并低估了由于提取效率, 而且, 大多数洗涤剂是不兼容的 lc/ms。在目前的 hplc-ecd 方法中, 采用简单的空心冲床, 无需额外的样品制备工艺, 即可轻松地将高效液相色谱样品从滤清器中分离出来。圆形样品的面积为28.3 毫米2, 与原来的石英过滤器的尺寸相比非常小 (8 x 10 英寸 = 203.2 x 254毫米 =56, 600 毫米 2)。
如前所述, 已仔细审查了 hplc-ecd 条件, 以避免干扰3-nt 信号。流动相的强酸性 ph 值和适当浓度的乙腈对检测非常重要。利用这些条件, 其他化合物, 包括硝基碱, 可以从硝基化合物中分离出来。目前的情况适用于从具有不同物理性质 (如颗粒物和等离子体) 的样品中检测3-nt。
为了评估空气中的 3-nt, 测量过滤器重量和消除背景是关键的步骤。一般来说, 大约100毫克的 pm7是在四到七天的时间内收集的;但是, 在 pm7收集前后, 有几个因素会影响滤清器的重量, 包括湿度和静电电荷。为了避免这些影响, 在等远等温度和湿度下, 滤清器重量需要长时间稳定。安装电子天平的地点应保持在稳定的环境中。对于样品制备, 纠正非特异性蛋白酶鸡尾酒和超滤膜的背景效应非常重要, 因为超滤膜通常显示出与3-nt 相似的峰值。
该方法可应用于其他颗粒, 包括室内环境中的颗粒。蛋白质的硝化可能会增加它们的过敏性潜力2。因此, 该方法有助于评价环境清洁度, 防止硝化应激。
在本研究中, 我们报告了一种高度敏感的测量方法大气3-nt 空气采样器过滤器易于操作和廉价的仪器。在大气中产生3-nt 与影响人类过敏性的环境污染物 (如 o3、no2、pm 蛋白和气象元素) 有关。总之, 本研究开发的方法可能有助于评估 o3、各种污染物和 pm 蛋白在各种气象条件下的大气反应。通过开发 hplc-ecd 来估计大气中的 3-硝基酪氨酸, 我们期望更好的环境清洁, 改善人类健康。
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者感谢美国环境保护署的 masayuki kubo 在 tspypm2.5采样方面提供的帮助。这项工作得到了 jsps kakenhi 赠款号码 JP16K15373 和 JP18H03039 的部分支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Quartz filter, backup quartz filter | PALL life sciences | 7204 | Tissuquatrz 2500QAT-UP, 8x10in |
| High-volume air sampler | SIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGY | HV-1000F | |
| Particle size selector for SPM | SIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGY | 080130-061 | SPM (suspended particulate matters) is defined in Japan that particles with 10 um of 100% cut-off diameter. SPM is almost identical to PM7. |
| Low-volume air sampler | SIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGY | AH-600F | |
| Size classification unit for PM2.5 | SIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGY | AH-600 | |
| Quartz filters for classification (PM4.5–2.5, PM7.3–4.5, PM15–7.3, and TSP-PM15) | Tokyo Dylec | AHQ-630 | |
| Non-specific protease cocktail | Roche | 11459643001 | Pronase from Streptomyces griseus |
| 3-Nitrotyrosine | SIGMA | N7389 | |
| Ultrafiltration membranes | Millipore | UFC5010BK | AMICON ULTRA 0.5 mL - 10kDa cutoff |
| ECD | Eicom | HTEC-500, PEC-510 | standalone HPLC-ECD unit (HTEC-510) and Pre-electrolysis cell (PEC-510), includes pump |
| HPLC column | Eicom | SC-5ODS | |
| Data processor | Eicom | EPC-300 | |
| Injector | Hitachi High-Tech Science | L-7200 | Auto sampler |
| Analyzing software | eDAQ Japan | ES280 | PowerChrom software |
References
- Castillo, J. A., Staton, S. J. R., Taylor, T. J., Herckes, P., Hayes, M. A. Exploring the feasibility of bioaerosol analysis as a novel fingerprinting technique. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 403 (1), 15-26 (2012).
- Franze, T., Weller, M. G., Niessner, R., Pöschl, U. Protein nitration by polluted air. Environmental Science & Technology. 39 (6), 1673-1678 (2005).
- Abe, R. Y., Akutsu, Y., Kagemoto, H. Protein amino acids as markers for biological sources in urban aerosols. Environmental Chemistry Letters. 14 (1), 155-161 (2016).
- D'Amato, G., et al. Allergenic pollen and pollen allergy in Europe. Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. 62 (9), 976-990 (2007).
- Bolzacchini, E., et al. Gas-phase reaction of phenol with NO3. Environmental Science & Technology. 35 (9), 1791-1797 (2001).
- Shiraiwa, M., et al. Multiphase chemical kinetics of the nitration of aerosolized protein by ozone and nitrogen dioxide. Environmental Science & Technology. 46 (12), 6672-6680 (2012).
- Gruijthuijsen, Y. K., et al. Nitration enhances the allergenic potential of proteins. International Archives of Allergy and Immunology. 141 (3), 265-275 (2006).
- Kubo, M., Ogino, K. Analytical Procedures for Nitrative/Nitrosative Stress. Studies on Pediatric Disorders. Tsukahara, H., Kaneko, K. , Humana Press. 149-158 (2014).
- Thomson, L. 3-nitrotyrosine modified proteins in atherosclerosis. Disease Markers. 2015, 708282 (2015).
- Kuhn, D. M., Sakowski, S. A., Sadidi, M., Geddes, T. J. Nitrotyrosine as a marker for peroxynitrite-induced neurotoxicity: the beginning or the end of the end of dopamine neurons? Journal of Neurochemistry. 89 (3), 529-536 (2004).
- Teixeira, D., Fernandes, R., Prudêncio, C., Vieira, M. 3-Nitrotyrosine quantification methods: Current concepts and future challenges. Biochimie. 125, 1-11 (2016).
- Hitomi, Y. H., et al. Disposition of protein-bound 3-nitrotyrosine in rat plasma analysed by a novel protocol for HPLC-ECD. Journal of Biochemistry. 141 (4), 495-502 (2007).
- Ogino, K., Wang, D. -H. Biomarkers of oxidative/nitrosative stress: an approach to disease prevention. Acta Medica Okayama. 61 (4), 181-189 (2007).
- Tsikas, D., Mitschke, A., Suchy, M. -T., Gutzki, F. -M., Stichtenoth, D. O. Determination of 3-nitrotyrosine in human urine at the basal state by gas chromatography-tandem mass spectrometry and evaluation of the excretion after oral intake. Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 827 (1), 146-156 (2005).
- Ito, T., Ogino, K., Nagaoka, K., Takemoto, K. Relationship of particulate matter and ozone with 3-nitrotyrosine in the atmosphere. Environmental Pollution. 236, 948-952 (2018).
