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3-ニトロチロシン大気環境を介して高性能液体クロマトグラフィー-電気化学検出器システムの検出

doi: 10.3791/58371 Published: January 30, 2019

Summary

高性能液体クロマトグラフィー-電気化学検出器 (HPLC-ECD) を使用して空気サンプラー プリフィルターからカット 6 mm ラウンド 3-ニトロチロシン大気タンパク質の化学修飾を検出する手法を提案します。

Abstract

3-ニトロチロシン (NT-3) は、バイオ エアロゾル蛋白質を介してオゾン (O3) と二酸化窒素 (2) 反応におけるチロシン残基から生成されます。安定した 3 NT は、酸化的損傷の特定のマーカーでアレルギーを引き出すために促進効果が報告されています。本研究ではバイオ粒子を含む都市の環境空気から空気サンプラー フィルター < 2.5 μ m の粒子状物質 (PM2.5) を収集するために 3 NT を定量化するための高感度測定法の開発を報告します。このメソッドでは、直径 6 mm の丸い穴が空気サンプラーのフィルターから切断され、タンパク質を加水分解するために非特異的なプロテアーゼのカクテルと混合します。アミノ酸レベルに消化される蛋白質のサンプル 3 NT 高性能液体クロマトグラフィー-電気化学検出器 (HPLC-ECD) を使用してテストされています。最大 3 NT コンテンツは、1.13 pg/m3の検出限界サイズ 4.5 から 7.3 μ m、午後のプレフィルターで検出されました。

Introduction

エアロゾルまたは空中時ウイルス、原核生物、菌類・植物 (花粉)、動物 (昆虫、人間)1を含む、様々 な生物学的起源からの蛋白質が含まれています。午後の粗蛋白質含有率は約 5% で、空中飛散アレルゲン2として主要な役割を果たすことに関与するいると推定されます。最近のレポートはその都市の様々 なエアロゾルをお勧めサイズ比の 0.5% と 23間に及ぶアミノ酸を含みます。さらに、O3、(2)、二酸化窒素や二酸化硫黄 (その2)4などのさまざまな汚染物質とタンパク質の反応による生成される PM タンパク質の化学修飾を提案されています。

3 NT-タンパク質修飾-チロシン残基のニトロ化によって生成されます。O3および2の高濃度は、疑似大気スペース5,6中のタンパク質分子のニトロ化を促進するために示されています。ポリペプチド鎖におけるチロシン残基のニトロ化花粉蛋白質7のアレルギーの可能性が向上します。したがって、定量化と空中 3 NT の評価は、環境衛生の懸念に対処で重要な側面です。

3 NT は酸化のバイオ マーカーとも呼ばれます、nitrosative ストレス8。証拠の出現ボディは、いくつかの人間の病気9,103 NT コンテンツの有意な関連を示しています。その有害な影響、検出および生体試料中 3 NT の定量的評価のための個々 の健康状態を決定する上で偉大な関連性を保持します。近年、多様な方法を用いて推定する 3 NT、酵素抗体法、高速液体クロマトグラフィーを含む導入されていると LC/MS11。以前の研究で我々 は以前の方法に比べていくつかの利点を与えられた HPLC-ECD 法を用いた検出法を報告しています。たとえば、高速液体クロマトグラフィー ECD にはこれは比較的単純なアッセイ システム12抽出・誘導体化手順は不要です。このメソッドは 3-NT (人間からプラズマとラット) の生体サンプルからの検出に適用できることを確認しました。

多くの研究は、生体試料中 3 NT の検出を強調している、非生物学的サンプルで検出は、とらえどころのないまま、したがって本研究が追求されてきた。実際には、空気中の有害な効果を評価する 3 NT、浮遊粒子から直接 3 NT の検出に有用な定量的な方法が必要です。検出する既存 HPLC-ECD 手法を適用したがって、午後から 3 NT2.5ガラス繊維フィルター上で収集します。使用して技術、3 NT を小から直接検出でした午後コレクション フィルターからサンプルの (6 mm 径丸穴) の作品。さらに、様々 な PM サイズの 3 NT の内容を評価し、3 NT の検出限界を測定します。本稿は、非生物学的及び生体試料から直接 3 NT を検出するための高感度と高スループット方法を提案する.

Protocol

1. 合計中断午後タンパク質の粒子、PM2.5、または午後7、および加水分解法

  1. プレフィルターまたはバックアップ フィルターから PM を収集します。
    1. 総浮遊粒子 (TSP)、PM2.5、および午後7集の前に水晶フィルターの重量を量る。
      注: 与え午後タンパク質・ ペプチドによる汚染ニトロ化チロシンの検出に影響はありません (彼らはこのようなニトロ グループを欠いている) として、我々 は高温測定の前に水晶フィルターを治療しませんでした。さらに、水晶フィルターで 3 NT コンテンツは検出限界の下にあった HPLC-ECD によって決定されます。
    2. 7 d (図 1 b) の継続 1,000 L/分の流量で午後7を収集する粒子サイズ セレクター付き大容量空気サンプラーに水晶フィルターを設定します。TSP は、水晶フィルター サイズ セレクター (図 1 a) なしに収集できます。
    3. PM2.5 7 連続 116 L/分の流量でサイズの分類単位で少量の空気サンプラーの使用を収集 d. このユニットを使用して粒子を小さじ PM15、午後15 7.3、午後7.3 4.5PM4.5 2.5に分類できます、水晶フィルターの分類のために収集します。PM2.5は、バックアップ フィルター (図 1) に収集できます。
    4. フィルター コレクションの時に積算流量を記録します。TSP は、重量を測定午後2.5、および postcollection 重量から precollection の重量を差し引くことによってフィルターに PM7 。ビニール袋にフィルターのシール、-30 ° C で次のステップ (セクション 2 を参照) まで保存できます。
  2. Proteolyze サンプル。
    1. 0.1 M 酢酸緩衝液 (pH 7.4) と非特異的なプロテアーゼ カクテルを溶解します。透析膜に溶液を入れ (カットオフ分子量 5,000 Da =) し、4 ° C で攪拌しながら 0.1 M 酢酸緩衝液 1 リットルに浸してすべての 12 h × 2 バッファーを交換し、内因性 3 NT および亜硝酸 (2-) を除去するために夜間透析を行います。透析後ソリューションを収集し、ビシンコニン酸 (BCA) 蛋白質の試金によってタンパク質の濃度を測定します。
    2. プリフィルターまたはバックアップ フィルターから 6 mm の丸い円をパンチ、マイクロ チューブに入れてください。最大 6 mm の分数の 5 個は、分析 (図 2) を使用できます。
    3. 0.1 M 酢酸緩衝液 50 μ g のカクテル非特異的なプロテアーゼのタンパク質 (1.2.1 の手順で準備) 回転 16 h 50 ° C で午後蛋白質を加水分解管を含む 300 μ L を追加します。
      注: 内因性を減算するには、非特異的なプロテアーゼ カクテル ソリューションから 3 NT 必要がある準備し、非特異的なプロテアーゼのカクテルのみのサンプルをダイジェストに
    4. 0.1 M 酢酸緩衝液を追加し、遠心分離によって、供給管と限外ろ過膜をリンス (30 秒; 10,000 x g 正確な速度は膜に依存)、膜の 3 NT と同様の化学物質の汚染のため。繰り 1 x。
    5. 後分解限外ろ過膜に 2,500 x g で 10 分間負荷上澄みでサンプルを遠心し、10,000 x g と限外ろ過のための 4 ° C で遠心分離機 (MWCO = 10,000)、十分な溶出量が収集されるまで。暗闇に 4 ° C で溶出を格納します。
      注意: スピン欄 3 NT に類似したピークの検出、原因必要だ HPLC 水などバッファーと事前 0.1 M 酢酸緩衝を使用する、きれいな水でよく洗浄します。

2. 電気化学検出高速液体クロマトグラフィー ECD) システムと午後7を介して高速液体クロマトグラフィー PM2.5、小さじ 3 NT の定量

注: は、図 3を参照してください。

  1. 移動相を準備します。
    1. 0.2 M リン酸緩衝液 (2.5) 含む 50 mg/L EDTA を準備します。バッファーの 98 ボリュームとアセトニ トリル (HPLC 級) の 2 つのボリュームを測定、きれいなガラス瓶にそれらを注ぐ、キャップと精力的にミックスします。
    2. 溶存空気がきっかりまで数時間室温で移動相を解決します。
      注: 場合は、システムを起動する前、移動相超音波処理でき真空下で脱泡します。ただし、過度の脱気水と蒸発による有機相の比率が変更されます。
  2. HPLC-ECD システムはポンプ、HPLC カラム、脱ガス装置、ECD、インジェクターから成っています。移動相の平衡し、背景成分やノイズを低減し、システムを安定させます。
    1. 高速液体クロマトグラフィーにおける HPLC カラムと移動相をインストールします。高速液体クロマトグラフィー ポンプをオンにし、開始日の前日から 25 ° C カラム温度で 500 μ L/分の流量で移動相を持つ列を安定させます。
    2. 次の日、ECD を発火し、パラメーターを設定 (-900 で還元電圧 mV と励起電圧 400 mV)。少なくとも 3 時間それを安定させます。
  3. 午後73 NT 濃度を測定します。
    1. 0.1 M 酢酸緩衝液で 3 NT 基準 (5-500 nM) と空白の様々 な濃度 (なし 3 NT の標準および非特異的カクテル、バイアルもバッファーを確認するプロテアーゼが汚染されている) を準備します。
    2. 高速液体クロマトグラフィー データ プロセッサを実行します。
    3. 25 μ L を注入量自動注射器とセットでサンプル瓶を置く移動相の流量ステップ 2.2.1 で述べたように同じ条件を動作します。
      注: サンプルの準備が完了したら場合、必要がありますサンプル、標準 (5-500 nM)、非特異的なプロテアーゼのカクテルのみのサンプルおよび空バイアル。
    4. クロマト グラムのベースラインがフラットであることを確認し、サンプル注入を開始します。
      注: 一般に、3 NT が検出された 20 21 分;ただし、サンプル注入あたりの実行時間としては、約 30 分の使用をお勧めします。それ以外の場合、次の実行の汚染ピーク表示されます。

3. クロマト グラム及び午後7 3 NT コンテンツの定量化の分析

  1. クロマト グラムで 3 NT ピークを確認し、内容を計算します。
    1. データ収集後解析ソフトウェアでクロマト グラム データ ファイルを開きます。
    2. 3 NT ピーク平坦な基線から線を描くし、線からピーク高さを読み取る。
      注: 定量限界は約 5 nM (25 μ L 注入の 125 fmol)。
      注意: は、ECD の電極を徐々 に使い尽くすし、限界は S/N 比のため高くなります。
    3. 3 NT 標準ピークから回帰直線を準備、計算、斜面とインターセプトします。
    4. 以下の式にこれらの定数を割り当て、3 NT 含有試料を次のように計算します。
      サンプル 3-NT (nM) = [サンプル ピーク-インターセプト] ・斜面, 式 (1)
      注: 標準的なカーブ、よくとして表現されます 5 間の直線 nM と 500 nM。
  2. 空気環境でサンプル バイアルから午後7 3 NT を計算します。
    1. 反応体積 (と希釈因子であれば)、3 NT 濃度を乗算し、午後7円から絶対 3 NT コンテンツを評価します。
    2. 収集したフィルター区域を測定し、合計午後 3 NT コンテンツを計算する次式により7フィルター。
      合計午後7 = [円の午後7 3 NT 内容] × [サークル周辺午後7フィルター領域の比率] (モグラをグラムに変換する) 場合 226.19 x 式 (2)
    3. 総風量または PM 総午後7で割って空気環境または午後7 3 NT コンテンツを評価7重量 (1.1.3 のステップで記録されて)。

Representative Results

HPLC-ECD 原理は簡単です。対象を含むサンプルは HPLC カラムと移動相によって区切られ、区切られたターゲット化合物の減少や電気化学検出器で酸化。

HPLC-ECD システム 3 NT ピークは約 22 分で検出されます。(PEC 510 と HTEC 500) は、HPLC ラインでタンデムで接続されます。最初の ECD 減らし、化合物中の水酸基、次の酸化還元化学物質。は、10-15 M の高感度検出範囲を持っています。HPLC-ECD システムの検出限界であった 1.13 pg/m3、10 部分 x 3 の平均の基底信号 (mV) として計算されました。

代表的なクロマト グラムを図 4に示します。純粋な 3 NT 標準を分析することによって安定したベースラインで明確なピークがすることができます (図 4 a) を検出します。午後の 3 NT7も計測した 6 mm、丸い形のサンプル (図 4 b)。

3 NT 検出能力の精度に関する 3 NT 標準 HPLC に注入された保持時間は 20 分で 3 NT に対応するピークが検出された.午後のサンプルで他の物質から分離された 3 NT、標準と同じ保持時間で独立したピークが検出されました。典型的な標準的な曲線は、図 5、5 と 40 nM の間の直線性を観察する場所に表示されます。500 まで直線性を見ることができる nM (データは示されていない)。

雰囲気の中、pg/m3の空気として計算 3 NT 内容を表 1に示します。PM2.5プレフィルターの 3 NT の最高濃度は、#3 (午後7.3 4.5) で観察されました。

Figure 1
図 1: Tsp 問題で、コレクション スキーム午後7、および午後2.5 。(A) 合計懸濁粒子 (TSP) (1,000 L/分の流量) でコレクションのフィルターに直接収集されます。(B) 午後7を収集すると、大きな粒子は (1,000 L/分の流量) でサイズのセレクターによって除外されます。(C) 午後2.5 (116 L/分の流量) で 4 つのプリフィルターを介して収集されます。水晶フィルター、使用されます午後7午後2.5バックアップ フィルターまたはの TSP は、収集用フィルターとしてこの図のように。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2: 6 mm ラウンド サークルの準備。コレクション フィルターは、直径 6 mm の中空パンチツールを使用して切られました。その後、サンプルは、1.5 mL マイクロ チューブに格納されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 3
図 3: HPLC-ECD システムの概略図。注入されたサンプルの 3 NT は流れる移動相を HPLC カラムで分離されました。3 NT だった aminotyrosine に減少、iminotyrosine、酸化、電気化学検出器で検出されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 4
図 4: HPLC-ECD における代表的なクロマト グラム。(A) 純粋な 3-NT HPLC-ECD システムによって分析します。(B) 6 mm 円サンプル午後7フィルターから 3 NT の検出に使用します。3 NT ピークは、矢印で示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 5
図 5: 純粋な 3 NT サンプルの標準曲線。低濃度での結果は、別のグラフで示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

件名
コレクション
スポット 3 NT
(pg/m3の空気)
PM2.5 プレフィルター # 1 27 4 8.25 ± 0.37
プレフィルター # 2 27 4 29.66 ± 1.94
プレフィルター # 3 27 4 74.37 ± 4.09
プレフィルター # 4 27 4 32.70 ± 0.75
Backfilter 7 5 4.21 ± 0.91
PM7 Backfilter 7 1 89.16 ± 6.36
小さじ フィルター 7 1 10.34 ± 2.09

表 1: HPLC-ECD システムで測定した大気中の 3 NT 。各フィルターから 6 mm の円形スポットは、HPLC-ECD システムを使用して測定しました。プリフィルター #1-#4 は、同じ期間に収集されました。3-NT 空気中の濃度が収集された日付、年、または場所など、さまざまな要因の影響を受けますことに注意してください。データ (n = 3-10)、標準誤差、平均 ± で表されます。

Discussion

この資料では、高感度 HPLC ECD の技術を使用して水晶フィルターに捕集した空中 PM で 3 NT を評価する定量化について説明します。

一般に、人間の病気の酸化ストレスのバイオ マーカーとして 3 NT 測定法が開発されています。抗体を用いた方法 (例えば、酵素免疫測定法) は、厳密な分析の検証がないと、テストの信頼性を評価することは困難だため半定量として考慮されます。電気化学検出 (ECD) と質量分析を用いたアッセイ HPLC 3 NT13の定量化のための十分な感度があります。彼らは敏感で、GC-MS のように質量分析を用いた方法または GC-MS/MS を必要とするアミノ酸の誘導体化、しばしば誘導体化のプロセスの結果の成果物14の形成。

GC、LC の両方の技術と比較して、高速液体クロマトグラフィー ECD は比較的安価と 3 測定に十分な感度を有する-NT。 さらに、GC-MS と LC MS の誘導体化手順よく時間が長くなります。ここで紹介した方法では、蛋白質の消化手順 16 時間が必要ですが、それをもって一晩に実施される、それにもかかわらず、(前述のように、実践的な時間の約 30 分はサンプルごとに必要)。高スループット計測システム、オートサンプラーによる自動繰り返し測定があります。以前の研究は、免疫学的方法で測定を報告している午後2,7; 3 NTしかし、このようなメソッドは、午後153 NT の低レベルのための冬のシーズンで 3 NT を検出できませんでした。

HPLC-ECD 法は他の標準的な方法で付加的な利点たとえば、(i)、抽出プロセスはこの方法では必要ありません、(ii) それは完全に洗剤無料、(iii) 最小限のサンプルの要件、有し、重要なは、(iv) 高感度。フィルター上に集め、粒子は、さまざまなコンポーネントの数量を含むそれ以上の調査のための超音波でよく区切られます。洗剤も午後バインド フィルターからタンパク質を分離するために使用されます。ただし、これらの追加手順汚染、サンプルの損失、および抽出効率のため過小評価のリスクが高まるし、さらに、ほとんどの洗剤が液体クロマトグラフィー/質量と互換性のあります。現在 HPLC-ECD 法 HPLC サンプル簡単に分離できますフィルターから単純な中空パンチを使用し、その他のサンプル調製の必要なし。丸い形のサンプルの面積は 28.3 mm2は元の水晶フィルターのサイズと比較して非常に小さい (10 インチ x 8 = 203.2 x 254 mm = 51,600 mm2)。

HPLC-ECD 条件は 3 NT 信号への干渉を避けるために慎重に検討されている12を前述のよう。移動相の強い酸性 pH とアセトニ トリルの十分な濃度検出のため重要です。これらの条件を使用して、ニトロチロシンから基本、ニトロを含む他の化合物を分離できます。現状は異なる物理的性質 (例えば、粒子状物質及びプラズマ) のサンプルから 3 NT の検出に適しています。

評価、空気中 3 NT フィルター重量の測定とバック グラウンドの除去に重要なステップ。一般に、PM7の約 100 mg 以上は収集 4 から 7 日の期間ただし、いくつかの要因は湿度と静的な電荷を含む午後7コレクションの前後に、フィルター重量に影響を与えます。これらの効果を避けるためには、長い期間フィルター重量の安定化は subequal の温度と湿度の下で必要です。電子天秤がインストールされている場所は、安定した環境で維持しなければなりません。サンプル準備のためしばしば 3 NT に似たようなピークを示す非特異的なプロテアーゼのカクテルから背景の効果と限外ろ過膜を修正することが重要です。

このメソッドは、屋内環境を含め、他の粒子に適用できます。蛋白質のニトロ化は、自分のアレルギーの潜在的な2を高める可能性があります。したがって、このメソッドは、環境の清浄度を評価し、nitrosative ストレスを防ぐために役立つことがあります。

本研究では、空気サンプラー フィルター ハンドル簡単で安価な装置の大気 3 NT の高感度測定法を報告します。大気中の 3 NT の生成は、O32、午後タンパク質、さらに人間のアレルギー誘発性に影響を及ぼす気象要素などの環境汚染物質に関連付けられます。結論として、本研究で提案する手法は、O3、様々 な汚染物質とさまざまな気象条件の下で午後蛋白質の大気反応を評価するために役立つことがあります。3-ニトロチロシン大気中の推定高速液体クロマトグラフィー ECD の開発のこれらの努力は人間の健康を向上させるより良い環境清浄度を期待しています。

Disclosures

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgments

著者は、小さじ/午後2.5サンプリングの彼の助けのための米国環境保護庁の雅之久保をありがとうございます。この作品は、日本学術振興会科研費助成番号 JP16K15373 と JP18H03039 によって部分で支えられました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Quartz filter, backup quartz filter PALL life sciences 7204 Tissuquatrz 2500QAT-UP, 8x10in
High-volume air sampler SIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGY HV-1000F
Particle size selector for SPM SIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGY 080130-061 SPM (suspended particulate matters) is defined in Japan that particles with 10 um of 100% cut-off diameter.  SPM is almost identical to PM7.
Low-volume air sampler SIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGY AH-600F
Size classification unit for PM2.5 SIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGY AH-600
Quartz filters for classification (PM4.5–2.5, PM7.3–4.5, PM15–7.3, and TSP-PM15) Tokyo Dylec AHQ-630
Non-specific protease cocktail Roche 11459643001 Pronase from Streptomyces griseus 
3-Nitrotyrosine SIGMA N7389
Ultrafiltration membranes Millipore UFC5010BK AMICON ULTRA 0.5 mL - 10kDa cutoff
ECD Eicom HTEC-500, PEC-510 standalone HPLC-ECD unit (HTEC-510) and Pre-electrolysis cell (PEC-510), includes pump
HPLC column Eicom SC-5ODS
Data processor Eicom EPC-300
Injector Hitachi High-Tech Science  L-7200 Auto sampler
Analyzing software eDAQ Japan ES280  PowerChrom software

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References

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3-ニトロチロシン大気環境<em>を介して</em>高性能液体クロマトグラフィー-電気化学検出器システムの検出
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Ito, T., Ogino, K., Nagaoka, K., Takemoto, K., Nishiyama, R., Shimizu, Y. Detection of 3-Nitrotyrosine in Atmospheric Environments via a High-performance Liquid Chromatography-electrochemical Detector System. J. Vis. Exp. (143), e58371, doi:10.3791/58371 (2019).More

Ito, T., Ogino, K., Nagaoka, K., Takemoto, K., Nishiyama, R., Shimizu, Y. Detection of 3-Nitrotyrosine in Atmospheric Environments via a High-performance Liquid Chromatography-electrochemical Detector System. J. Vis. Exp. (143), e58371, doi:10.3791/58371 (2019).

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