Summary
Este protocolo describe un método para registrar la actividad eléctrica descendente de la sistema de nervioso central de Drosophila melanogaster para permitir pruebas de agentes farmacológicos, mutaciones genéticas de las proteínas neuronales, conveniente y rentable o el papel de los caminos fisiológicos inexplorados.
Abstract
La mayoría de los insecticidas disponibles actualmente atacar el sistema nervioso y mutaciones genéticas de las proteínas neuronales invertebradas a menudo producen consecuencias perjudiciales, sin embargo, los métodos actuales para el registro de actividad del sistema nervioso de un individuo animal es costoso y laborioso. Esta aspiración preparación del electrodo del sistema nervioso central de larvas tercer estadio de Drosophila melanogaster, es un sistema manejable para las pruebas de los efectos fisiológicos de los agentes neuroactivos, determinar el papel fisiológico de varios nervios caminos hacia la actividad del CNS, así como la influencia de las mutaciones genéticas a la función neuronal. Esta preparación ex vivo requiere sólo moderada disección electrofisiológico experiencia y habilidad generar grabaciones reproducibles de insecto actividad neuronal. Una amplia variedad de moduladores químicos, incluyendo péptidos, entonces puede aplicarse directamente al sistema nervioso en la solución con la solución fisiológica salina para medir la influencia en la actividad del CNS. Genéticas, otras tecnologías, como el sistema de GAL4/UAS, pueden aplicarse independientemente o conjuntamente con los agentes farmacológicos para determinar la función de canales iónicos específicos, transportadores o receptores a artrópodos función del CNS. En este contexto, los ensayos aquí descritos son de gran interés para toxicólogos insecticida insectos fisiólogos y biólogos del desarrollo para que D. melanogaster es un organismo modelo establecido. El objetivo de este protocolo es describir un método electrofisiológico para permitir la medición de la electrogenesis del sistema nervioso central en el insecto modelo, Drosophila melanogaster, que es útil para probar una diversidad de científicos hipótesis.
Introduction
El objetivo general de este enfoque es ayudar a los investigadores a medir rápidamente la electrogenesis del sistema nervioso central (SNC) en el insecto modelo, Drosophila melanogaster. Este método es confiable, rápida y costo-eficiente para llevar a cabo la experimentación fisiológica y toxicológica. El SNC es esencial para la vida y por lo tanto, los caminos fisiológicos críticos para funcionamiento neuronal han sido exploradas extensivamente en un esfuerzo por comprender o modificar la función neural. Caracterización de las vías de señalización dentro del CNS artrópodo ha permitido el descubrimiento de varias clases químicas de insecticidas que interrumpen la función neural invertebrada para inducir mortalidad limitando las consecuencias fuera del objetivo. Así, la capacidad de medir la actividad neuronal de los insectos es de gran interés para el campo de la fisiología y toxicología de insectos ya que el sistema nervioso es el tejido diana de la mayoría de insecticidas desplegados1. Sin embargo, continuó el crecimiento del conocimiento fundamental y aplicado sobre el sistema nervioso del insecto requiere técnicas neurofisiológicas avanzadas que están limitadas en su viabilidad, puesto que las técnicas actuales de mano de obra y requieren un gasto alto, insecto líneas celulares neuronales son limitadas, y hay acceso limitado a la sinapsis central de mayoría artrópodos. Caracterización de la mayoría de las proteínas neuronal insectos requiere actualmente, el objetivo de ser clonado y expresado heterologously para fármacos posteriores y las grabaciones electrofisiológicas, como fue descrito por canales de potasio rectificador hacia adentro insectos2 , receptor de rianodina insectos3, mosquito sensible a voltaje K+ canales4y otros. Para mitigar la necesidad de expresión heteróloga y el potencial de expresión funcional baja, Bloomquist y colegas para inducir un fenotipo neuronal en cultivan células de Spodoptera frugiperda (Sf21) como un método novedoso para insecticida descubrimiento5,6. Estos métodos proporcionan un enfoque válido para el desarrollo de la nueva química, sin embargo, a menudo crean un cuello de botella insalvable para la caracterización de los agentes farmacológicos, identificar mecanismos de resistencia a los insecticidas y caracterización de los principios fisiológicos fundamentales. Aquí, describimos un método ex vivo que permite la grabación de la actividad eléctrica de un insecto de modelo que tiene genética maleable7,8,9 y los patrones de la conocida expresión de nervios complejos10,11,12 para permitir la caracterización de mecanismos de resistencia a nivel del nervio, el modo de acción de fármacos recientemente desarrollados y otros estudios toxicológicos.
La mosca de la fruta D. melanogaster es un organismo modelo común para la definición de insecto sistemas neuronales o mecanismo insecticida de acción y se ha establecido como un organismo modelo muy adecuado para el estudio de la toxicología13, farmacológicas14 ,15, neurofisiológicos16y patofisiológicos17,18,19,20 procesos de vertebrados. D.melanogaster es un insectos holometábolos que realiza metamorfosis completa, incluyendo una etapa larvaria y de pupa antes de llegar a la etapa adulta reproductiva. Durante el proceso de desarrollo, el sistema nervioso sufre importantes remodelaciones en diferentes estadios, pero el larvas SNC será el tema central de esta metodología. El CNS larvas completamente desarrollado es anatómico simple con segmentos torácicos y abdominales que se fusionan y forman el ganglio ventral, que representa una matriz de neuromeric repetida y casi idénticas unidades21,22. Nervios motores descendentes se originan desde el extremo caudal de los ganglios subesophageal y descienden para inervar los músculos de la pared del cuerpo y órganos viscerales de la larva. La figura 1 describe la anatomía macroscópica de la larvas Drosophila CNS.
La barrera Drosophila blood - brain (BBB) se convierte en el final de la embriogénesis y está formada por células gliales (SPG) de subperineurial21. Las células SPG forman numerosos procesos como filopodios que extensión para establecer una hoja contigua, muy plana, como endoteliales que cubre el entero Drosophila CNS23. La Drosophila BBB tiene similitudes con el BBB vertebrado, que incluye preservar la homeostasis del microambiente neuronal controlando la entrada de nutrientes y xenobióticos en la CNS21. Esto es un prerrequisito para confiable transmisión neural y la función, sin embargo, la protección del SNC por el BBB restringe la penetración de drogas sintéticas, la mayoría de péptidos y otros xenobióticos24,25, que presenta potencial problemas cuando caracterizan potencias de moduladores de moléculas pequeñas. El método utiliza un simple corte transversal para interrumpir esta barrera y proporcionar acceso farmacológica a la sinapsis central.
La mayor fortaleza de la metodología descrita es la simplicidad, la reproducibilidad y la relativamente alta-capacidad inherente a este sistema. El protocolo es relativamente fácil de dominar, el programa de instalación requiere poco espacio, y sólo una entrada financiera inicial es necesario que se reduce a reactivos y consumibles. Además, el método descrito es completamente modificable para registrar la actividad nerviosa descendente central de la mosca doméstica, Musca domestica26.
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Protocol
1. equipos y materiales
- Preparar los componentes necesarios (listados en la Tabla de materiales) de la plataforma de electrofisiología para realizar grabaciones de electrodo de succión de la Drosophila del CNS.
Nota: Antes de la experimentación, es necesario construir cámaras para la disección de la Drosophila CNS y ser utilizado para bañarse los ganglios en solución salina durante las grabaciones. Un esquema paso a paso de construcción de la cámara se proporciona a continuación. - Prepare la cámara larval.
- Derretir la cera negra usando una placa caliente.
- Vierta 2 mL de cera derretida en una cámara que tiene un volumen máximo de 2-2.5 mL.
- Deje que la cera se enfríe y endurezca por aproximadamente 2 h.
- Use una navaja para tallar un agujero en la cera endurecida que tendrá un volumen de 500 μl, que tiene una superficie de aproximadamente 0,5 cm2 y una profundidad de aproximadamente 0,25 cm.
2. equipo y configuración de Software
Nota: La configuración de la grabación extracelular se describe brevemente a continuación.
- Preparar equipo para disección y grabación.
- Colocar la preparación de tejidos, microscopio, electrodo de succión, micromanipuladores, fuente de luz dentro de la jaula de Faraday para reducir el ruido y eliminar campos eléctricos extraños (figura 2).
- Conectar (preferentemente soldadura) tierra y alambres positivos sobre blindado clipes que conectará al titular de la bañera y el microelectrodo, respectivamente.
Nota: Los cables soldados y expuestos pueden ser cubiertos con papel de aluminio para reducir el ruido. - Conecte los cables positivo a la entrada 1 del amplificador diferencial AC/DC. y tierra
- Conectar el sistema de adquisición de datos del amplificador diferencial AC/DC al conectar un cable de Neill-Concelman de bayoneta (BNC) de entrada 1 del sistema de adquisición de datos a la salida del canal 1 del amplificador.
Nota: Se recomienda incorporar un eliminador de ruido de 50/60 Hz entre el software de adquisición de datos y el amplificador. Es necesario el uso de un conector T BNC. - Si lo desea, incluir a un monitor de audio en la configuración mediante la conexión de entrada 1 del monitor audio a la entrada 1 del software de adquisición de datos.
- Llene la jeringa de 10 mL con solución salina y conéctelo al puerto de presión de la pinza portaelectrodos.
Nota: Asegúrese de que no existen burbujas de aire entre la jeringa, el precipitado de Ag/AgCl y la abertura de electrodo.
- Preparar el software para grabación y disección.
Nota: El esquema de métodos para la instalación del software se basa en el software de adquisición y análisis mencionado en la Tabla de materiales que digitalizar la salida eléctrica y convertir los datos para la frecuencia del punto. Sin embargo, se puede utilizar otro software y múltiples conversiones de grabación pueden ser utilizadas.- Abra el software de adquisición y análisis.
- Haga clic en "configuración" de la barra de herramientas principal y seleccione "configuración del canal," que se abrirá un cuadro de diálogo.
- Reducir el número de canales total a tres.
- Para el canal 1, seleccione un rango de 100 mV.
- Canal 2, haga clic en la pestaña "cálculo" que se abrirá un menú desplegable. Seleccione "mediciones cíclicas", que se abrirán otro cuadro de diálogo.
- Seleccione el canal 1 y la fuente. En la medida del menú desplegable, seleccione punto de unidad en eventos. Finalmente, en el área de configuración de la detección, en el menú desplegable seleccione simple umbral.
- Para convertir la actividad eléctrica en una parcela de frecuencia expresada en hertz, el canal 3rd debe configurarse en modo aritmético: en la ventana de entrada, escriba en "1000*smoothsec(ch2,2)". Luego seleccione como las unidades desplegable hertz de menú.
Nota: Grabaciones exitosas se pueden realizar con múltiples configuraciones de grabación diferentes, pero "Punto de unidad en eventos y umbral simple" es probablemente el más fácil, ya que permite para el ajuste del umbral por encima de la actividad de fondo para cada individuo grabación. Grabaciones bajo el ajuste de "Custom-Source Input" aumentan la reproducibilidad de los datos, asumiendo que la actividad de fondo no es diferente entre grabaciones. - Cierre los cuadros de diálogo para volver a la pantalla principal. El eje y debe expresarse en Hz y el eje x en el tiempo.
3. disecar y preparan las larvas Drosophila CNS
Nota: Métodos para la disección del CNS larval se ilustran claramente en Hafer y Schedl27, pero estos métodos previamente publicados reducen la longitud de las neuronas descendentes que son importantes para medir la frecuencia del pico. Aquí, se describe un método adicional para suprimir el SNC larvas que mantiene durante mucho tiempo, las neuronas descendentes intactas.
- Preparación de solución salina.
- Preparar la disección y la solución salina de grabación a los siguientes en mM28: 157 NaCl, 3 KCI, 2 CaCl2, 4 ácido 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic (HEPES); valorar el pH 7.25.
- Diseccionar las larvas Drosophila CNS.
- Identificar y extraer una errante de tercer estadio Drosophila melanogaster el frasco de cultivo y el lugar en 200 μL de solución salina (Figura 3A).
- Sujete los ganchos de la boca con un par de Pinzas finas y agarre el abdomen de la manzana de la discordia con un segundo par de pinzas (figura 3B).
Nota: No aplique demasiada presión en el abdomen ya que puede producir desgarro de la delgada capa cuticular de la manzana de la discordia. - Tire suavemente de los ganchos de la boca y abdomen en diferentes direcciones para separar el extremo caudal de la manzana de la discordia de la región de cabeza y exponer las vísceras de la manzana de la discordia (figura 3).
Nota: El SNC se va entrelazado con la tráquea y el tubo digestivo. No corte el SNC de cualquier tejido para evitar el corte de los nervios periféricos descendentes. - Tease del CNS en el tracto digestivo y de la tráquea con el fórceps (figura 3D).
- Si es necesario, interrumpir la barrera hematoencefálica por manualmente transecting el SNC posterior a los lóbulos cerebrales con las tijeras de Vannas primavera.
Nota: Esto debe hacerse en base a las propiedades fisicoquímicas de la sustancia que se utiliza. La línea roja en la Figura 4A es el punto de corte transversal sugerida y el CNS seccionado con intactos descendentes troncos de nervio periférico que se muestra en la Figura 4B. El CNS seccionado está listo para experimentar después de la terminación del paso 3.2.5.
4. extracelular grabación de Drosophila del SNC.
- Preparar el SNC para la grabación.
- Tire de un electrodo de pipeta de vidrio de Capillares de vidrio de borosilicato a una resistencia de 5-15 mΩ.
- Inserte el SNC seccionado en la cámara de cera que contiene 200 μL de solución salina. Sujete un perno insectos sin recubrimiento con la pinza de soldar al cable de tierra e Inserte el pasador en la solución salina para completar el circuito.
- Con los micromanipuladores, orientar el electrodo en el extremo caudal del SNC seccionado. Eliminar registro de ruido de fondo mediante el ajuste del umbral en el software de adquisición y análisis antes de ponerse en contacto con los troncos del nervio periférico.
- Dibujar cualquier convenientes nervios periféricos en el electrodo de succión aplicando ligera presión negativa en la jeringa.
Nota: La referencia de frecuencia de la leña está correlacionada con el número de neuronas dibujado en el electrodo donde las neuronas más a menudo dan como resultado aumento de la resistencia del electrodo.
- Comenzar a grabar extracelular del sistema nervioso central descendente de actividad del nervio.
- Iniciar la grabación en el software de adquisición de datos y seguimiento de la referencia de frecuencia de la leña. Permitir que la tasa de disparo equilibre durante 5 minutos antes de recoger leña tarifa de datos de línea de base.
- Desechar la preparación y grabación si el patrón de disparo de tratamiento de control no es un patrón de rotura similar al mostrado en la figura 5A.
Nota: Patrón alterado de leña sugiere actividad anormal o inestable del generador central del patrón, que puede alterar la función neural. - Después de 5 min, añadir 200 μL de solución salina + vehículo para llevar el volumen total de la cámara a 400 μL para iniciar control de grabación de las tarifas de leña.
- Después de línea de base ha sido establecida (3-5 minutos), retirar 200 μL de solución salina y añada 200 μL del agente experimental solubilizado en una solución salina.
Nota: Dimetilsulfóxido (DMSO) es el solvente recomendado para compuestos lipofílicos y no debe exceder 0,1% v/v. - Aplicar concentraciones de la droga de manera serial (baja a altas concentraciones) y grabar cada concentración para un selecto periodo de tiempo (determinado por el investigador basado en las propiedades químicas de la droga29). Este punto del tiempo de uso de la droga en el software de adquisición y análisis de la etiqueta mediante la inclusión de un comentario que incluye el fármaco y la concentración final.
Nota: Actividad del CNS de la leña se reducirá en aproximadamente un 10-20% después de 30-50 min después de la disección y por lo tanto, deben realizarse controles sin tratamiento adecuados y tratamientos farmacológicos no deben exceder este período de tiempo.
- Analizar los datos.
Nota: Se pueden realizar múltiples análisis en los datos recogidos, como cambios en el potencial de acción ráfagas29, espiga onda amplitud y curso temporal y determinación de frecuencias de media espiga Después de drogas tratamiento26,30 , 31 , 32. el más común es determinar la influencia de una droga tiene que las frecuencias de espiga media durante un período especificado de tiempo, que se describe a continuación.- Tabular las frecuencias media espiga seleccionando toda la región de interés (es decir, el tratamiento farmacológico de período de tiempo) y determinar frecuencias de media espiga automáticamente a través del "registro" situado en la barra de herramientas principal de la adquisición y análisis software.
- Determinar la frecuencia de medio punto del SNC después de tratamiento farmacológico a la frecuencia media punto de control del vehículo (línea de base). Calcular el cambio porcentual de la tasa de disparo después de tratamiento farmacológico por la fórmula: (tratamiento frecuencia de frecuencia/referencia) x 100.
- Utilizar la leña de frecuencias o por ciento de media espiga de control para cada concentración para construir una curva de respuesta de concentración con estándar graphing software.
- Realizar análisis estadístico (por ejemplo, desapareado t-test) para determinar significación entre puntos de tiempo, concentraciones o tratamientos farmacológicos.
Nota: Hay dos métodos principales para la generación y análisis de curvas de concentración-respuesta. El primer método es una concentración por preparación. Aquí, se normaliza la tasa pico de la concentración única a tasa de punto inicial para cada preparación. Los beneficios se reducen funcionamiento abajo de la preparación debido a acorta el tiempo de grabación, mientras que las trampas están aumentadas disección tiempo porque este método consistirá en 5-7 preparaciones individuales de CNS por concentración, y barras de error más grande en los datos promedio conjunto. El segundo método es múltiples concentraciones por preparación. Aquí, la tasa de alza para cada una de las concentraciones de 3-5 se normalizan a la misma tasa de punto de referencia. Las ventajas son menos tiempo de disección y menos variabilidad entre réplicas de concentraciones de la droga, mientras que las trampas son el requisito de un impacto de drogas y desconocido de acción rápida de tratamientos anteriores de concentración de droga en tratamientos químicos posteriores.
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Representative Results
La actividad espontánea de los nervios periféricos descendentes del Drosophila del sistema nervioso central puede grabarse utilizando electrodos de succión extracelulares con reproducibilidad consistente. La actividad espontánea de la suprimida y seccionado Drosophila CNS produce un patrón cíclico de explosión con 1-2 s de disparo con aproximadamente 1 s de cerca la actividad de reposo. Por ejemplo, el SNC está quieto (1-2 Hz) de 0.5-1 s, seguido de una explosión (100-400 Hz) aproximadamente 1 s, y luego vuelve a un estado quiescente cercano (1-2 Hz) de 0.5-1 s (figura 5A). Este patrón de disparo se repite cada 2-3 s. La frecuencia de descarga de medio punto del sistema nervioso central de Drosophila va de unos 20-50 Hz durante un período de 3-5 min, cuando se establece el umbral justo por encima del ruido de línea de base. La referencia de frecuencia de la leña está correlacionada con el número de las neuronas periféricas en el electrodo y el sello entre el orificio del electrodo y los ganglios ventrales. Lo importante, aplicación de la DMSO solvente químico en una concentración final de 0.1% no altera la frecuencia de descarga de spike de la Drosophila CNS (figura 5A).
Esta preparación electrofisiológica proporciona un método para caracterizar las propiedades excitatorias o depresores de varias moléculas pequeñas en la frecuencia de punto de un sistema neural insectos bien caracterizado. Propoxur, un conocido inhibidor de insectos acetilcolinesterasa (AChE), es un neuroexcitant y aumentó la frecuencia de descarga de spike de la transected Drosophila CNS de manera dependiente de la concentración (figura 5B). Por el contrario, el ácido gamma - aminobutírico (GABA), un conocido neurotransmisor inhibitorio que actúa sobre el canal de cloruro insectos mediada por el GABA, es un neurodepressant y reduce la frecuencia de descarga del pico de una manera dependiente de la concentración (figura 5 ). Significa descarga spike frecuencias pueden ser determinadas durante el período de tiempo registrado para cada concentración permitir la construcción de una curva de respuesta de concentración para determinar la concentración efectiva 50% (CE50) para provocar una respuesta. Aquí, propoxur se demuestra para tener una EC50 de 338 nM (95% intervalo de confianza (IC): 241-474; geomorfología: 1.8; r2: 0.77) con una concentración de 1 μm, produciendo excitación máxima de la Drosophila del CNS en el 300% de actividad de control (figura 5 D)26. GABA está demostrado que un IC50 de 1.1 mM (IC del 95%: 0.7-1.5; geomorfología: 1.5, r2: 0,95) con la inhibición máxima de 5 mm (figura 5E).
A menudo, sondas moleculares de sistemas neuronales no son capaces de ser utilizados en los análisis fisiológicos o toxicológicos debido a su falta de propiedades fisicoquímicas adecuadas que permiten la penetración de la barrera hematoencefálica. Por ejemplo, tacrina monomérica es un potente inhibidor (ca. 200 nM) de insectos dolor33, pero no altera la frecuencia de pico de la intacta Drosophila CNS (figura 6A). Sin embargo, la interrupción de la laminilla neural y la barrera hematoencefálica a través de la sección transversal posterior a los lóbulos cerebrales resultó en un aumento casi inmediato en la frecuencia de pico de la Drosophila CNS después de exposición a 100 μm monomérica tacrina ( Figura 6B). Datos similares han sido previamente descritos30.
Figura 1: suprimida del CNS de tercera-instar melanogaster del Drosophila. Las flechas apuntan hacia varias estructuras anatómicas del SNC que se corresponden con las etiquetas. La barra de escala representa 250 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: configuración de la electrofisiología que se utiliza para realizar grabaciones extracelulares. (A) jaula de Faraday; (B) tabla de la vibración; (C) disección microscopio; AC/DC amplificador diferencial (D) ; Monitor audio (E) ; Eliminador de ruido (F) ; Sistema de adquisición de datos (G) ; (H) corriente de cómputo gráfico software pro; (I) cable de fibra óptica con fuente de iluminación exterior; Instrumental quirúrgico (J) ; Titular de microelectrodo (K) con el puerto de presión con plato de vidrio electrodo y preparación de la cera. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: método para suprimir el CNS de larvas de tercer estadio. (A) gusano intacto sumergido en 200 μL de solución salina. La flecha indica los ganchos de la boca que se utilizan para la separación de la pared del cuerpo. (B) dos pares de pinzas se colocan en el centro de la manzana de la discordia y en los ganchos de la boca para comenzar la separación de la pared del cuerpo. (C) pared del cuerpo se separa con una presión leve y continua para exponer las vísceras. (D) CNS es visibles (flechas blancas) y de vez en cuando se entrelaza con las vísceras. La barra de escala representa 1000 μm, 750 μm, 500 μm y 200 μm para los paneles A, B, C y D, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: interrupción de la barrera hematoencefálica por transecting CNS. (A) SNC intacto con descendente visible en el extremo caudal de los ventrales ganglios de los nervios. La línea roja indica la ubicación de transecting el SNC para interrumpir el BBB. (B) A transversalmente el CNS con el extremo caudal de los ventrales ganglios aún exponer largas descendentes de las neuronas. Se descartan los ganglios ventrales. La barra de escala representa 200 μm para ambos paneles. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: grabaciones neurofisiológicas de la CNS de larvas de tercer estadio de D. melanogaster. Representante del nervio descarga rastros antes y después de la exposición a (A) DMSO, propoxur (B) y (C) GABA. Frecuencias de disparo inicial en picos/s (Hz) para cada experimento se dan a la izquierda de cada rastro. Concentración-respuesta curvas para propoxur (D) y de GABA (E) a la descarga del nervio del CNS de larvas de D. melanogaster de grabaciones replicadas (n = 3-5 concentraciones por curva, con cada concentración de replicar por lo menos 5 veces). Las flechas representan el punto de aplicación del fármaco. Puntos de datos representan aumento medio por ciento de tasa de disparo de referencia y barras de error representan la desviación estándar. Cuando faltan barras de error, es porque son más pequeños que el tamaño del símbolo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: mayor penetración de este medicamento en el sistema nervioso después de la transección del CNS. Grabaciones representativas de (A) intacto y (B) transversalmente el CNS larvas expuesto a tacrina monomérica, que se aplicó en la flecha. Frecuencias de disparo inicial en picos/s (Hz) para cada experimento se dan a la izquierda de cada rastro. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Los datos facilitados en el vídeo asociado y texto han dado pasos para registrar la actividad y la espiga alta frecuencia de Drosophila CNS ex vivo. La eficacia de la disección es el aspecto más crítico del método ya corto o pocas neuronas descendentes reducirá la base disparando ritmo que dan lugar a grandes variaciones entre repeticiones. Sin embargo, una vez que domina la técnica de disección, los datos recogidos con este ensayo son altamente reproducibles y modificable para una amplia variedad de disciplinas. Una modificación en el método descrito es la inclusión de un sistema automatizado profusión que evitará la necesidad de manualmente pipetear las soluciones salinas y productos químicas en la cámara de la CNS. Inclusión del sistema profusión reducirá disturbios del SNC durante las grabaciones, que en ocasiones se producen durante la aplicación de drogas con pipetas manual.
Este método electrofisiológico aprovecha la utilidad de la preparación para su incorporación a la investigación de descubrimiento de drogas, insecticida. Además, esta preparación es favorable en el aula de demostración de conceptos fundamentales de la neurofisiología. El método requiere relativamente modestas inversiones y tiempo de preparación mínimo mientras que proporciona una grabación estable y robusta que puede ser empleada para ilustrar la influencia de los fármacos a la función de volar del CNS. Por ejemplo, la carga financiera de la plataforma de grabación es un costo inicial de aproximadamente $10.000 USD con menores costes subsecuentes (por ejemplo, solución salina sales, Colonia mosca mantenimiento, etc.). Además, el tiempo necesario de preparación del CNS a primera grabación es aproximadamente 10 minutos. Aunque Drosophila son fáciles de mantener en la cultura dentro de un laboratorio o aula, cabe señalar que este ensayo de succión electrodo también se puede realizar mediante el SNC de la mosca doméstica, Musca domesticay probablemente otras larvas de la mosca de afines , así. El estado de plaga de Musca domestica al ganado sugiere este análisis podrían ser de utilidad significativa a la investigación programas con el objetivo de caracterizar la sensibilidad neuronal de moscas de diferentes poblaciones o para determinar la potencia del recién desarrollados neurotóxicos para el eventual control de infestaciones.
Además de caracterizar la potencia de las drogas, esta preparación puede ser utilizada para caracterizar la influencia de las mutaciones genéticas y la manipulación sobre la actividad del sistema nervioso de Drosophila . Trabajo previo ha demostrado caída CNS-específica de la codificación del gene que del canal de potasio (Kir) rectificador hacia adentro aumentó la frecuencia de disparo de referencia CNS por aproximadamente 2 comparado con el control de moscas31. Estos datos se combinaron con datos farmacológicos en última instancia especular que los canales Kir de papel fisiológico sirven para funciones del sistema nervioso de Drosophila .
Aunque esta técnica representa un ensayo potente para poner a prueba diversas hipótesis fisiológicas y toxicológicas, limitaciones a la prueba existe y deben ser considerados. Por ejemplo, los datos generados a través de grabaciones de electrodo aspiración rara vez proporcionan la evidencia concluyente para el modo exacto de acción de un fármaco o papel fisiológico exacto de un canal iónico y deben ser estudiados en conjunto con más medidas basadas en la célula, tales como electrofisiología de la abrazadera del remiendo. Una limitación adicional a este método es que los diferentes receptores y subtipos de canales de iones no influyen en la tasa de pico del CNS de manera igual. Por lo tanto, es posible que una modulación de un subtipo específico de receptor o canales iónicos no puede influir significativamente en la tasa de pico del CNS suprimido, pero de hecho puede tener un efecto crítico en función del sistema nervioso total o integración de señales.
Aunque existen limitaciones, los datos recogidos a través de grabaciones de electrodo de succión proporcionan datos de prueba de concepto de calidad y permiten a los investigadores a generar hipótesis respecto de los mecanismos de acción que a través de la abrazadera de tensión electrofisiología, análisis bioquímicos, o a través de pruebas farmacológicas adicionales. Por ejemplo, el último fue realizado para probar la hipótesis de que el repelente de insectos, N, N- dietil-3-methylbenzamide (DEET), inhibe el sistema de octopaminergic en insecto CNS en un esfuerzo por describir el mecanismo de la toxicidad a los mosquitos y vuela el26. DEET fue demostrado para ser un neuroexcitant de la actividad del CNS de mosca doméstica y también altera el potencial postsynaptic excitatory evocado en la Unión neuromuscular, que son colinérgicos y glutamatérgicos sistemas, respectivamente26. Estos datos sugirieron que la DEET no era probable inducir toxicidad por inhibición colinérgica, como fue sugerido anteriormente34. La frecuencia de descarga de la mosca del CNS de grabación después de la exposición a la fentolamina, un antagonista de la octopamina conocido, demostró una inhibición completa de la neuroexcitation mediada por el DEET, pero no la de propoxur, que proporcionó evidencia significativa que la DEET era más es probable que afectan al sistema octopaminergic que dolor26. Estos conjuntos de datos publicados destacan la variedad de hipótesis y condiciones experimentales que pueden investigarse con este método.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Nos gustaría agradecer a la Sra. Rui Chen por la disección y las imágenes de la Drosophila del CNS se muestra en las figuras.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila melanogaster (strain OR) | Bloomington Drosophila Stock Center | 2376 | |
| Vibration isolation table | Kinetic Systems | 9200 series | |
| Faraday Cage | Kinetic Systems | N/A | |
| Dissecting Microscope on a Boom | Nikon | SMZ800N | Multiple scopes can be used; boom stand is critical |
| AC/DC differential amplifier | ADInstruments | AM3000H | The model 1700 can be used instead of the model 3000 |
| audio monitor | ADInstruments | AM3300 | |
| Hum Bug Noise Eliminator | A-M Systems | 726300 | |
| Data Acquisition System (PowerLab) | ADInstruments | PL3504 | Multiple PowerLab models can be used. |
| Lab Chart Pro Software | ADInstruments | N/A - Online Download | |
| Fiber Optic Lights | Edmund Optics | 89-740 | Different light sources can be used, but fiber optics are the most adaptable |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | M325 | |
| Microelectrode Holder | World Precision Instruments | MEH715 | Different models are acceptable |
| BNC cables | World Precision Instruments | multiple based on size | |
| Glass Capillaries | World Precision Instruments | PG52151-4 | |
| Microelectrode Puller | Sutter Instruments | P-1000 | Also can use Narashige PC-100 |
| Black Wax | Carolina Biological Supply | 974228 | |
| Non-coated insect pins, size #2 | Bioquip | 1208S2 | |
| Fince Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-03 |
References
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