Summary
Bu iletişim kuralı maliyet-etkin ve uygun farmakolojik ajanları, sinirsel proteinlerin genetik mutasyonlar test etkinleştirmek için Drosophila melanogaster merkezi sinir sistemi azalan elektriksel aktivitesinin kaydetmek için bir yöntem açıklar, ve/veya keşfedilmemiş fizyolojik yolları rolü.
Abstract
Şu anda kullanılabilir böcek öldürücüler çoğunluğu sinir sistemi hedef ve omurgasız sinirsel proteinlerin genetik mutasyonlar oftentimes zararlı sonuçları henüz sinir sistem etkinliğini bir bireyin kayıt için geçerli yöntem verim pahalı ve zahmetli bir hayvandır. Bu emme üçüncü-biçim larva merkezi sinir sistemi, Drosophila melanogaster, elektrodu hazırlanması neuroactive ajanlar, çeşitli sinir fizyolojik rolü belirleyen fizyolojik etkileri test için uysal bir sistemdir CNS aktivite, hem de genetik mutasyonlar sinirsel işlev etkisi yolları. Bu ex vivo hazırlık böcek nöronal aktivite tekrarlanabilir kayıtları oluşturmak tek orta beceri ve elektrofizyolojik uzmanlık dissekan gerektirir. Çok çeşitli kimyasal modülatörler peptidler, dahil olmak üzere, daha sonra doğrudan çözüm CNS etkinliği üzerindeki etkisini ölçmek için serum fizyolojik ile sinir sisteminde uygulanabilir. Ayrıca, genetik teknolojileri, GAL4/UAS sistemi gibi bağımsız olarak veya belirli iyon kanalları, ışınlayıcılar veya eklem bacaklılar CNS işlevine reseptörleri rolünü belirlemek için farmakolojik ajanlar ile tandem uygulanabilir. Bu bağlamda, burada açıklanan deneyleri böcek ilacı toksikolog, böcek taslakları ve gelişimsel biyologlar D. melanogaster kurulan model organizma olduğu önemli ilgi vardır. Bu protokol bir çeşitlilik bilimsel test etmek için yararlı olan modeli böcek, Drosophila melanogaster, merkezi sinir sistemi electrogenesis ölçümü etkinleştirmek için elektrofizyolojik bir yöntemi açıklamak için hedeftir hipotezler.
Introduction
Bu yaklaşım genel amacı modeli böcek, Drosophila melanogastermerkezi sinir sistemi (MSS) electrogenesis hızlı bir şekilde ölçmek araştırmacılar sağlamaktır. Bu yöntem güvenilir, hızlı ve maliyet-etkin fizyolojik ve toksikolojik deneme. gerçekleştirmek için İçin yoğun bir çaba anlamak veya sinir işlevi değiştirmek için uygun sinirsel işlev keşfedilmeyi MSS yaşam ve bu nedenle, kritik fizyolojik yolları için esastır. Eklem bacaklılar CNS içinde sinyal yolları karakterizasyonu ölüm hedef kapalı sonuçları sınırlama ikna etmek için omurgasız sinir işlevi bozabilir böcek öldürücüler çeşitli kimyasal sınıflar keşfi sağlamıştır. Sinir sistemi hedef doku dağıtılan böcek öldürücüler1çoğunluğunun olduğundan böylece, böceklerin sinirsel aktivite ölçmek için böcek toksikoloji ve fizyolojisi alanında önemli ilgi yeteneğidir. Henüz, büyüme böcek sinir sistemine ilişkin temel ve uygulamalı bilgi güncel teknikler emek yoğun ve yüksek bir harcama gerektirir beri fizibilite içinde sınırlı nörofizyolojik gelişmiş teknikler gerektirir devam böcek sinir hücre hatları sınırlıdır ve/veya merkez sinapslarda çoğu Artropodların sınırlı erişim. Şu anda, çoğu böcek sinirsel proteinler karakterizasyonu klonlanmış ve heterologously ifade için sonraki ilaç bulma ve elektrofizyolojik kayıtlar, böcek içe doğrultucu potasyum kanalları2 açıklandığı için hedef gerektirir , böcek ryanodine reseptör3, sivrisinek voltaj duyarlı K+ kanal4ve diğerleri. Kapaklı ifade gereksinimini ve düşük fonksiyonel ifade için potansiyel etkisini azaltmak için Bloomquist ve arkadaşları bir nöronal fenotip ikna etmek amaçlı Spodoptera frugiperda (Sf21) hücreleri için yeni bir yöntem olarak kültürlü böcek ilacı keşif5,6. Bu yöntemleri yeni kimya gelişimi için geçerli bir yaklaşım sağlar, henüz bunlar oftentimes farmakolojik ajanlar, böcek ilacı direnci ve karakterizasyonu mekanizmaları tanımlayan karakterizasyonu için aşılmaz bir darboğaz oluşturur temel fizyolojik esasları. Burada, dövülebilir genetik7,8,9 olan bir modeli böcek gelen elektriksel aktivite kaydı ve bilinen ifade şekillerinin sinirsel sağlar bir ex vivo yöntemi açıklamak sinir, eylem yeni geliştirilen ilaçların modu ve diğer toksikolojik çalışmalar düzeyde direnç mekanizmaları karakterizasyonu etkinleştirmek için kompleksleri10,11,12 .
Meyve sineği, D. melanogaster, böcek sinir sistemleri ya da böcek ilacı etki mekanizmaları tanımlamak için ortak bir model organizma ve toksikolojik13, farmakolojik14 çalışma için uygun model organizma olarak kurulan ,15, nörofizyolojik16ve patofizyolojik17,18,19,20 süreçleri omurgalıların. D.melanogaster üreme yetişkin sahne ulaşmadan önce larva ve pupa aşaması da dahil olmak üzere tam başkalaşım gerçekleştirir holometabolous bir böcek var. Gelişim sürecinde önemli farklı hayat aşamalarında remodeling sinir sistemi uğrar ama larva CNS Bu metodoloji odak noktası olacaktır. Tam olarak gelişmiş larva CNS anatomik olarak erimiş ve tekrarlanan ve hemen hemen aynı neuromeric birimleri21,22bir dizi temsil eden ventral sinir form göğüs ve karın kesimleri ile basittir. Azalan motor sinirler ve kaudal subesophageal gangliyon sonundan itibaren köken innervate BEDEN duvarı kasları ve viseral organların larvalar inerler. Şekil 1 larva Drosophila CNS gross anatomi açıklar.
Drosophila kan - beyin bariyerini (BBB) embriyo sonunda geliştirir ve subperineurial Gliyal hücreler (SPG)21tarafından oluşturulur. SPG hücreleri tüm Drosophila CNS23kapsar bitişik, çok düz, endotel benzeri bir sayfa kurmak için yayılmış çok sayıda filopodia benzeri işlemleri oluşturur. Drosophila BBB CNS21besin ve xenobiotics giriş kontrol ederek sinir microenvironment homeostazı koruma içerir omurgalı BBB benzerlikler vardır. CNS BBB tarafından korunması sentetik uyuşturucu, çoğu peptidler ve potansiyel tanıttı diğer xenobiotics24,25, nüfuz kısıtlar henüz bu de güvenilir sinirsel iletim ve fonksiyonu, için bir önkoşuldur küçük molekül modülatörler potenslerine karakterize oluşan sorunlar. Bu bariyer bozabilir ve merkezi sinapslarda hazır farmakolojik erişim sağlamak için basit bir transeksiyon yöntemini kullanır.
En büyük gücü açıklanan metodolojisi basitlik, tekrarlanabilirlik ve nispeten yüksek üretilen iş kapasitesi bu sisteme doğasında var. Protokoldür nispeten kolay usta, belgili tanımlık tertibat az yer gerektirir ve hangi reaktifler ve sarf malzemeleri için azalır sadece ilk mali giriş gereklidir. Ayrıca, açıklanan yöntemi ev sineği, sinek domestica26. merkezi azalan sinir etkinliklerini kaydetmek için tamamen iyileştirilebilir
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ekipman ve malzemeleri
- ( Tablo malzemelistesi) gerekli bileşenler Drosophila CNS emme elektrot kayıtları gerçekleştirmek için Elektrofizyoloji teçhizat hazır olun.
Not: deneme önce bu kayıtları sırasında serum gangliyon banyo için kullanılacak ve salonları Drosophila CNS diseksiyon için oluşturmak için gereklidir. Adım adım bir anahat odası inşaat aşağıda verilmiştir. - Larva odası hazırlamak.
- Elektrikli Ocak kullanarak siyah balmumu eritmek.
- Erimiş mum 2 mL 2-2.5 mL maksimum hacmi olan bir odanın içine dökün.
- Balmumu soğumaya bırakın ve yaklaşık 2 h sertleşmesine.
- Bir tıraş bıçağı bir delik bir yüzey alanı yaklaşık 0.5 cm2 ve yaklaşık 0.25 cm derinliğe sahip 500 µL hacmi yapacak sertleştirilmiş mum bölmek için kullanın.
2. donanım ve yazılım yapılandırma
Not: Hücre dışı kayıt kuruluşu aşağıda kısaca açıklanmıştır.
- Ekipman diseksiyon ve kayıt için hazırlayın.
- Doku hazırlık, mikroskop, emme elektrot, micromanipulators, ışık kaynağı gürültü azaltmak ve yabancı elektrik alanları (Şekil 2) ortadan kaldırmak için Faraday kafesin içine konumlandırın.
- Bağlanmak (tercihen lehim) zemin ve üzerine pozitif telleri korumalı banyo ve Elektrot tutucu için sırasıyla bağlı timsah klipleri.
Not: Lehimli ve maruz telleri gürültüyü azaltmak için alüminyum folyo ile kaplı olabilir. - Zemin ve 1 AC/DC fark amplifikatör. giriş için pozitif telleri bağlamak
- Veri toplama sistemi AC/DC fark amplifikatör için süngü Neill-Concelman (BNC) kablo veri toplama sistemi giriş 1 ile amplifikatör Kanal 1 çıkışını bağlanarak bağlayın.
Not: 50/60 Hz gürültü giderici amplifikatör arasındaki veri toplama yazılımı dahil etmek için önerilir. BNC T Bağlayıcısı kullanımı gereklidir. - İstenirse, bir ses monitör girişi 1 veri toplama yazılımı için ses İzleyicisi'nin giriş 1 bağlanarak kurulumunu dahil et.
- 10 mL şırınga serum doldurmak ve Elektrot tutucu basınç bağlantı noktasına bağlayın.
Not: hiçbir hava kabarcıkları şırınga, Ag/AgCl Pelet ve elektrot açılış arasında bulunduğundan emin olun.
- Yazılım diseksiyon ve kayıt için hazırlayın.
Not: Yazılım kurulumu için yöntemleri anahat ham elektrik çıkış dijital ortama ve frekans spike verileri dönüştürmek Malzemeler tablo listelenen edinme/analiz yazılımı temel alır. Ancak, diğer yazılım kullanılabilir ve birden çok kayıt dönüşüm kullanılabilir.- Satın alma/analiz yazılımını açın.
- Ana araç çubuğundan "Kur" tıklayın ve "kanal ayarlar," bir diyalog kutusu açılacaktır.
- Toplam kanal sayısı üçe kadar azaltın.
- Kanal 1 için 100 aralığı seçin mV.
- Kanal 2 için bir damla-aşağı yemek listesi-ecek açık "hesaplama" sekmesini tıklatın. "Döngüsel ölçümleri," ikinci bir diyalog kutusu açılır seçin.
- Kanal 1 kaynak olarak seçin. Daha sonra üzerinde damla aşağı menü ölçüm birimi spike etkinliklerde seçin. Son olarak, algılama ayarları alanında, açılır menüden basit eşik seçin.
- Elektriksel aktivitenin hertz ifade bir oran Arsa haline dönüştürmek için 3rd kanalı aritmetik modunda ayarlayın: giriş penceresinde, "1000*smoothsec(ch2,2)" yazın. O zaman birimleri menü hertz damla gibi seçin.
Not: Başarılı kayıtları birden çok farklı kayıt kurulumları ile yapılabilir ama "Olaylar ve basit eşik birim spike" büyük olasılıkla en kolay, çünkü arka plan etkinliği eşiğin uyum her birey için izin veren bir yayın kayıt. Kayıtları "Özel kaynak giriş" ayarı altında arka plan etkinliği kayıtları arasında farklı olduğunu sanmıyorum veri tekrarlanabilirlik artırın. - Ana ekrana dönmek için diyalog kutularını kapatın. Y ekseni Hz ve x ekseni zamanında ifade edilmelidir.
3. teşrih ve larva Drosophila sinir hazırlamak
Not: Larva CNS diseksiyon için yöntemleri Hafer ve Schedl27' açıkça gösterilmiştir, ancak daha önce yayımlanmış bu yöntemler spike frekans ölçmek için önemlidir azalan nöronlar uzunluğunu azaltın. Burada, uzun, bozulmamış azalan nöronlar tutar larva MSS tüketim için ek bir yöntem gösterilmiştir.
- Serum fizyolojik hazırlık.
- Diseksiyon ve kayıt salin mM28aşağıdakine hazırlamak: 157 NaCl, 3 KCl, 2 CaCl2, 4 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic asit (HEPES); 7.25 için pH titre.
- Larva Drosophila CNS incelemek.
- Tanımlayabilir ve göçebe bir üçüncü-biçim Drosophila melanogaster yeri ve kültür şişe serum (Şekil 3A) 200 µL ayıklayabilirsiniz.
- Ağız kanca bir çift iyi forseps ile kavramak ve kurt karın forseps (Şekil 3B) ikinci bir çifti ile kavramak.
Not: Bu kurtçuk ince cuticular tabaka yırtılmaya neden olabileceğinden çok fazla baskı karın için geçerli değildir. - Yavaşça ağız kanca ve karında farklı yönlere baş bölgesinden kurtçuk kaudal sonu ayırmak ve kurt (Şekil 3 c) iç organlar ortaya çıkarmak için çekin.
Not: MSS trakea ve sindirim yolu ile iç içe. CNS herhangi bir doku uzak azalan periferik sinirler kesme önlemek için uygun değil. - Sindirim sistemi ve trakea CNS forseps (şekil 3D) ile alay.
- Gerekirse, el ile kenasen bahar makasla CNS beyin lob posterior transecting tarafından kan beyin bariyerini bozabilir.
Not: Bu kullanılan kimyasal physiochemical özelliklerine göre yapılmalıdır. Kırmızı Şekil 4A önerilen transeksiyon noktası ve transected CNS sağlam azalan periferik sinir Şekil 4B' gösterilen şort ile uyumludur. Transected CNS adım 3.2.5 tamamlanmasından sonra deneme için hazırdır.
4. hücre dışı kayıt Drosophila CNS.
- MSS kayıt için hazırlayın.
- 5-15 mΩ direnci Cam Pipet elektrot borosilikat cam kılcal üzerinden çek.
- Transected CNS 200 µL serum içeren balmumu odanın içine yerleştirin. Yere kablo lehimli timsah klip ile kaplanmamış bir böcek PIN klamp ve iğneyi..... .devreyi tamamla serum yerleştirin.
- Micromanipulators kullanarak, transected CNS kaudal sonuna elektrot gelecek şekilde yönlendirin. Periferik sinir mayo başvurmadan önce alım/analiz yazılımı içinde eşik düzeyini ayarlayarak kayıt arka plan gürültü ortadan kaldırmak.
- Herhangi bir uygun periferik sinirler emme elektrot şırıngayı hafif negatif basınç uygulayarak çizin.
Not: atış frekans temel nerede daha fazla nöronlar oftentimes elektrot artan direnç neden elektrot çizilmiş nöronların sayısı için ilişkilidir.
- CNS sinir etkinliği azalan ekstraselüler kayıt başlar.
- Veri toplama yazılımı üzerinde'nın kaydı başlatmak ve atış frekans temel izlemek. Temel atış hızı verisi toplama önce 5 min için equilibrate ateş oranı sağlar.
- Ateş kontrol tedavi desen patlama desen benzer Şekil 5A' ise hazırlık ve kayıt atmak.
Not: Değiştirilmiş ateş paterni sinir işlevi değiştirebilirsiniz merkezi desen jeneratörü anormal ya da kararsız faaliyet göstermektedir. - 5 dk sonra 200 µL serum + araç kayıt denetimi oranları ateş başlamak için 400 µL Odası hacmi getirmek ekleyin.
- Temel kurulan (3-5 dk) sonra 200 µL serum çekilme ve 200 µL serum içinde çözündürüldükten deneysel aracısı ekleyin.
Not: Dimetil sülfoksit (DMSO) lipofilik bileşikler için önerilen solvent ve % 0.1 v/vaşmaması gerekir. - Seri bir şekilde (yüksek konsantrasyonları düşük) ilaç konsantrasyonları uygulamak ve her konsantrasyonu (uyuşturucu29kimyasal özelliklerine göre araştırmacı tarafından belirlenen) select bir süre için kayıt. Bu zaman nokta edinme/analiz yazılımı içerisindeki ilaç uygulaması ilaç ve son konsantrasyon içeren yorum ekleyerek etiket.
Not: MSS aktivitesinin ateş yaklaşık 10-20 oranında diseksiyon sonra 30-50 dakika sonra düşer ve bu nedenle, uygun tedavi edilmezse denetimleri içermesi gerektiğini ve ilaç tedavileri bu süreyi geçmemelidir.
- Verileri analiz.
Not: Aksiyon potansiyeli patlamaları29, spike dalga genlik ve zamanlı kurs ve kötü spike Frekanslar uyuşturucu tedavi26,30 sonra belirleme değişiklikler gibi toplanan veriler üzerinde birden fazla analizleri gerçekleştirilen , 31 , 32. en yaygın bir uyuşturucu aşağıda açıklanmıştır zaman belirli bir süre kötü spike frekanslara sahip etkisi belirliyor.- Tüm bölgenin ilgi (Yani, uyuşturucu tedavisi zaman dilimi) seçerek kötü spike Frekanslar çizelgeye geçirmek ve kötü spike frekansları aracılığıyla "satın alma/analiz ana araç çubuğunda bulunan Datapad otomatik olarak" belirlemek yazılım.
- Araç kontrol (temel) kötü spike sıklığı için İlaç tedavisinden sonra MSS kötü spike sıklığını belirler. Yüzde oranı formülüne göre uyuşturucu tedavi sonrasında atış değiştirmek hesaplamak: (tedavi frekans/temel frekans) × 100.
- Kontrol her yoğunlaşması demek spike frekansları veya yüzde firing bir konsantrasyon yanıt eğrisi ile standart yazılım grafik oluşturmak için kullanın.
- İstatistiksel çözümleme gerçekleştirme (Örneğin, unpaired t-test) önemi zaman puan, konsantrasyonları veya ilaç tedavileri arasında belirlemek için.
Not: Üretmek ve konsantrasyon-yanıt eğrileri analiz iki birincil yöntem vardır. Bireysel hazırlık başına bir konsantrasyon ilk yöntemdir. Burada, tek konsantrasyon spike oranını temel spike oranı her hazırlık için normalleştirilmiş. Faydaları azaltılmış hazırlık nedeniyle aşağı koşmak kayıt süresi kısaltılmış, tuzaklar artarken diseksiyon zaman çünkü bu yöntem 5-7 bireysel CNS hazırlıklar konsantrasyon başına oluşacaktır ve büyük hata çubukları üzerinde ortalama veri ayarlayın. Bireysel hazırlık başına birden fazla konsantrasyonları ikinci yöntemdir. Burada, her 3-5 konsantrasyonları spike oranı aynı temel spike oranı için normalleştirilmiş. Yararları daha az diseksiyon zaman ve tuzaklar önceki ilaç konsantrasyonu tedavileri sonraki kimyasal tedaviler üzerinde bir hızlı uyuşturucu ve bilinmeyen etkisi şartı ise daha az değişkenlik arasında ilaç konsantrasyonları için çoğaltır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Spontan aktivite Drosophila merkezi sinir sisteminden kaynaklanan azalan periferik sinir hücre dışı emme elektrotlar ile tutarlı tekrarlanabilirlik kullanarak kaydedilebilir. Çıkarılan ve kopuk Drosophila CNS spontan aktivite ateş 1-2 s yaklaşık 1 ile patlama döngüsel bir desen üretir yakınındaki sakin etkinlik, s. Örneğin, durgun (1-2 Hz) 0.5-1 için MSS yakındır 0.5-1 için yaklaşık 1 s ve sonra geri döner bir çevre deneniyor durumu (1-2 Hz) için bir veri bloğu (100-400 Hz) ardından s, s (Şekil 5A). Bu ateş desen tekrarlanan her 2-3 sn. Drosophila CNS ortalama spike deşarj sıklığı eşik sadece temel gürültü ayarlandığında bir 3-5 dk süre içinde yaklaşık 20-50 Hz den aralıkları. Atış frekans temel elektrot çizilmiş periferik sinir hücreleri ve elektrot ağız ve ventral gangliyon arasında kurulan mühür dizi ilişkilidir. Önemlisi, son konsantrasyonu % 0.1, kimyasal çözücü DMSO uygulanması spike deşarj sıklığını Drosophila CNS (Şekil 5A) değiştirmez.
Bu elektrofizyolojik hazırlık iyi karakterize bir böcek sinir sistemi spike sıklığı çeşitli küçük, uyarıcı ya da yatıştırıcı özelliklerini tanımlamak için bir yöntem sağlar. Propoxur, böcek asetilkolinesteraz (ağrı), bilinen bir önleyici bir neuroexcitant ve transected Drosophila CNS spike deşarj sıklığı bir konsantrasyon bağımlı şekilde (Şekil 5B) artırılması. Aksine, gama - aminobütirikasit (GABA), bilinen bir inhibitör nörotransmitter böcek GABA-aracılı klorür kanal hareket bir neurodepressant olduğunu ve bir konsantrasyon bağımlı şekilde (Şekil 5C spike deşarj sıklığı azalır ). Spike deşarj Frekanslar bir konsantrasyon yanıt eğrisi inşaatı etkinleştirmek her toplama kaydedilen süre boyunca yanıt temin için % 50 etkili konsantrasyonu (EC50) belirlemek için belirlenebilir demek. Burada, propoxur bir EC50 / 338 için gösterilen nM (% 95 güven aralığı (CI): 241-474; hillslope: 1.8; r2: 0.77) 1 µM Drosophila CNS % 300 etkinlik kontrol (rakam, maksimal uyarma üreten bir konsantrasyon ile 5 D)26. GABA 1.1 mm IC50 için gösterilir (% 95 GA: 0,7-1.5; hillslope: 1.5; r2: 0.95) 5 mm (Şekil 5E) maksimal inhibisyonu ile.
Oftentimes, sinir sistemlerinin moleküler probları kan beyin bariyerini nüfuz sağlayan uygun physiochemical Özellikler onların eksikliği nedeniyle fizyolojik veya toksikolojik deneyleri kullanılmak üzere mümkün değildir. Örneğin, monomeric tacrine bir güçlü olduğunu (ca. 200 nM) engelleyici böcek ağrısı33, henüz değiştirmemesi sağlam Drosophila CNS (Şekil 6A) spike sıklığı. Ancak, 100 µM monomeric tacrine ( maruz kaldıktan sonra Drosophila CNS spike sıklığını çevre hemen artışa sinirsel lamel ve kan beyin bariyerini transeksiyon beyin lob posterior aracılığıyla bozulma sonuçlandı Şekil 6B). Benzer veri yukarıda açıklanan30olmuştur.
Şekil 1: CNS üçüncü-biçim--dan eksize Drosophila melanogaster. Oklar etiketlerine karşılık gelen çeşitli anatomik yapıları MSS üzerine gelin. Ölçek çubuğu 250 µm. temsil eden Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: hücre dışı kayıtları gerçekleştirmek için kullanılan Elektrofizyoloji Kur. (A) Faraday kafesi; (B) titreşim tablo; (C) mikroskop dissekan; (D) AC/DC fark amplifikatör; (E) ses monitör; (F) gürültü giderici; (G) veri koordinat belirleme sistemi; (H) bilgisayar çalışan laboratuvar grafik pro yazılımı; (I) fiberoptik kablo dış aydınlatma kaynağı ile; (J) micromanipulator; (K) Elektrot tutucu ile basınç liman cam elektrot ve hazırlık balmumu çanak ile. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: MSS--dan üçüncü-biçim kurtçuklar bilincin için yöntem. (A) olduğu gibi kurtçuk sular altında 200 µL serum içinde. Ok vücut duvar ayrılması için kullanılır ağız kanca gösterir. (B) orta kurtçuk ve vücut duvar ayrılması başlamak için ağız kanca, forseps iki çift yerleştirilir. (C) vücut duvar iç organlar ortaya çıkarmak için hafif ve sürekli basınç uygulayarak ayrılır. (D) CNS açıkça görülebilir (beyaz ok) ve zaman zaman iç organlar ile iç içedir. Ölçek çubuğu 1000 µm, 750 µm, 500 µm ve A, B, C ve D, paneller için 200 µm sırasıyla temsil eder. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: MSS transecting tarafından kan beyin bariyerini bozulma. (A) sağlam sinirleri ventral gangliyon kaudal sonunda açıkça görünür azalan ile merkezi sinir sistemi. Kırmızı çizgi BBB bozmaya MSS transecting konumu belirtir. (B) A hala uzun azalan nöronlar açığa ventral gangliyon kaudal sonu ile CNS kesmiş. Ventral gangliyon göz ardı. Ölçek çubuğu her iki panelleri için 200 µm temsil eder. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: ö. melanogaster üçüncü-biçim larva CNS nörofizyolojik kayıtları. Temsilcisi sinir akıntı izleri önce ve (A) DMSO maruz kaldıktan sonra (B) propoxur ve (C) GABA. İlk ateş Frekanslar sivri/s (Hz) her deneme için her izleme soluna verilir. Konsantrasyon-yanıt eğrileri propoxur için (D) ve (E) GABA D. melanogaster larva CNS sinir deşarj Çoğaltılmış kayıtları (n = 3-5 konsantrasyonları eğrisi, başına en az 5 kez çoğaltılan her konsantrasyon ile). Oklar ilaç uygulama noktası temsil eder. Ortalama yüzde artış oranı ateş temellerin veri noktalarını temsil eder ve hata çubukları standart sapmayı temsil eder. Hata çubukları yok, çünkü onlar sembolü boyutundan daha küçük olmasıdır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6: artan penetrasyon tacrine sinir sistemi içine MSS transeksiyon sonra. (A) sağlam ve (B) temsilci kayıtları larva CNS oku uygulanan monomeric tacrine maruz kesmiş. İlk ateş Frekanslar sivri/s (Hz) her deneme için her izleme soluna verilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ayrıntıları ilişkili videoda sağlanan ve metin olması koşuluyla faaliyet ve Spike'ı kaydetmek için önemli adımlar Drosophila CNS ex vivosıklığını deşarj. Kısa ya da birkaç azalan nöronlar çoğaltır arasında büyük farklar neden olur oranı ateş temel azaltacaktır çünkü diseksiyon etkinliği yönteminin en kritik yönü var. Ancak, hakim diseksiyonu tekniği sonra bu tahlil ile toplanan veriler son derece tekrarlanabilir ve disiplinlerden geniş bir yelpazesi için iyileştirilebilir. Açıklanan yöntemi için bir değişiklik el ile serum fizyolojik ve kimyasal çözümleri CNS odasına pipette gerek engeller bir otomatik bolluk sistemi dahil olduğunu. Bolluk sistem dahil MSS bozuklukları bazen manuel pipetler ilaçlarla uygulanması sırasında meydana kayıtları sırasında azaltacaktır.
Elektrofizyolojik bu yöntem uyuşturucu/böcek ilacı keşif araştırma içine şirketler için hazırlık programı patlatır. Ayrıca, bu hazırlık sınıf gösteri Nörofizyoloji temel kavramlar için mükellef olduğunu. Yöntem nispeten mütevazı finansal yatırım gerektirir ve işlevi uyuşturucu etkisi göstermek için istihdam sağlam ve istikrarlı bir kayıt sağlarken en az hazırlık zaman uçup CNS. Örneğin, kayıt teçhizat mali yük küçük sonraki maliyeti (Örneğin, tuzlu tuzları, sinek koloni bakım, vb) ile bir başlangıç maliyeti yaklaşık $10.000 USD olduğunu. CNS hazırlık ilk kayıt için gereken zaman yaklaşık 10 dakika uzakta. Drosophila olmasına rağmen kültür laboratuar veya sınıf içinde bakımı kolay, bu bu emme elektrot tahlil de sinek, sinek domesticave muhtemelen diğer muscoid sinek larvaları CNS kullanarak yapılabilir olması gerekmektedir , de. Bu tahlil önemli yarar-e doğru araştırma, sinekler farklı popülasyonlar gelen nöronal duyarlılığını karakterize etmek için ya da yeni potens belirlemek için programlar geliştirilebilir sinek domestica haşere durumunu Hayvancılık için öneriyor neurotoxicants enfestasyonlar nihai kontrolü için.
Uyuşturucu potens karakterize ek olarak, bu hazırlık genetik mutasyonlar ve Drosophila sinir sisteminin etkinliği manipülasyon etkisi karakterize etmek için kullanılabilir. Önceki çalışma içe doğrultucu potasyum (kır) kanal tarafından temel CNS atış sıklığı yaklaşık 2 kat sinekler31denetlemek için karşılaştırıldığında artış gen kodlama bu CNS özgü nakavt göstermiştir. Bu veriler sonuçta fizyolojik rolü kır kanalları Drosophila sinir sistemi işlev için hizmet spekülasyon için farmakolojik verilerle birleştirilmiştir.
Her ne kadar bu teknik çeşitli toksikolojik ve fizyolojik hipotezler test etmek için güçlü bir tahlil temsil eder, tahlil için kısıtlamaları var ve dikkate alınmalıdır. Örneğin, nadiren emme elektrot kayıtları oluşturulan verilerin bir iyon kanalı için bir ilaç ya da kesin fizyolojik rolü eylem tam modu için kesin kanıt ve daha fazla hücre tabanlı ölçümleri ile tandem gibi okudu gerekir yama kelepçe Elektrofizyoloji. Bir ek bu yöntemin çeşitli reseptörleri ve iyon Kanal alt türleri CNS spike oranı eşit bir şekilde etkilemez kısıtlamadır. Bu nedenle, belirli bir reseptör veya iyon kanalı alt türündeki bir modülasyon eksize CNS spike oranı önemli ölçüde etkileyebilecek değil ama gerçekten toplam sinir sistemi fonksiyonu ve/veya entegrasyon sinyallerin kritik bir etkisi olabilir mümkündür.
Sınırlamalar mevcut olmasına rağmen emme elektrot kayıtları toplanan veriler kalite kanıtı-of-concept veri sağlamak ve araştırmacılar gerilim-kelepçe ile doğrulanmış eylem mekanizmaları ile ilgili hipotezler oluşturmak için izin Elektrofizyoloji, biyokimyasal analizler, veya ek farmakolojik sınama yoluyla. Örneğin, ikinci böcek keşfedilmeden, N, N- dietil-3-methylbenzamide (DEET), toksisite sivrisinekler için mekanizması açıklamak için bir çaba böcek CNS octopaminergic sisteminde inhibe olduğu hipotezi test etmek gerçekleştirildi ve 26uçar. SPREYE bir neuroexcitant sinek CNS faaliyet olduğu gösterilmiştir ve ayrıca kolinerjik nöromüsküler kavşak ve glutamatergic sistemleri, sırasıyla26uyarılmış eksitatör postsinaptik potansiyel değişmiş. Bu veriler daha önce önerilen34olduğu gibi DEET toksisite kolinerjik inhibisyonu yoluyla ikna etmek büyük olasılıkla olmadığını ileri sürdü. Sinek CNS deşarj sıklığını fentolamin maruz kaldıktan sonra kayıt, bilinen octopamine antagonisti gösterdi aracılı DEET neuroexcitation tam bir inhibisyonu, ama bu önemli kanıt DEET daha fazla sağlanan propoxur büyük olasılıkla ağrısı26daha octopaminergic sistemi etkileyen. Bu yayımlanmış veri kümeleri çeşitli hipotezler ve bu yöntemle araştırıldı deneysel koşullar vurgulayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bayan Rui Chen diseksiyon ve Drosophila CNS rakamlar gösterilen görüntüler için teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila melanogaster (strain OR) | Bloomington Drosophila Stock Center | 2376 | |
| Vibration isolation table | Kinetic Systems | 9200 series | |
| Faraday Cage | Kinetic Systems | N/A | |
| Dissecting Microscope on a Boom | Nikon | SMZ800N | Multiple scopes can be used; boom stand is critical |
| AC/DC differential amplifier | ADInstruments | AM3000H | The model 1700 can be used instead of the model 3000 |
| audio monitor | ADInstruments | AM3300 | |
| Hum Bug Noise Eliminator | A-M Systems | 726300 | |
| Data Acquisition System (PowerLab) | ADInstruments | PL3504 | Multiple PowerLab models can be used. |
| Lab Chart Pro Software | ADInstruments | N/A - Online Download | |
| Fiber Optic Lights | Edmund Optics | 89-740 | Different light sources can be used, but fiber optics are the most adaptable |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | M325 | |
| Microelectrode Holder | World Precision Instruments | MEH715 | Different models are acceptable |
| BNC cables | World Precision Instruments | multiple based on size | |
| Glass Capillaries | World Precision Instruments | PG52151-4 | |
| Microelectrode Puller | Sutter Instruments | P-1000 | Also can use Narashige PC-100 |
| Black Wax | Carolina Biological Supply | 974228 | |
| Non-coated insect pins, size #2 | Bioquip | 1208S2 | |
| Fince Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-03 |
References
- Sparks, T. C., Nauen, R. IRAC: Mode of action classification and insecticide resistance management. Pesticide Biochemistry and Physiology. 121, 122-128 (2015).
- Swale, D. R., et al. An insecticide resistance-breaking mosquitocide targeting inward rectifier potassium channels in vectors of Zika virus and malaria. Scientific Reports. 6, 36954 (2016).
- Troczka, B. J., et al. Stable expression and functional characterisation of the diamondback moth ryanodine receptor G4946E variant conferring resistance to diamide insecticides. Scientific Reports. 5, 14680 (2015).
- Bloomquist, J. R., et al. Voltage-sensitive potassium KV2 channels as new targets for insecticides. Biopesticides: State of the Art and Future Opportunities. 1172, Washington, DC. 71-81 (2014).
- Jenson, L. J., Bloomquist, J. R. Role of serum and ion channel block on growth and hormonally-induced differentiation of Spodoptera frugiperda (Sf21) insect cells. Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 90 (3), 131-139 (2015).
- Jenson, L. J., Sun, B., Bloomquist, J. R. Voltage-sensitive potassium channels expressed after 20-Hydroxyecdysone treatment of a mosquito cell line. Insect Biochemistry and Molecular Biolology. 87, 75-80 (2017).
- Chintapalli, V. R., Wang, J., Dow, J. A. Using FlyAtlas to identify better Drosophila melanogaster models of human disease. Nature Genetics. 39 (6), 715-720 (2007).
- Duffy, J. B. GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife. Genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).
- St Johnston, D. The art and design of genetic screens: Drosophila melanogaster. Nature Reviews Genetics. 3 (3), 176-188 (2002).
- Luan, Z., Li, H. S. Inwardly rectifying potassium channels in Drosophila. Sheng Li Xue Bao. 64 (5), 515-519 (2012).
- Muenzing, S. E. A., et al. Larvalign: Aligning gene expression patterns from the larval brain of Drosophila melanogaster. Neuroinformatics. 16 (1), 65-80 (2017).
- Sprecher, S. G., Reichert, H., Hartenstein, V. Gene expression patterns in primary neuronal clusters of the Drosophila embryonic brain. Gene Expression Patterns. 7 (5), 584-595 (2007).
- Zhou, S., et al. A Drosophila model for toxicogenomics: Genetic variation in susceptibility to heavy metal exposure. PLoS Genetics. 13 (7), e1006907 (2017).
- Manev, H., Dimitrijevic, N. Drosophila model for in vivo pharmacological analgesia research. European Journal of Pharmacology. 491 (2-3), 207-208 (2004).
- Pandey, U. B., Nichols, C. D. Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery. Pharmacological Reviews. 63 (2), 411-436 (2011).
- Hekmat-Scafe, D. S., Lundy, M. Y., Ranga, R., Tanouye, M. A. Mutations in the K+/Cl- cotransporter gene kazachoc (kcc) increase seizure susceptibility in Drosophila. Journal of Neuroscience. 26 (35), 8943-8954 (2006).
- Whitworth, A. J., et al. Increased glutathione S-transferase activity rescues dopaminergic neuron loss in a Drosophila model of Parkinson's disease. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 102 (22), 8024-8029 (2005).
- Watson, M. R., Lagow, R. D., Xu, K., Zhang, B., Bonini, N. M. A Drosophila model for amyotrophic lateral sclerosis reveals motor neuron damage by human SOD1. Journal of Biological Chemistry. 283 (36), 24972-24981 (2008).
- Rajendra, T. K., et al. A Drosophila melanogaster model of spinal muscular atrophy reveals a function for SMN in striated muscle. Journal of Cell Biology. 176 (6), 831-841 (2007).
- Chan, H. Y., Bonini, N. M. Drosophila models of human neurodegenerative disease. Cell Death and Differentiation. 7 (11), 1075-1080 (2000).
- Limmer, S., Weiler, A., Volkenhoff, A., Babatz, F., Klambt, C. The Drosophila blood-brain barrier: development and function of a glial endothelium. Frontiers in Neuroscience. 8, 365 (2014).
- Rickert, C., Kunz, T., Harris, K. L., Whitington, P. M., Technau, G. M. Morphological characterization of the entire interneuron population reveals principles of neuromere organization in the ventral nerve cord of Drosophila. Journal of Neuroscience. 31 (44), 15870-15883 (2011).
- Schwabe, T., Li, X., Gaul, U. Dynamic analysis of the mesenchymal-epithelial transition of blood-brain barrier forming glia in Drosophila. Biology Open. 6 (2), 232-243 (2017).
- Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature Reviews Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
- Abbott, N. J., Dolman, D. E., Patabendige, A. K. Assays to predict drug permeation across the blood-brain barrier, and distribution to brain. Current Drug Metabolism. 9 (9), 901-910 (2008).
- Swale, D. R., Sun, B., Tong, F., Bloomquist, J. R. Neurotoxicity and mode of action of N, N-diethyl-meta-toluamide (DEET). PLoS One. 9 (8), e103713 (2014).
- Hafer, N., Schedl, P. Dissection of larval CNS in Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments. (1), 85 (2006).
- Bloomquist, J. R. Mode of action of atracotoxin at central and peripheral synapses of insects. Invertebrate Neuroscience. 5 (1), 45-50 (2003).
- Bloomquist, J. R., Roush, R. T., ffrench-Constant, R. H. Reduced neuronal sensitivity to dieldrin and picrotoxinin in a cyclodiene-resistant strain of Drosophila melanogaster (Meigen). Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 19 (1), 17-25 (1992).
- Mutunga, J. M., et al. Neurotoxicology of bis(n)-tacrines on Blattella germanica and Drosophila melanogaster acetylcholinesterase. Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 83 (4), 180-194 (2013).
- Chen, R., Swale, D. R. Inwardly rectifying potassium (Kir) channels represent a critical ion conductance pathway in the nervous systems of insects. Scientific Reports. 8 (1), 1617 (2018).
- Francis, S. A., Taylor-Wells, J., Gross, A. D., Bloomquist, J. R. Toxicity and physiological actions of carbonic anhydrase inhibitors to Aedes aegypti and Drosophila melanogaster. Insects. 8 (1), 2 (2016).
- Swale, D. R., et al. Inhibitor profile of bis(n)-tacrines and N-methylcarbamates on acetylcholinesterase from Rhipicephalus (Boophilus) microplus and Phlebotomus papatasi. Pesticide Biochemistry and Physiology. 106 (3), 85-92 (2013).
- Corbel, V., et al. Evidence for inhibition of cholinesterases in insect and mammalian nervous systems by the insect repellent deet. BMC Biology. 7, 47 (2009).
