Summary
Vi presenterar en metod för att upptäcka 3-nitrotyrosine kemiska modifieringar av atmosfäriska proteiner med 6 mm diameter rundor klippt från air sampler differenstryckmätning med högpresterande liquid chromatography-elektrokemisk detektor (HPLC-ECD).
Abstract
3-nitrotyrosine (3-NT) genereras från tyrosin återstoden i atmosfäriska bio-aerosol proteiner via en reaktion med ozon (O3) och kvävedioxid (nr2). Stabil 3-NT är en specifik markör för oxidativ skada och rapporteras ha en hälsofrämjande effekt att framkalla allergier. I den aktuella studien redovisar vi utvecklingen av en mycket känslig analys att kvantifiera 3-NT i sampler luftfilter att samla < 2,5 µm partiklar (PM2,5) från urban miljö luft, inklusive bio-aerosol. I denna metod, en 6 mm diameter runda hål var klippt från filtren av luft provtagare och blandade med en ospecifik proteas cocktail för att hydrolysera proteiner. Protein prover rötas till amino syra nivå testades för 3-NT med högpresterande liquid chromatography-elektrokemisk detektor (HPLC-ECD). Den maximala halten i NT-3 upptäcktes i ett förfilter för PM i storlekar från 4,5 till 7,3 μm, med en detektionsgräns på 1,13 pg/m3.
Introduction
Aerosol eller luftburna PM innehåller proteiner från olika biologiska ursprung, inklusive virus, prokaryoter, svampar, växter (pollen) och djur (insekter, mänskliga)1. Förhållandet av proteinhalten i PM uppskattas till nästan 5%, som har varit inblandade för att spela en viktig roll som en luftburna allergen2. Senaste rapporterna tyder på att urban omgivande aerosol av olika storlekar innehåller aminosyror med nyckeltal varierar mellan 0,5% och 2%3. Dessutom har kemiska modifieringar av PM proteiner föreslagits genereras av reaktionerna av proteiner med olika föroreningar, såsom O3kvävedioxid (nr2) och svaveldioxid (SO2)4.
3-NT — en protein modifiering — genereras av nitrering av tyrosin rester. En högre koncentration av O3 och nr2 har visat sig främja nitrering av proteinmolekyler i pseudo atmosfäriska utrymme5,6. Nitrering av tyrosin restprodukter i kedjan polypeptid förbättrar allergiframkallande pollen proteiner7. Således, kvantifiering och utvärdering av luftburna 3-NT är en viktig aspekt att ta itu med oro för miljöhälsa.
3-NT är också känd som en biomarkör för oxidativ och nitrosative betona8. En växande mängd bevis har visat en signifikant samband 3-NT innehåll med flera mänskliga sjukdomar9,10. På grund av dess skadliga effekter håll identifiering och kvantitativ uppskattning av 3-NT i ett biologiskt prov stor relevans vid bedömningen av villkoret om individens hälsa. Under senare år har olika metoder har införts för att uppskatta 3-NT innehållet, inklusive glykoproteinenzymkopplad immunadsorberande analyser, HPLC, och LC/MS11. I tidigare studier, har vi rapporterat en detektionsmetod med HPLC-ECD tekniken skänkt med flera fördelar jämfört med tidigare metoder. Till exempel kräver den HPLC-ECD inte ett utvinning eller derivatisering förfarande som gör det en relativt enkel analys system12. Vi har bekräftat att denna metod är tillämplig att upptäcka 3-NT från biologiska prover (plasma från människa och råtta).
Även om många utredningar har betonat att upptäcka 3-NT i biologiska prover, dess upptäckt i nonbiological prover förblir svårfångade, och därmed den aktuella studien har bedrivits. I själva verket för att bedöma den skadliga effekten av luftburna 3-NT, en kvantitativ metod som är användbar för upptäcka 3-NT direkt från luftburna partiklar krävs; därför vi tillämpat den befintliga HPLC-ECD-metoden att upptäcka 3-NT från PM2.5 samlas in på ett glas-fiber filter. Med hjälp av tekniken, 3-NT kunde upptäckas direkt från små bitar (6 mm diameter runda hål) av provet från ett PM samling filter. Vi har vidare utvärderas innehållet i 3-NT för olika PM storlekar och mätt detektionsgränsen för 3-NT. Den här artikeln föreslår en hög-känslig och hög genomströmning metod för att upptäcka 3-NT direkt från både nonbiological och biologiska prover.
Protocol
1. insamling av totalt suspenderade partiklar, PM2.5, eller PM7och metoden hydrolys för PM proteiner
- Samla in PM från ett förfilter eller backup filter.
- Före samlingen av totala suspenderade partiklar (TSP), PM2.5och PM7, väg det quartz-filtret.
Obs: Eftersom kontaminering av PM proteiner och peptider inte bör påverka detektion av tyrosin nitrering (som de saknar sådan nitro grupp), vi inte behandla de quartz-filtret vid hög temperatur före mätningen. Dessutom var 3-NT innehållet i filtret kvarts under detektionsgränsen, som bestäms av HPLC-ECD. - Ange det quartz-filtret på en hög volym air sampler med en partikel storlek väljare att samla PM7 med en flödeshastighet på 1000 L/min kontinuerligt för 7 d (figur 1B). TSP kan samlas på ett quartz-filter utan en storlek väljare (figur 1A).
- Samla in PM2,5 med en låg volym air sampler med en storlek klassificering apparaten med en flödeshastighet på 116 L/min kontinuerligt för 7 d. använder denna enhet partiklar kan klassificeras som PM4.5-2,5, PM7,3-4.5, PM15-7,3och tsk-PM15 och samlas in på quartz-filter för klassificering. PM2.5 kan samlas in på ett backup filter (figur 1 c).
- Spela in volymen totala flödet vid tidpunkten för filtersamlingen. Mäta vikten av TSP, PM2.5och PM7 på filtren genom att subtrahera precollection vikt från postcollection vikt. Försegla filtret i en plastpåse och förvara den vid-30 ° C tills nästa steg (se avsnitt 2).
- Före samlingen av totala suspenderade partiklar (TSP), PM2.5och PM7, väg det quartz-filtret.
- Proteolyze proverna.
- Lös upp ospecifik proteas cocktail med en 0,1 M acetatbuffert (pH 7,4). Sätta lösningen i en dialys membran (molekylvikt cutoff = 5 000 Da) och fördjupa det i 1 L 0,1 M acetatbuffert under omrörning vid 4 ° C. Ersätt bufferten 2 x varje 12 h och sedan utföra dialys över natten för att ta bort endogena 3-NT och nitrit (nr2–). Efter dialysen, samla lösningen och mäta protein koncentrationen av bicinchoninic syra (BCA) protein assay.
- Stansa runda cirklar av 6 mm ur förfiltret eller backup filtret och sätta dem i mikrorör. Upp till fem stycken av 6 mm fraktioner kan användas för analys (figur 2).
- Tillsätt 300 µL 0,1 M acetatbuffert innehållande 50 µg av protein den ospecifik proteasen cocktail (bereddes i steg 1.2.1) till röret att hydrolysera PM proteinerna vid 50 ° C för 16 h med rotation.
Obs: Om du vill subtrahera endogena 3-NT från ospecifik proteas cocktail lösningen, det är nödvändigt att förbereda och smälta en ospecifik proteas cocktail-bara provet. - Skölj ultrafiltrering membranet tillsammans med sin medföljande röret genom att lägga till 0,1 M acetatbuffert och centrifugering (10 000 x g för 30sek; den exakta hastigheten beror på membranet), på grund av kontaminerande kemikalier liknar 3-NT i membranet. Upprepa sköljningen 1 x.
- Efter proteolys, Centrifugera proverna vid 2500 x g i 10 min. belastning supernatanten i ultrafiltrering membranet och centrifugera det 10 000 x g och 4 ° C för ultrafiltrering (MWCO = 10,000), tills tillräcklig volym elution samlas. Lagra eluat vid 4 ° C i mörker.
Varning: På grund av att upptäcka en liknande topp 3-NT i kolumnen spin är det nödvändigt att tvätta den noga med rent vatten eller med en buffert såsom HPLC vatten och en 0,1 M acetatbuffert tidigare använda.
2. bestämning av 3-NT i tsk, PM2.5, och PM7via en högpresterande vätskekromatografi och elektrokemisk (HPLC-ECD) detektionssystem
Obs: Se figur 3.
- Förbereda den mobila fasen.
- Förbereda 0,2 M fosfat buffert (pH 2.5) innehållande 50 mg/L EDTA. Mäta av 98 volymer av bufferten och två volymer av acetonitril (HPLC-kvalitet), Häll dem i en ren glasflaska och blanda kraftigt med en mössa.
- Nöja sig med den mobila fasen i rumstemperatur flera timmar tills upplöst luften går platt.
Obs: Om systemet startas tidigare, den mobila fasen kan vara sonicated och avgasas i ett vakuum. Dock kommer att alltför avgasning ändra förhållandet mellan vatten och organiska fasen via avdunstning.
- HPLC-ECD systemet består av en pump, en HPLC-kolonnen, en degasser, en ECD och en injektor. Temperera den mobila fasen och stabilisera systemet för att minska buller och bakgrunden.
- Installera den mobila fasen och i HPLC-kolonnen i HPLC-systemet. Slå på HPLC pumpen och stabilisera kolumnen med den rörliga fasen med en flödeshastighet av 500 µL/min vid 25 ° C kolonntemperatur från dagen före startdag.
- Nästa dag antända ECD och ange parametrarna (minska spänningen vid-900 mV och magnetisering spänning vid 400 mV). Stabilisera den för minst 3 h.
- Mäta 3-NT koncentrationen i PM7.
- Förbereda olika koncentrationer av 3-NT standarder (5-500 nM) och en tom (utan den 3-NT standard och ospecifik proteasen cocktail, att se till att varken injektionsflaskan eller bufferten är förorenade) i en 0,1 M acetatbuffert.
- Kör HPLC registerföraren.
- Injektionsvolymen till 25 µL. sätta ampuller prov i autoinjektor och set och verka på samma villkor i Rörlig fas och flöde som nämns i steg 2.2.1.
Obs: Om provberedningen är komplett, det bör prover, en standard (5-500 nM), en ospecifik proteas endast cocktail-provet och en tom flaska. - Kontrollera att baslinjen i kromatogrammet är platt och starta provet injektionen.
Obs: I allmänhet 3-NT upptäcks i 20-21 km; dock rekommenderas ca 30 min som den rinnande tiden per prov injektion. Annars kommer föroreningars toppar att ingå i nästa körning.
3. analys av kromatogram och kvantifiering av 3-NT innehållet i PM7
- Kontrollera den 3-NT-toppen i kromatogram och beräkna innehållet.
- Efter datainsamlingen, öppna filen kromatogrammet med analysprogram.
- Dra en linje över 3-NT topp från platt baslinjen och Läs topphöjden den ritade linjen.
Obs: Den kvantitativa gränsen är ca 5 nM (125 fmol i en 25 µL injektion).
FÖRSIKTIGHET: Elektroden i direktivet om elektronisk handel töms långsamt, och gränsen kommer att vara hög på grund av det S/N-förhållandet. - Förbereda en regressionslinje från 3-NT standard topparna, beräkna lutningen och avlyssna.
- Tilldela dessa konstanter i följande ekvation och beräkna 3-NT innehållet i proven enligt följande.
Prov 3-NT (nM) = [prova peak – avlyssna] / lutning ekv (1)
Obs: Standardkurvan bör vara väl representerade som en rak linje mellan 5 nM och 500 nM.
- Beräkna 3-NT i luften miljön och PM7 från injektionsflaskan med provet.
- Multiplicera 3-NT koncentrationen av reaktion volymen (och utspädningsfaktorn, om någon), och utvärdera absoluta 3-NT innehållet i PM7 från cirkeln.
- Mät insamlade filterområdet och räkna 3-NT innehållet i totala PM7 filter av följande ekvation.
Totalt PM7 = [3-NT innehållet i PM7 av cirkla] x [förhållandet mellan PM7 filterområdet till cirklaområdet] x 226.19 (när det gäller konvertering födelsemärken till gram) ekv (2) - Utvärdera 3-NT innehållet i luften miljön eller PM7 genom att dividera den totala PM7 med den totala luftmängden flöde eller PM7 vikt (inspelad i steg 1.1.3).
Representative Results
HPLC-ECD principen är enkel. Prover som innehåller målet avgränsas av HPLC-kolonnen och Rörlig fas och separerade mål föreningen är minskad och/eller oxideras i elektrokemiska detektorn.
I HPLC-ECD-systemet upptäcks en 3-NT topp i ca 22 minuter. ECDs (PEC-510 och HTEC-500) är anslutna parallellt i raden HPLC. Den första ECD minskar hydroxylgrupperna i föreningar, och nästa oxiderar de reducera kemikalierna. ECDs har en mycket känslig detektion rad 10-15 M. Detektionsgränsen för HPLC-ECD systemet var 1,13 pg/m3, som var beräknad som den genomsnittliga basala signalen (mV) 10 delar x 3.
Representativa kromatogram visas i figur 4. Genom att analysera en ren 3-NT-standard, en slutgiltig topp med en stabil baslinje kan vara upptäckt (figur 4A). 3-NT i PM7 mättes också med 6 mm, runda prover (figur 4B).
När det gäller noggrannheten hos 3-NT upptäckten anlagen, när en 3-NT standard injicerades i HPLC, upptäcktes toppen som motsvarar 3-NT en retentionstid på 20 minuter. I PM prover, 3-NT skildes från andra ämnen och oberoende toppen upptäcktes vid samma retentionstid som standard. En standardkurva visas i figur 5, där linjäritet observeras mellan 5 och 40 nM. Linjäritet kan ses upp till 500 nM (inga data anges).
Tabell 1 visar 3-NT innehållet i atmosfären, beräknat som pg/m3 luft. Den högsta koncentrationen av 3-NT i ett PM2.5 förfilter observerades i #3 (PM7,3-4,5).
Figur 1 : Insamlingssystem för TSP, PM7och PM2.5. (A) de totala suspenderade partiklarna (TSP) samlas in direkt på en samling filter (med en flödeshastighet på 1000 L/min). (B) när PM7 samlas, stora partiklar är uteslutna, genom en storlek väljare (med en flödeshastighet på 1000 L/min). (C), PM2.5 samlas in via fyra differenstryckmätning (med en flödeshastighet på 116 L/min). Ett quartz-filter används ofta som ett backup filter för PM7 och PM2.5 eller som en samling filter för TSP, som visas i denna figur. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Beredning av en 6 mm-runda cirkel. Collection filtret sänktes med en ihålig punch verktyg med en 6 mm diameter. Sedan har provet lagrats i en 1,5 mL mikrorör. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Schematisk bild av systemets HPLC-ECD. 3-NT i ett injicerat prov skildes i i HPLC-kolonnen genom vilken mobil fas flyter. 3-NT var reducerad till aminotyrosine oxideras till iminotyrosine och upptäckt elektrokemiskt i detektorn. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Typiskt kromatogram i systemet HPLC-ECD. (A) Pure 3-NT som analyseras av HPLC-ECD systemet. (B) 6 mm cirkel prov från ett PM7 filter används för att upptäcka 3-NT. En 3-NT topp indikeras av en pil. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 : Standardkurvan pure 3-NT prover. Resultaten vid en lägre koncentration anges i en annan graf. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Ämne | Dagar av Collection |
Plats | 3-NT (pg/m3 luft) |
|
| PM2, 5 | Förfilter #1 | 27 | 4 | 8,25 ± 0,37 |
| Förfilter #2 | 27 | 4 | 29.66 ± 1,94 | |
| Förfilter #3 | 27 | 4 | 74,37 ± 4.09 | |
| Förfilter #4 | 27 | 4 | 32.70 ± 0,75 | |
| BACKFILTER | 7 | 5 | 4,21 ± 0,91 | |
| PM7 | BACKFILTER | 7 | 1 | 89.16 ± 6,36 |
| TSK | Filtret | 7 | 1 | 10,34 ± 2,09 |
Tabell 1: 3-NT i atmosfären mätt av systemet för HPLC-ECD. 6 mm runda fläckar från varje filter mättes med hjälp av HPLC-ECD-systemet. Differenstryckmätning #1 - #4 samlades under samma period. Observera att koncentrationerna av 3-NT i luften påverkas av olika faktorer, såsom insamlade datum, år och plats. Data (n = 3-10) är representerade som det medelvärde ± standardavvikelse.
Discussion
Denna artikel beskriver en kvantifiering metod för att utvärdera 3-NT i luftburna PM samlat på quartz-filter med mycket känsliga HPLC-ECD tekniker.
I allmänhet har 3-NT mätmetoder utvecklats som biomarkörer för oxidativ stress i mänskliga sjukdomar. Antikroppsbaserade metoder (t.ex., den enzymkopplad immunosorbentanalys) betraktas som semikvantitativt eftersom det finns ingen strikt assay validering och det är svårt att bedöma testets tillförlitlighet. HPLC med elektrokemisk detektion (ECD) och mass spectrometry-baserade analyser har tillräcklig känslighet för kvantifiering av NT 3-13. Även om de är känsliga, mass spektrometri-baserade metoder som GC-MS eller GC-MS/MS kräver derivatisering av aminosyror, och processen för derivatisering ofta resulterar i bildandet av artefakter14.
Jämfört med både GC och LC tekniker, HPLC-ECD är relativt billigare och har en tillräcklig känslighet för åtgärd 3-NT. Dessutom steget derivatisering i GC-MS och LC-MS ofta kräver ytterligare tid. Även om metoden presenteras här kräver 16 timmar för protein matsmältningen steg, det kan dock utföras över natten (som beskrivits ovan, ca 30 minuter hands-on tid krävs per prov). Automatisk Upprepa mätning med hjälp av en autosampler föreskriva en hög genomströmning mätsystem. Tidigare studier har rapporterat immunologiska metoder att mäta 3-NT i PM2,7; sådana metoder kunde dock inte upptäcka 3-NT på vintern på grund av de låga nivåerna av 3-NT i PM15.
HPLC-ECD metoden har ytterligare fördelar över andra standardmetoder; exempelvis en extraktionsprocessen krävs inte i denna metod, (ii) det är helt fritt från rengöringsmedel, (iii) det har minimal prov krav och, ännu viktigare, (iv) den har hög känslighet. Partiklar som samlas in på filter är ofta åtskilda av ultraljudsbehandling för ytterligare undersökningar, inklusive kvantifiering av olika komponenter. Rengöringsmedel används också för att isolera PM-bundna proteiner från filter. Dock dessa ytterligare åtgärder ökar risken för kontaminering, prov förlust och underskattning på grund av utvinning effektivitet, och dessutom de flesta tvättmedel är oförenliga med LC/MS. I nuvarande HPLC-ECD-metoden kan HPLC prover lätt skiljas från filtret med hjälp av en enkel ihåliga punch och utan krav på ett ytterligare prov beredningsprocessen. Området i runda provet är 28,3 mm2som är mycket liten jämfört med storleken på det ursprungliga quartz-filtret (8 x 10 tum = 203,2 x 254 mm = 51,600 mm2).
HPLC-ECD villkoret har granskats noggrant för att undvika störningar på signalen 3-NT, som tidigare beskrivits12. En starkt sura pH Rörlig fas och en tillräcklig koncentration av acetonitril är viktigt för att upptäcka. Med dessa villkor, kan andra föreningar, inklusive nitro bas, skiljas från nitrotyrosine. Det nuvarande tillståndet är lämplig för detektion av 3-NT från prover med en annan fysisk egenskap (t.ex. partiklar och plasma).
För att utvärdera 3-NT i luften, mätning av filter vikt och eliminering av bakgrunden är kritiska moment. I allmänhet samlas över cirka 100 mg PM7 under en period av fyra till sju dagar. flera faktorer påverkar dock filter vikt före och efter samlingen PM7 , inklusive luftfuktighet och statisk elektrisk laddning. För att undvika dessa effekter, är stabiliseringen av filter vikt under långa perioder nödvändigt enligt subequal temperatur och luftfuktighet. Platsen där den elektroniska balansen är installerat bör hållas i en stabil miljö. För provberedning är det viktigt att korrigera bakgrund effekterna från den ospecifik proteasen cocktail och ultrafiltrering membranet, som ofta visar en liknande topp 3-NT.
Denna metod kan tillämpas på andra partiklar, bland annat i inomhusmiljöer. Nitrering av proteiner kan öka deras allergiframkallande potential2. Denna metod kan därför hjälpa att utvärdera miljö renlighet och förebygga nitrosative stress.
I denna studie redovisar vi en mycket känslig mätmetod för atmosfäriska 3-NT sampler luftfilter med billig utrustning för lätt att hantera. Generationen av 3-NT i atmosfären är associerad med miljögifter som O3, nr2, PM proteiner och meteorologiska faktorer som påverkar mänskliga allergiframkallande egenskaper. Sammanfattningsvis, kan den metod som utvecklats i denna undersökning hjälpa till att bedöma den atmosfäriska reaktionen O3, olika föroreningar och PM proteiner under olika meteorologiska förhållanden. Med dessa strävanden att utveckla HPLC-ECD för en uppskattning av 3-nitrotyrosine i atmosfären, räknar vi bättre miljö renlighet, förbättra människors hälsa.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Masayuki Kubo av den US Environmental Protection Agency för hans hjälp med tsk/PM2.5 provtagning. Detta arbete stöds delvis av JSPS KAKENHI Grant nummer JP16K15373 och JP18H03039.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Quartz filter, backup quartz filter | PALL life sciences | 7204 | Tissuquatrz 2500QAT-UP, 8x10in |
| High-volume air sampler | SIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGY | HV-1000F | |
| Particle size selector for SPM | SIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGY | 080130-061 | SPM (suspended particulate matters) is defined in Japan that particles with 10 um of 100% cut-off diameter. SPM is almost identical to PM7. |
| Low-volume air sampler | SIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGY | AH-600F | |
| Size classification unit for PM2.5 | SIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGY | AH-600 | |
| Quartz filters for classification (PM4.5–2.5, PM7.3–4.5, PM15–7.3, and TSP-PM15) | Tokyo Dylec | AHQ-630 | |
| Non-specific protease cocktail | Roche | 11459643001 | Pronase from Streptomyces griseus |
| 3-Nitrotyrosine | SIGMA | N7389 | |
| Ultrafiltration membranes | Millipore | UFC5010BK | AMICON ULTRA 0.5 mL - 10kDa cutoff |
| ECD | Eicom | HTEC-500, PEC-510 | standalone HPLC-ECD unit (HTEC-510) and Pre-electrolysis cell (PEC-510), includes pump |
| HPLC column | Eicom | SC-5ODS | |
| Data processor | Eicom | EPC-300 | |
| Injector | Hitachi High-Tech Science | L-7200 | Auto sampler |
| Analyzing software | eDAQ Japan | ES280 | PowerChrom software |
References
- Castillo, J. A., Staton, S. J. R., Taylor, T. J., Herckes, P., Hayes, M. A. Exploring the feasibility of bioaerosol analysis as a novel fingerprinting technique. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 403 (1), 15-26 (2012).
- Franze, T., Weller, M. G., Niessner, R., Pöschl, U. Protein nitration by polluted air. Environmental Science & Technology. 39 (6), 1673-1678 (2005).
- Abe, R. Y., Akutsu, Y., Kagemoto, H. Protein amino acids as markers for biological sources in urban aerosols. Environmental Chemistry Letters. 14 (1), 155-161 (2016).
- D'Amato, G., et al. Allergenic pollen and pollen allergy in Europe. Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. 62 (9), 976-990 (2007).
- Bolzacchini, E., et al. Gas-phase reaction of phenol with NO3. Environmental Science & Technology. 35 (9), 1791-1797 (2001).
- Shiraiwa, M., et al. Multiphase chemical kinetics of the nitration of aerosolized protein by ozone and nitrogen dioxide. Environmental Science & Technology. 46 (12), 6672-6680 (2012).
- Gruijthuijsen, Y. K., et al. Nitration enhances the allergenic potential of proteins. International Archives of Allergy and Immunology. 141 (3), 265-275 (2006).
- Kubo, M., Ogino, K. Analytical Procedures for Nitrative/Nitrosative Stress. Studies on Pediatric Disorders. Tsukahara, H., Kaneko, K. , Humana Press. 149-158 (2014).
- Thomson, L. 3-nitrotyrosine modified proteins in atherosclerosis. Disease Markers. 2015, 708282 (2015).
- Kuhn, D. M., Sakowski, S. A., Sadidi, M., Geddes, T. J. Nitrotyrosine as a marker for peroxynitrite-induced neurotoxicity: the beginning or the end of the end of dopamine neurons? Journal of Neurochemistry. 89 (3), 529-536 (2004).
- Teixeira, D., Fernandes, R., Prudêncio, C., Vieira, M. 3-Nitrotyrosine quantification methods: Current concepts and future challenges. Biochimie. 125, 1-11 (2016).
- Hitomi, Y. H., et al. Disposition of protein-bound 3-nitrotyrosine in rat plasma analysed by a novel protocol for HPLC-ECD. Journal of Biochemistry. 141 (4), 495-502 (2007).
- Ogino, K., Wang, D. -H. Biomarkers of oxidative/nitrosative stress: an approach to disease prevention. Acta Medica Okayama. 61 (4), 181-189 (2007).
- Tsikas, D., Mitschke, A., Suchy, M. -T., Gutzki, F. -M., Stichtenoth, D. O. Determination of 3-nitrotyrosine in human urine at the basal state by gas chromatography-tandem mass spectrometry and evaluation of the excretion after oral intake. Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 827 (1), 146-156 (2005).
- Ito, T., Ogino, K., Nagaoka, K., Takemoto, K. Relationship of particulate matter and ozone with 3-nitrotyrosine in the atmosphere. Environmental Pollution. 236, 948-952 (2018).
