Enregistrement électrophysiologique de l’activité du système nerveux Central du troisième stade de Drosophila Melanogaster
Summary
Ce protocole décrit une méthode pour enregistrer l’activité électrique descendante du système nerveux central Drosophila melanogaster pour permettre le rapport coût-efficacité et pratique essais d’agents pharmacologiques, les mutations génétiques des protéines neuronales, et/ou le rôle des voies physiologiques inexplorées.
Abstract
La majorité des insecticides disponibles actuellement cible le système nerveux et des mutations génétiques des protéines neuronales invertébrés donnent souvent des conséquences délétères, mais les méthodes actuelles pour l’enregistrement de l’activité du système nerveux d’un individu l’animal est coûteuse et laborieuse. Cette aspiration électrode préparation du troisième stade larvaire central nerveux système de Drosophila melanogaster, est un système souple pour tester les effets physiologiques des agents de neuroactive, déterminer le rôle physiologique des différents neurones voies d’activité de la CNS, ainsi que l’influence de mutations génétiques à fonction neurale. Cette préparation ex vivo nécessite seulement modérée disséquant les compétences et l’expertise électrophysiologique générer des enregistrements reproductibles de l’activité neuronale insecte. Une grande variété de modulateurs chimiques, y compris les peptides, puis peut être appliquée que directement sur le système nerveux en solution avec du sérum physiologique pour mesurer l’influence sur l’activité de la CNS. Technologies plus, génétiques, comme le système de GAL4/UAS, peuvent être appliquées indépendamment ou en collaboration avec des agents pharmacologiques afin de déterminer le rôle des canaux ioniques spécifiques, transporteurs ou récepteurs d’arthropode fonction CNS. Dans ce contexte, les essais décrits dans les présentes sont d’un intérêt majeur pour les toxicologues insecticide insectes physiologistes et des biologistes du développement pour laquelle d. melanogaster est un organisme modèle établi. Le but du présent protocole est de décrire une méthode électrophysiologique pour permettre la mesure de l’électrogénèse du système nerveux central chez l’insecte modèle, Drosophila melanogaster, qui est utile pour tester une diversité des scientifiques hypothèses.
Introduction
L’objectif global de cette approche est de permettre aux chercheurs de mesurer rapidement l’électrogénèse du système nerveux central (SNC) chez l’insecte modèle, Drosophila melanogaster. Cette méthode est fiable, rapide et rentable d’effectuer l’expérimentation physiologique et toxicologique. Le CNS est essentiel pour la vie et par conséquent, les voies physiologiques essentiels pour le bon fonctionnement neuronal ont été explorées intensivement dans un effort pour comprendre ou modifier la fonction neurale. Caractérisation des voies de signalisation dans le système nerveux central arthropod a permis la découverte de plusieurs classes chimiques des insecticides qui perturbent la fonction neurale d’invertébrés pour induire la mortalité tout en limitant les conséquences hors cible. Ainsi, la capacité de mesurer l’activité neurale des insectes est d’un intérêt majeur pour le domaine de la physiologie et toxicologie insecte étant donné que le système nerveux est le tissu de cible de la plupart des insecticides déployé1. Pourtant, suite à une croissance des connaissances fondamentales et appliquées sur l’insectes du système nerveux nécessite des techniques neurophysiologiques avancées qui sont limitées à une faisabilité, étant donné que les techniques actuelles sont demande beaucoup de travail et nécessitent une grande dépense, insecte lignées de cellules neurales sont limitées, et/ou il y a un accès limité aux synapses centrales de la plupart des arthropodes. Caractérisation de la plupart des protéines neuronales insectes exige actuellement, la cible ne la découverte de médicaments suivantes clonés et façon hétérologue expresse pour et enregistrements électrophysiologiques, qu’a été décrit pour les canaux potassiques de rectification entrante insectes2 , récepteur de la ryanodine insectes3, moustiques sensibles au voltage K+ canaux4et d’autres. Pour atténuer le besoin d’expression hétérologue et le potentiel d’expression fonctionnelle faible, Bloomquist et collègues visant à induire un phénotype neuronal dans Spodoptera frugiperda (Sf21) cellules cultivées comme nouvelle méthode pour insecticide découverte5,6. Ces méthodes fournissent une approche valable pour le développement de la chimie nouvelle, mais ils créent souvent un goulot d’étranglement insurmontable pour la caractérisation des agents pharmacologiques, identifier des mécanismes de résistance aux insecticides et caractérisation des principes physiologiques fondamentaux. Nous décrivons ici une méthode ex vivo qui permet l’enregistrement de l’activité électrique d’un insecte de modèle qui a malléable génétique7,8,9 et des modèles d’expressions connus de neurones complexes de10,11,12 pour permettre la caractérisation des mécanismes de résistance au niveau du nerf, le mode d’action des nouveaux médicaments et autres études toxicologiques.
La mouche à fruit, d. melanogaster, est un organisme modèle commun pour la définition des systèmes neuronaux insectes ou mécanisme insecticide d’action et a été établi comme un organisme modèle bien adapté pour l’étude toxicologique13, pharmacologiques14 ,15, neurophysiologiques16et physiopathologiques17,18,19,20 processus de vertébrés. D.melanogaster est un insecte holométaboles qui effectue la métamorphose complète, y compris un stade larvaire et nymphal avant d’atteindre le stade adulte reproducteur. Tout au long du processus de développement, le système nerveux subit un remodelage important à différents stades de vie, mais le CNS larvaire fera l’objet de cette méthodologie. La décélération CNS larvaire est anatomiquement simple avec des segments thoraciques et abdominales qui sont fusionnés et forment le ganglion ventral, qui représente un tableau de neuromeric répétées et presque identiques unités21,22. Descendant des nerfs moteurs proviennent de l’extrémité caudale des ganglions sous-oesophagien et descendre pour innerver les muscles de la paroi du corps et des organes viscéraux des larves. La figure 1 décrit l’anatomie générale de la larves de drosophile CNS.
La barrière Drosophila sang – encéphalique (BHE) se développe à la fin de l’embryogenèse et est formée par la subperineurial des cellules gliales (SPG)21. Les cellules SPG forment de nombreux processus filopodes-like qui se propagent à établir une feuille de contigus, très plate, endothéliales semblable qui couvre l’ensemble de Drosophila CNS23. La drosophile BBB a des similitudes avec le vertébrés BBB, qui comprend à préserver l’homéostasie du microenvironnement neuronaux en contrôlant l’entrée des nutriments et des xénobiotiques dans le CNS21. C’est une condition sine qua non pour la transmission neuronale fiable et fonction, mais la protection du SNC par le BBB restreint la perméation de drogues de synthèse, la plupart des peptides et autres xénobiotiques24,25, qui introduit le potentiel problèmes lors de caractériser les puissances de modulateurs de petites molécules. La méthode utilise une transection simple pour perturber cette barrière prêt pharmacologique et y accéder et les synapses centrales.
La plus grande force de la méthodologie décrite est la simplicité, la reproductibilité et relativement haut débit capacité inhérente à ce système. Le protocole est relativement facile à maîtriser, l’installation requiert peu d’espace, et seulement un apport financier initial est nécessaire qui est réduite à réactifs et consommables. En outre, la méthode décrite est complètement modifiable pour enregistrer l’activité centrale de nerf décroissant de la mouche domestique, Musca domestica26.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les détails fournis dans la vidéo associée et texte ont fourni des étapes clés afin d’enregistrer l’activité et l’épi s’acquitter de fréquence de la drosophile CNS ex vivo. L’efficacité de la dissection est l’aspect le plus important de la méthode parce que peu de neurones décroissant ou court réduira la taux qui se traduira par grands écarts entre les répétitions de combustion de base. Cependant, une fois que la technique de dissection a été maîtrisée, les données recuei…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier Mme Rui Chen pour la dissection et les images de la drosophile CNS illustrés sur les figures.
Materials
| Drosophila melanogaster (strain OR) | Bloomington Drosophila Stock Center | 2376 | |
| Vibration isolation table | Kinetic Systems | 9200 series | |
| Faraday Cage | Kinetic Systems | N/A | |
| Dissecting Microscope on a Boom | Nikon | SMZ800N | Multiple scopes can be used; boom stand is critical |
| AC/DC differential amplifier | ADInstruments | AM3000H | The model 1700 can be used instead of the model 3000 |
| audio monitor | ADInstruments | AM3300 | |
| Hum Bug Noise Eliminator | A-M Systems | 726300 | |
| Data Acquisition System (PowerLab) | ADInstruments | PL3504 | Multiple PowerLab models can be used. |
| Lab Chart Pro Software | ADInstruments | N/A – Online Download | |
| Fiber Optic Lights | Edmund Optics | 89-740 | Different light sources can be used, but fiber optics are the most adaptable |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | M325 | |
| Microelectrode Holder | World Precision Instruments | MEH715 | Different models are acceptable |
| BNC cables | World Precision Instruments | multiple based on size | |
| Glass Capillaries | World Precision Instruments | PG52151-4 | |
| Microelectrode Puller | Sutter Instruments | P-1000 | Also can use Narashige PC-100 |
| Black Wax | Carolina Biological Supply | 974228 | |
| Non-coated insect pins, size #2 | Bioquip | 1208S2 | |
| Fince Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-03 |
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