Summary
Vi præsenterer en metode til påvisning af 3-nitrotyrosine kemiske modifikationer af atmosfærisk proteiner med 6 mm-diameter runder skåret fra luften prøveudtager prefilters ved hjælp af en højtydende liquid chromatography-elektrokemiske detektor (HPLC-ECD).
Abstract
3-nitrotyrosine (3-NT) er genereret fra tyrosin rester i atmosfærisk bio-aerosol proteiner via en reaktion med ozon (O3) og nitrogendioxid (NO2). Stabil 3-NT er en specifik markør for oxidative skader og er rapporteret at have en sundhedsfremmende effekt at fremkalde allergi. I den foreliggende undersøgelse rapport vi udviklingen af en yderst følsom analyse at kvantificere 3-NT i luften prøveudtager filtre til at indsamle < 2,5 µm af partikler (PM2,5) fra urban miljømæssigt air, herunder bio-aerosol. I denne metode, et 6 mm-diameter runde hul blev skåret fra filtre af luft prøvetagere og blandet med en uspecifik protease cocktail for at hydrolysere proteiner. Protein prøver fordøjet til aminosyre niveau blev testet for 3-NT bruger en højtydende liquid chromatography-elektrokemiske detektor (HPLC-ECD). Maksimalt 3-NT indhold blev fundet i et forfilter til PM i størrelser fra 4,5 til 7,3 μm, med en detektionsgrænse på 1,13 pg/m3.
Introduction
Aerosol eller luftbårne PM indeholder proteiner fra forskellige biologiske oprindelse, herunder vira, prokaryoter, svampe, planter (pollen) og dyr (insekter, menneskelige)1. Forholdet mellem proteinindhold i PM er anslået til at være næsten 5%, som har været impliceret for at spille en større rolle som en luftbårne allergener2. De seneste rapporter tyder på, at urban omgivende aerosol af forskellige størrelser indeholder aminosyrer med nøgletal mellem 0,5% og 2%3. Derudover er kemiske modifikationer af PM proteiner blevet foreslået til at blive genereret af reaktioner af proteiner med forskellige forurenende stoffer, såsom O3, nitrogendioxid (NO2), svovldioxid (SO2)4.
3-NT — et protein ændring — genereres ved nitrering af tyrosin restkoncentrationer. En højere koncentration af O3 og2 har vist sig at fremme nitrering af proteinmolekyler i pseudo atmosfæriske plads5,6. Nitrering af tyrosin restkoncentrationer i polypeptid kæde forbedrer pollen proteiner7allergifremkaldende potentiale. Kvantificering og vurdering af luftbårne 3-NT er således et vigtigt aspekt i varetagelse af miljø og sundhed.
3-NT er også kendt som en biomarkør af oxidative og nitrosative stress8. En nye række indicier har vist en betydelig sammenslutning af 3-NT indhold med flere menneskelige sygdomme9,10. På grund af dens skadelige virkninger holde påvisning og kvantitativ vurdering af 3-NT i en biologisk prøve stor relevans i fastsættelsen af en persons sundhedsmæssige tilstand. I de seneste år har forskellige metoder er blevet indført for at vurdere 3-NT indhold, herunder enzymmaerket assays, HPLC, og LC/MS11. I tidligere undersøgelser, har vi rapporteret en metode til påvisning ved hjælp af HPLC-ECD teknik skænket med flere fordele i forhold til tidligere metoder. HPLC-ECD kræver for eksempel, ikke en udvinding eller forædling procedure, hvilket gør det til en relativt simpel analyse system12. Vi har bekræftet, at denne metode kan anvendes til at opdage 3-NT fra biologiske prøver (plasma fra mennesker og rat).
Selv om mange undersøgelser har understreget påvisning af 3-NT i biologiske prøver, dens afsløring i nonbiological prøver er fortsat undvigende, og dermed den foreliggende undersøgelse er blevet ført. I virkeligheden, for at vurdere de skadelige virkninger af luftbårne 3-NT, en kvantitativ metode, der er nyttige til at opdage 3-NT direkte fra luftbårne partikler er påkrævet; Derfor, vi anvendte den eksisterende HPLC-ECD metode til at registrere 3-NT fra PM2.5 indsamlet på en glas-fiber filter. Ved hjælp af den teknik, 3-NT kunne påvises direkte fra små stykker (6 mm-diameter runde huller) i eksemplet fra en PM samling filter. Vi yderligere vurderet indholdet af 3-NT for forskellige PM størrelser og målt detektionsgraensen for 3 NT. Denne artikel foreslår en høj-følsomme og høj overførselshastighed metode til påvisning af 3-NT direkte fra både nonbiological og biologiske prøver.
Protocol
1. samling af Total suspenderet partikler, PM2.5, eller PM7og metoden hydrolyse til PM proteiner
- Indsamle PM fra en prefilter eller backup filter.
- Inden indsamlingen samlede suspenderede partikler (TSP), PM2.5og PM7veje quartz-filter.
Bemærk: Eftersom forurening af PM proteiner og peptider ikke bør påvirke påvisning af tyrosin nitrering (da de mangler sådan en nitro gruppe), vi ikke behandle quartz-filter på en høj temperatur før måling. Derudover var 3-NT indhold i quartz-filter under detektionsgrænsen, som bestemt ved HPLC-ECD. - Sæt quartz-filter på en høj-volumen luft sampler med en partikel størrelse vælger at indsamle PM7 med en væskehastighed på 1.000 L/min. uafbrudt i 7 d (figur 1B). TSK kan afhentes på et quartz-filter uden en størrelse selector (figur 1A).
- Indsamle PM2,5 med en lav-volumen luft prøvetager med en størrelse klassificering enhed med en væskehastighed på 116 L/min. kontinuerligt for 7 d. ved hjælp af denne enhed, partikler kan klassificeres som PM4.5-2,5, PM7.3-4.5, PM15-7.3og TSP-PM15 og indsamlet på quartz-filtre til klassificering. PM2.5 kan indsamles på en backup filter (figur 1 c).
- Optage samlede flow volumen på tidspunktet for filtersamlingen. Måle vægten af TSP, PM2.5og PM7 på filtre ved at fratrække den precollection vægt af postcollection vægt. Forsegle filteret i en plasticpose og opbevar den ved-30 ° C indtil den næste trin (Se afsnit 2).
- Inden indsamlingen samlede suspenderede partikler (TSP), PM2.5og PM7veje quartz-filter.
- Proteolyze prøver.
- Opløse uspecifik protease cocktail med en 0,1 M acetat buffer (pH 7,4). Sætte løsningen i en dialyse membran (Molekylær vægt cutoff = 5.000 Da) og fordybe den i 1 L 0,1 M acetat buffer med omrøring ved 4 ° C. Erstatte buffer 2 x hver 12 h, og derefter udføre dialyse natten over for at fjerne endogene 3-NT og nitrit (ingen2-). Efter dialyse, indsamle løsningen og måle proteinkoncentration af bicinchoninic syre (BCA) protein assay.
- Punch runde cirkler på 6 mm af forfilter eller backup-filter og sætte dem ind i microtubes. Op til fem stykker af 6 mm fraktioner kan bruges til analyse (figur 2).
- Tilsæt 300 µL af 0,1 M acetat buffer indeholdende 50 µg protein af de uspecifikke protease cocktail (udarbejdet i trin 1.2.1) til tube at hydrolysere PM proteiner ved 50 ° C i 16 h med rotation.
Bemærk: Hvis du vil trække endogene 3-NT fra uspecifik protease cocktail løsning, det er nødvendigt at forberede og fordøje en uspecifik protease cocktail-bare prøve. - Skyl ultrafiltrering membran sammen med dens medfølgende rør ved at tilføje 0,1 M acetat buffer og centrifugering (10.000 x g i 30 sek; den nøjagtige hastighed afhænger af membranen), på grund af forurenende kemikalier svarende til 3-NT i membranen. Gentag skyl 1 x.
- Efter proteolyse, centrifugeres prøver på 2.500 x g i 10 min. belastning supernatanten til ultrafiltrering membran og centrifugeres det på 10.000 x g og 4 ° C for ultrafiltrering (MWCO = 10.000), indtil tilstrækkeligt volumen af eluering er indsamlet. Gemme eluater ved 4 ° C i mørke.
OBS: På grund af påvisning af en lignende top 3-NT i kolonnen spin, det er nødvendigt at vaske det grundigt med rent vand eller med en buffer HPLC vand og en 0,1 M acetat buffer forudgående at bruge.
2. bestemmelse af 3-NT indhold i TSP, PM2.5og PM7via en High-performance væskekromatografi og elektrokemiske detektionssystem (HPLC-ECD)
Bemærk: Se figur 3.
- Forberede den mobile fase.
- Forberede 0,2 M fosfat buffer (pH 2,5) indeholdende 50 mg/L EDTA. Måle off 98 mængder af bufferen og to bind af acetonitril (HPLC renhed), hæld dem i en ren glasflaske og bland kraftigt med en fælles landbrugspolitik.
- Udligne den mobile fase ved stuetemperatur i flere timer indtil opløst luften går flad.
Bemærk: Hvis systemet er startet tidligere, den mobile fase kan være sonicated og afgasses under et vakuum. Dog vil over afgasning ændre forholdet mellem vand og organiske fase via fordampning.
- HPLC-ECD systemet består af en pumpe, en HPLC kolonne, en afgasser, en ECD og en injektor. Reagensglasset den mobile fase og stabilisere system for at reducere baggrund og støj.
- Installere den mobile fase og HPLC kolonne i HPLC-systemet. Drej på HPLC pumpen og stabilisere kolonnen med den mobile fase med en væskehastighed på 500 µL/min. ved 25 ° C kolonne temperatur fra dagen før dag.
- Den næste dag, antænde ECD og indstille parametre (reduktion af spændingen på-900 mV og excitation spænding på 400 mV). Stabilisere det for mindst 3 h.
- Mål koncentrationen af 3-NT i PM7.
- Forberede forskellige koncentrationer af 3-NT standarder (5-500 nM) og en tom (uden den 3-NT standard og uspecifik protease cocktail, for at sikre hverken hætteglasset eller bufferen er forurenet) i en 0,1 M acetat buffer.
- Køre HPLC dataprocessor.
- Læg prøven hætteglas i auto-injektor og sæt Injektionsvolumen til 25 µL. operere på samme vilkår i mobil fase og strømningshastigheden som nævnt i trin 2.2.1.
Bemærk: Hvis prøveforberedelsen er fuldført, der skal være prøver, en standard (5-500 nM), en uspecifik protease cocktail-bare prøve og en tom hætteglas. - Sørg for, at grundlinjen i kromatogrammet er flad og starter prøven injektion.
Bemærk: Generelt, 3-NT er opdaget i 20-21 min. ca. 30 min. anbefales dog som køretid pr. prøve. Ellers, forurenende toppe vil indgå i den næste kørsel.
3. analyse af kromatogrammer og kvantificering af 3-NT indhold i PM7
- Tjek 3-NT peak i kromatogrammer og beregne indholdet.
- Efter indsamling af data, skal du åbne filen kromatogrammet data med analyse software.
- Tegne en linje på tværs af 3-NT peak fra flad baseline og læse tophøjde fra den tegnede linje.
Bemærk: Det kvantitative loft er ca 5 nM (125 fmol i en 25 µL injektion).
Forsigtig: Elektroden i ECD bliver forarmet langsomt, og grænsen vil blive høj på grund af S/N-forhold. - Forberede en regressionslinje fra 3-NT standard toppe, beregne hældningen og opfange.
- Tildele disse konstanter i følgende ligning og beregne 3-NT indhold i prøverne som følger.
Prøve 3-NT (nM) = [prøve peak-opfange] / hældning Eq. (1)
Bemærk: Standardkurven skal være godt repræsenteret som en lige linje mellem 5 nM og 500 nM.
- Beregn 3-NT i air miljø og PM7 fra prøven hætteglas.
- Multiplicer 3-NT koncentration af reaktion volumen (og fortyndingsfaktoren, hvis nogen), og vurdere den absolutte 3-NT indhold i PM7 fra cirklen.
- Måle den indsamlede filtreringsområdet og beregne 3-NT indhold i den samlede PM7 filter ved følgende ligning.
Total PM7 = [3-NT indhold i PM7 af cirklen] x [forholdet PM7 filter område til området cirkel] x 226.19 (for konvertering modermærker at gram) Eq. (2) - Vurdere 3-NT indhold i air miljø eller PM7 ved at dividere den samlede PM7 med den samlede air flow volumen eller PM7 vægt (optaget i trin 1.1.3).
Representative Results
HPLC-ECD princippet er enkel. Prøver indeholdende målet er adskilt af HPLC kolonne og Mobil fase, og adskilte mål stof er reduceret og/eller oxideret i den elektrokemiske detektor.
I ordningen HPLC-ECD er en 3-NT peak opdaget i cirka 22 minutter. ECDs (PEC-510 og HTEC-500) er sluttet sammen i linjen HPLC. Den første ECD reducerer hydroxylgrupper i forbindelser, og næste oxiderer de reducerede kemikalier. ECDs har et meget følsomt registreringsområde af 10-15 M. Detektionsgraensen for HPLC-ECD system var 1.13 pg/m3, som blev beregnet som de gennemsnitlige basal signal (mV) af 10 dele x 3.
Repræsentative kromatogrammer er vist i figur 4. Ved at analysere en ren 3-NT standard, en definitiv peak med en stabil basislinje kan blive opdaget (figur 4A). 3-NT i PM7 blev også målt ved hjælp af 6 mm, runde-formet prøver (figur 4B).
Med hensyn til nøjagtigheden af 3-NT detektionsevne, når en 3-NT standard blev injiceret i HPLC, blev den top, der svarer til 3-NT fundet på en retentionstid på 20 minutter. I PM prøver, 3-NT var adskilt fra andre stoffer, og de uafhængige peak blev opdaget på den samme retentionstid som standard. En typisk standardkurven er vist i figur 5, hvor linearitet er observeret mellem 5 og 40 nM. Linearitet kan ses op til 500 nM (data ikke vist).
Tabel 1 viser 3-NT-indholdet i atmosfæren, beregnet som pg/m3 luft. Den højeste koncentration af 3-NT i en PM2.5 forfilter blev observeret i #3 (PM7.3-4.5).
Figur 1 : Indsamlingsordning for TSP, PM7og PM2.5. (A) de samlede suspenderede partikler (TSP) indsamles direkte på en samling filter (med en væskehastighed på 1.000 L/min). (B) når PM7 er indsamlet, store partikler er udelukket af en størrelse selector (med en væskehastighed på 1.000 L/min). (C) PM2.5 er indsamlet via fire prefilters (med en væskehastighed på 116 L/min). Et quartz-filter er almindeligt anvendt som en backup filter til PM7 og PM2.5 eller som en samling filter til tsk, som vist i denne figur. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Forberedelse af en 6 mm runde cirkel. Filteret samling blev skåret med et hul punch værktøj med en 6 mm diameter. Derefter, prøven var gemt i en 1,5 mL microtube. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Skematisk diagram af ordningen med HPLC-ECD. 3-NT injiceres prøve var adskilt i kolonnen HPLC hvorigennem Mobil fase strømmer. 3-NT var reduceret til aminotyrosine, oxideret til iminotyrosine og opdaget elektrokemisk i detektoren. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Typisk kromatogrammer i ordningen HPLC-ECD. (A) ren 3-NT analyseret ved HPLC-ECD system. (B) 6 mm cirkel prøve fra en PM7 filter anvendes til at påvise 3-NT. En 3-NT peak er angivet med en pil. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 : Standardkurven ren 3-NT prøver. Resultater ved en lavere koncentration er angivet i en anden graf. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Emne | Dage af Samling |
Spot | 3-NT (pg/m3 luft) |
|
| PM2, 5 | Forfiltrere #1 | 27 | 4 | 8,25 ± 0,37 |
| Forfiltrere #2 | 27 | 4 | 29.66 ± 1,94 | |
| Forfiltrere #3 | 27 | 4 | 74.37 ± 4.09 | |
| Forfiltrere #4 | 27 | 4 | 32.70 ± 0,75 | |
| Backfilter | 7 | 5 | 4,21 ± 0.91 | |
| PM7 | Backfilter | 7 | 1 | 89.16 ± 6.36 |
| TSK | Filter | 7 | 1 | 10.34 ± 2,09 |
Tabel 1: 3-NT i atmosfæren målt ved HPLC-ECD system. 6 mm cirkulære pletter fra hvert filter blev målt ved hjælp af HPLC-ECD system. Prefilters #1 - #4 blev indsamlet i samme periode. Bemærk, at koncentrationen af 3-NT i luften påvirkes af forskellige faktorer, såsom indsamlede dato, år eller placering. Data (n = 3-10) er repræsenteret som den gennemsnit ± standardafvigelsen.
Discussion
I denne artikel beskrives en kvantificering metode til at vurdere 3-NT i luftbårne PM indsamlet på quartz-filtre ved hjælp af meget følsomme HPLC-ECD teknikker.
Generelt er 3-NT målemetoder blevet udviklet som biomarkører for oxidativt stress i menneskelige sygdomme. Antistof-baserede metoder (fx, enzym-forbundet immunosorbent assay) betragtes som semi-kvantitative, fordi der er ingen strenge assay validering og det er vanskeligt at vurdere testens pålidelighed. HPLC med elektrokemisk detektion (ECD) og massespektrometri-baseret assays har tilstrækkelig følsomhed til kvantificering af 3-NT13. Selv om de er følsomme, massespektrometri-baseret metoder som GC-MS eller GC-MS/MS kræver forædling af aminosyrer, og processen med forædling ofte resulterer i dannelsen af artefakter14.
I forhold til både GC og LC teknikker, HPLC-ECD er relativt billigere og har en tilstrækkelig følsomhed til foranstaltning 3-NT. Derudover trinnet forædling i GC-MS og LC-MS ofte kræver ekstra tid. Selvom metoden præsenteres her kræver 16 timer for protein fordøjelse skridt, det kan, alligevel udføres natten over (som beskrevet ovenfor, ca. 30 minutters hands-on tid er påkrævet per prøve). Automatisk gentage måling ved hjælp af en autosampler kan give en høj overførselshastighed målesystem. Tidligere undersøgelser har rapporteret immunologiske metoder til at måle 3-NT i PM2,7; men sådanne metoder kunne ikke registrere 3-NT i vinterhalvåret på grund af det lave niveau af 3-NT i PM15.
Metoden HPLC-ECD har yderligere fordele i forhold til andre standard metoder; for eksempel, a en udpakningen er ikke påkrævet i denne metode, (ii) det er helt vaskemiddel-fri, (iii) det har minimal prøve krav og, vigtigere, (iv) det har høj følsomhed. Partikler, der er indsamlet på filtre er ofte adskilt ved hjælp af sonikering for yderligere undersøgelser, herunder kvantificering af forskellige komponenter. Vaske-og rengøringsmidler er også brugt til at isolere PM-bundet proteiner fra filtre. Men disse yderligere trin øge risikoen for kontaminering, prøve tab og undervurdering skyldes ekstraktionseffektivitet, og derudover de fleste rengøringsmidler er inkompatible med LC/MS. I den nuværende HPLC-ECD metode, kan HPLC prøver let adskilles fra filteret, ved hjælp af en simpel hul punch og uden behov for en ekstra prøve forberedelsesprocessen. Området i den runde-formet prøve er 28,3 mm2, som er meget lille sammenlignet med størrelsen af den oprindelige quartz-filter (8 x 10 tommer = 203.2 x 254 mm = 51,600 mm2).
HPLC-ECD betingelse er blevet gennemgået omhyggeligt for at undgå interferens med 3-NT signal, som tidligere beskrevet12. En stærk sure pH-værdi af mobil fase og en tilstrækkelig koncentration af acetonitril er vigtigt for registrering. Ved hjælp af disse betingelser, kan andre forbindelser, herunder nitro base, adskilles fra nitrotyrosine. Den nuværende tilstand er egnet til påvisning af 3-NT fra prøver med en anden fysisk egenskab (fx, partikler og plasma).
For at vurdere 3-NT i luften, måling af filter vægt og fjernelse af baggrunden er kritiske trin. Generelt er over ca. 100 mg PM7 indsamlet over en periode på fire til syv dage; imidlertid påvirker flere faktorer filter vægten før og efter samlingen PM7 , herunder fugtighed og statisk elektrisk ladning. For at undgå disse virkninger, er stabilisering af filter vægten i lange perioder nødvendige under subequal temperatur og fugtighed. Den placering, hvor den elektroniske balance er installeret bør opretholdes i et stabilt miljø. For prøveforberedelse er det vigtigt at rette baggrundseffekter fra de uspecifikke protease cocktail og ultrafiltrering membran, som ofte viser en lignende top 3-NT.
Denne metode kan anvendes på andre partikler, herunder i indendørs miljøer. Nitrering af proteiner kan øge deres allergifremkaldende potentiale2. Derfor, denne metode kan bidrage til at evaluere miljøet renlighed og forebygge nitrosative stress.
I denne undersøgelse rapport vi en yderst følsom målemetode for atmosfærisk 3-NT af sampler luftfiltre med let at håndtere og billige apparater. Generation af 3-NT i atmosfæren er forbundet med miljøforurening som O3, ingen2, PM proteiner og meteorologiske elementer, der påvirker menneskelige allergenicitet. Afslutningsvis kan metoden udviklet i denne undersøgelse bidrage til at vurdere den atmosfæriske reaktion O3, forskellige forurenende stoffer og PM proteiner under forskellige vejrforhold. Med disse bestræbelser for at udvikle HPLC-ECD for en vurdering af 3-nitrotyrosine i atmosfæren, forventer vi bedre miljømæssige renlighed, forbedring af menneskers sundhed.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Forfatterne takke Masayuki Kubo af den US Environmental Protection Agency for hans hjælp med TSP/PM2.5 prøveudtagning. Dette arbejde blev delvist understøttet af JSP'ER KAKENHI tilskud antal JP16K15373 og JP18H03039.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Quartz filter, backup quartz filter | PALL life sciences | 7204 | Tissuquatrz 2500QAT-UP, 8x10in |
| High-volume air sampler | SIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGY | HV-1000F | |
| Particle size selector for SPM | SIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGY | 080130-061 | SPM (suspended particulate matters) is defined in Japan that particles with 10 um of 100% cut-off diameter. SPM is almost identical to PM7. |
| Low-volume air sampler | SIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGY | AH-600F | |
| Size classification unit for PM2.5 | SIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGY | AH-600 | |
| Quartz filters for classification (PM4.5–2.5, PM7.3–4.5, PM15–7.3, and TSP-PM15) | Tokyo Dylec | AHQ-630 | |
| Non-specific protease cocktail | Roche | 11459643001 | Pronase from Streptomyces griseus |
| 3-Nitrotyrosine | SIGMA | N7389 | |
| Ultrafiltration membranes | Millipore | UFC5010BK | AMICON ULTRA 0.5 mL - 10kDa cutoff |
| ECD | Eicom | HTEC-500, PEC-510 | standalone HPLC-ECD unit (HTEC-510) and Pre-electrolysis cell (PEC-510), includes pump |
| HPLC column | Eicom | SC-5ODS | |
| Data processor | Eicom | EPC-300 | |
| Injector | Hitachi High-Tech Science | L-7200 | Auto sampler |
| Analyzing software | eDAQ Japan | ES280 | PowerChrom software |
References
- Castillo, J. A., Staton, S. J. R., Taylor, T. J., Herckes, P., Hayes, M. A. Exploring the feasibility of bioaerosol analysis as a novel fingerprinting technique. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 403 (1), 15-26 (2012).
- Franze, T., Weller, M. G., Niessner, R., Pöschl, U. Protein nitration by polluted air. Environmental Science & Technology. 39 (6), 1673-1678 (2005).
- Abe, R. Y., Akutsu, Y., Kagemoto, H. Protein amino acids as markers for biological sources in urban aerosols. Environmental Chemistry Letters. 14 (1), 155-161 (2016).
- D'Amato, G., et al. Allergenic pollen and pollen allergy in Europe. Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. 62 (9), 976-990 (2007).
- Bolzacchini, E., et al. Gas-phase reaction of phenol with NO3. Environmental Science & Technology. 35 (9), 1791-1797 (2001).
- Shiraiwa, M., et al. Multiphase chemical kinetics of the nitration of aerosolized protein by ozone and nitrogen dioxide. Environmental Science & Technology. 46 (12), 6672-6680 (2012).
- Gruijthuijsen, Y. K., et al. Nitration enhances the allergenic potential of proteins. International Archives of Allergy and Immunology. 141 (3), 265-275 (2006).
- Kubo, M., Ogino, K. Analytical Procedures for Nitrative/Nitrosative Stress. Studies on Pediatric Disorders. Tsukahara, H., Kaneko, K. , Humana Press. 149-158 (2014).
- Thomson, L. 3-nitrotyrosine modified proteins in atherosclerosis. Disease Markers. 2015, 708282 (2015).
- Kuhn, D. M., Sakowski, S. A., Sadidi, M., Geddes, T. J. Nitrotyrosine as a marker for peroxynitrite-induced neurotoxicity: the beginning or the end of the end of dopamine neurons? Journal of Neurochemistry. 89 (3), 529-536 (2004).
- Teixeira, D., Fernandes, R., Prudêncio, C., Vieira, M. 3-Nitrotyrosine quantification methods: Current concepts and future challenges. Biochimie. 125, 1-11 (2016).
- Hitomi, Y. H., et al. Disposition of protein-bound 3-nitrotyrosine in rat plasma analysed by a novel protocol for HPLC-ECD. Journal of Biochemistry. 141 (4), 495-502 (2007).
- Ogino, K., Wang, D. -H. Biomarkers of oxidative/nitrosative stress: an approach to disease prevention. Acta Medica Okayama. 61 (4), 181-189 (2007).
- Tsikas, D., Mitschke, A., Suchy, M. -T., Gutzki, F. -M., Stichtenoth, D. O. Determination of 3-nitrotyrosine in human urine at the basal state by gas chromatography-tandem mass spectrometry and evaluation of the excretion after oral intake. Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 827 (1), 146-156 (2005).
- Ito, T., Ogino, K., Nagaoka, K., Takemoto, K. Relationship of particulate matter and ozone with 3-nitrotyrosine in the atmosphere. Environmental Pollution. 236, 948-952 (2018).
