Summary
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zum Aufzeichnen der absteigenden elektrische Aktivität von Drosophila Melanogaster Zentralnervensystems ermöglichen kostengünstige und praktische Erprobung von pharmakologischen Wirkstoffen, Genmutationen neuronaler Proteine, und/oder die Rolle der unerforschten physiologischen Wege.
Abstract
Die Mehrzahl der derzeit verfügbaren Insektizide Ziel des Nervensystems und genetische Mutationen von Wirbellosen neuronaler Proteine liefern oft schädliche Folgen, doch die aktuellen Methoden zur Erfassung von Nervensystem Aktivität des Individuums Tier ist teuer und aufwändig. Diese Absaugung Elektrode Vorbereitung der dritte Instar Larven Zentralnervensystem von Drosophila Melanogaster ist ein gefügig System zum Testen der physiologischen Wirkungen neuroaktive Erreger, bestimmen die physiologische Rolle von verschiedenen neuronalen Wege zur CNS Aktivität sowie der Einfluss von genetischen Mutationen zu neuronalen Funktion. Diese ex-Vivo -Vorbereitung erfordert nur mäßig sezieren elektrophysiologische und Geschick um reproduzierbare Aufnahmen von Insekten neuronaler Aktivität zu generieren. Eine Vielzahl von chemischen Modulatoren, einschließlich Peptide, kann das Nervensystem in Lösung mit physiologischer Kochsalzlösung, die Einfluss auf die CNS-Aktivität zu messen direkt zugewiesen werden. Weitere genetische Technologien, wie das GAL4/UAS-System können unabhängig voneinander oder in Kombination mit pharmakologischer Substanzen festzustellen, die Rolle der spezifische Ionenkanäle, Transporter oder Rezeptoren an Arthropoden CNS-Funktion angewendet werden. In diesem Zusammenhang sind die hier beschriebenen Assays für Insektizid Toxikologen, Insekt Physiologen und Entwicklungs Biologen für die D. Melanogaster ein etabliertes Modellorganismus ist von wesentlichem Interesse. Das Ziel dieses Protokolls ist eine elektrophysiologische Methode ermöglichen die Messung der Electrogenesis des zentralen Nervensystems in der Modell-Insekt, Drosophila Melanogaster, die eignet sich für eine Vielfalt von wissenschaftlichen Tests zu beschreiben Hypothesen.
Introduction
Das übergeordnete Ziel dieses Ansatzes ist es, Forscher der Electrogenesis des zentralen Nervensystems (ZNS) in das Modell Insekt, Drosophila Melanogasterschnell messen können. Diese Methode ist zuverlässig, schnell und kosteneffizient durchzuführen physiologische und toxikologische Experimente. CNS ist wichtig für Leben und daher die physiologischen Wege kritischer für ordnungsgemäße neurale Funktion haben ausgiebig erforscht wurden, in einer Bemühung zu verstehen oder neuronale Funktion zu ändern. Charakterisierung der Signalwege innerhalb der Arthropoden CNS ermöglichte die Entdeckung von mehreren chemischen Klassen von Insektiziden, die Wirbellosen neuronale Funktion, um Sterblichkeit zu induzieren, während Ziel folgen zu begrenzen, zu stören. Somit ist die Fähigkeit, die neuronale Aktivität der Insekten zu messen von wesentlichem Interesse auf dem Gebiet der Insekten Toxikologie und Physiologie, da das Nervensystem das Zielgewebe der Mehrheit der eingesetzten Insektizide1 ist. Doch weiter Wachstum von Grundlagen- und anwendungsorientierte Kenntnisse über das Insekt Nervensystem erfordert fortgeschrittene neurophysiologische Techniken, die in der Machbarkeit, begrenzt sind, da aktuelle Techniken arbeitsintensiv sind und erfordern einen hohen Aufwand, Insekt neuronale Zelllinien sind begrenzt, und/oder es gibt begrenzten Zugang zu den zentralen Synapsen der meisten Arthropoden. Charakterisierung der meisten Insekten neuronaler Proteine erfordert derzeit, das Ziel zu geklonten und heterologously ausgedrückt für nachfolgende Wirkstoffsuche und elektrophysiologische Aufnahmen, wie für Insekt nach innen Gleichrichter Kaliumkanäle2 beschrieben wurde , Insekt Ryanodin-Rezeptor3, Moskito Spannung-empfindliche K+ Kanäle4und andere. Um die Anforderung für die heterologe Expression und das Potenzial für geringe funktionelle Expression zu mindern, kultiviert Bloomquist und Kollegen zielte darauf ab, einen neuronalen Phänotyp in induzieren Spodoptera Frugiperda (Sf21) Zellen als eine neuartige Methode zur Insektizid Entdeckung5,6. Diese Methoden bieten einen gültigen Ansatz für die Entwicklung der neuen Chemie, doch sie schaffen oft einen unüberwindbaren Engpass für die Charakterisierung von pharmakologischen Wirkstoffen, Mechanismen der Insektizid Widerstand und Charakterisierung der physiologischen Grundprinzipien. Hier beschreiben wir eine ex-Vivo -Methode, die es ermöglicht die Aufzeichnung der elektrischen Aktivität von einer Modell-Insekt, die formbar Genetik7,8,9 hat und bekannte Expressionsmuster von neuronalen komplexe10,11,12 , die Charakterisierung von Resistenzmechanismen auf der Ebene der Nerven, die Wirkungsweise von neu entwickelten Medikamenten und anderen toxikologischen Studien zu ermöglichen.
Der Fruchtfliege, D. Melanogaster, ist gemeinsame Modellorganismus für die Definition von Insekten Nervensysteme oder Insektizid Wirkmechanismus und etabliert sich als Modellorganismus gut geeignet für das Studium der toxikologischen13, pharmakologische14 ,15, neurophysiologische16und pathophysiologischen17,18,19,20 Prozesse der Wirbeltiere. D.melanogaster ist ein holometabolous Insekt, die komplette Metamorphose, einschließlich ein Larven- und pupal Stadium vor Erreichen der reproduktiven Erwachsenstadium ausführt. Während des Entwicklungsprozesses das Nervensystem unterliegt erheblichen Umbau in verschiedenen Lebensphasen, aber die Larven CNS werden im Mittelpunkt dieser Methodik. Die voll entwickelte Larven CNS ist anatomisch einfach mit thorakalen und abdominalen Segmenten, die sind verschmolzen und bilden die ventralen Ganglion, die ein Array von wiederholten und fast identischen Neuromeric Einheiten21,22darstellt. Absteigende motorische Nerven stammen aus dem kaudalen Ende des Subesophageal Ganglien und hinabsteigen, um die Körperwand Muskeln und viszeralen Organe der Larven innervieren. Abbildung 1 beschreibt die Anatomie der Larven Drosophila CNS.
Drosophila Blut - Hirn-Schranke (BBB) am Ende der Embryogenese entwickelt und wird durch Subperineurial Gliazellen (SPG)21gebildet. Die SPG-Zellen bilden zahlreiche Filopodien-ähnliche Prozesse, die ausgebreitet, um eine zusammenhängende, sehr flach, Endothelzellen wie Blatt zu etablieren, das die gesamte Drosophila CNS23abdeckt. Die Drosophila BBB hat Ähnlichkeiten mit der vertebrate BBB, Erhaltung der Homöostase der neuronalen Mikroumgebung durch die Kontrolle des Eintrags von Nährstoffen und Xenobiotika in der CNS-21umfasst. Dies ist eine Voraussetzung für zuverlässige neuronale Übertragung und Funktion, noch der Schutz des ZNS durch die BBB schränkt die Permeation von synthetischen Drogen, die meisten Peptide und andere Xenobiotika24,25, das Potenzial einführt Probleme bei der Charakterisierung von Potenzen von kleinen Molekül-Modulatoren. Die Methode verwendet eine einfache Durchtrennung stören diese Barriere und pharmakologischen Zugriff auf den zentralen Synapsen.
Die größte Stärke der beschriebenen Methode ist die Einfachheit, Reproduzierbarkeit und relativ hohem Durchsatz Kapazität dieses Systems. Das Protokoll ist relativ leicht zu meistern, das Setup benötigt wenig Platz und nur einen ersten finanziellen Aufwand ist notwendig, die Reagenzien und Verbrauchsmaterialien reduziert wird. Darüber hinaus ist das beschriebene Verfahren völlig amendable Aufzeichnen der zentrale absteigende Nerven-Aktivität von der Stubenfliege Musca Domestica26.
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Protocol
1. Geräte und Materialien
- Bereiten Sie die erforderlichen Komponenten (siehe Tabelle der Materialien) der Elektrophysiologie Rig Saug Elektrode Aufnahmen von Drosophila CNS durchführen.
Hinweis: Vor dem Experimentieren ist es notwendig, Kammern für Dissektion der Drosophila CNS zu konstruieren und zum Baden der Ganglien in Kochsalzlösung bei Aufnahmen verwendet werden. Nachfolgend finden Sie eine schrittweise Gliederung der Kammer-Konstruktion. - Bereiten Sie die Larven Kammer.
- Schmelzen Sie die schwarzen Wachs mit einer Heizplatte.
- Gießen Sie 2 mL geschmolzene Wachs in einer Kammer, die ein maximales Volumen von 2-2,5 mL hat.
- Lassen Sie das Wachs abkühlen und Aushärten für ca. 2 h.
- Verwenden Sie eine Rasierklinge, um ein Loch in den gehärteten Wachs zu schnitzen, die ein Volumen von 500 µL halten wird, hat eine Fläche von ca. 0,5 cm2 und einer Tiefe von ca. 0,25 cm.
2. Ausrüstung und Software-Konfiguration
Hinweis: Das Setup der extrazellulären Aufnahme wird nachfolgend kurz beschrieben.
- Bereiten Sie Ausrüstung für Dissektion und Aufnahme.
- Positionieren Sie das Gewebe Vorbereitung, Mikroskop, Saug-Elektrode, Mikromanipulatoren, Lichtquelle in den Faraday-Käfig zur Reduzierung von Lärm und äußere elektrische Felder (Abbildung 2) zu beseitigen.
- Verbinden (vorzugsweise Löten) Boden und positive Drähte auf abgeschirmt Krokodilklemmen, die mit der Badewanne und Mikroelektrode Inhaber bzw. verbunden werden.
Hinweis: Verlötet und freiliegende Leitungen können mit Alu-Folie zur Lärmreduzierung abgedeckt werden. - Schließen Sie den Boden und positive Drähte an Eingang 1 von AC/DC Differenzverstärker.
- Anschließen Sie das Datenerfassungssystem an AC/DC Differenzverstärker indem ein Bajonett Neill-Concelman (BNC) Kabel von Eingang 1 das Datenerfassungssystem auf Kanal 1 Ausgang des Verstärkers.
Hinweis: Es wird empfohlen, einen 50/60 Hz Lärm Eliminator zwischen der Datenerfassungs-Software und dem Verstärker zu integrieren. Die Verwendung eines BNC-T-Anschluss ist erforderlich. - Falls gewünscht, gehören Sie einen Audio-Monitor in das Setup durch den Anschluss Eingang 1 des audio Monitors an Eingang 1 von der Datenerfassungs-Software.
- Füllen Sie 10 mL Spritze mit Kochsalzlösung und verbinden Sie es mit dem Druckanschluß des Elektrodenhalters.
Hinweis: Stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen zwischen der Spritze, das Pellet Ag/AgCl und die Elektrode Öffnung bestehen.
- Bereiten Sie die Software für die Dissektion und Aufnahme.
Hinweis: Die Umrisse der Methoden für Software-Setup basiert auf die Übernahme/Analyse-Software in der Tabelle der Materialien , die rohe elektrische Leistung zu digitalisieren und konvertieren Sie die Daten zur Häufigkeit Spike, aufgeführt. Jedoch können andere Software verwendet werden und mehrere Aufnahme-Konvertierungen verwendet werden.- Öffnen Sie die Erfassung/Analyse-Software.
- Klicken Sie auf "Setup" aus dem Haupt-Symbolleiste und wählen Sie "Kanaleinstellungen", die wodurch ein Dialogfeld geöffnet wird.
- Reduzieren Sie die Anzahl der insgesamt Kanäle auf drei.
- Für Kanal 1, wählen Sie einen Bereich von 100 mV.
- Kanal 2 Klicken Sie auf der Registerkarte "Berechnung", die ein Drop-Down-Menü öffnet. Wählen Sie "zyklische Messungen", die wodurch ein zweites Dialogfeld geöffnet wird.
- Wählen Sie Kanal 1 als Quelle. Wählen Sie dann auf das Drop-down Menü Messung, Gerät Spike bei Veranstaltungen. Zu guter Letzt in den Erfassungsbereich Einstellungen aus dem Drop-down-Menü wählen Sie einfache Schwelle.
- Um die elektrische Aktivität in einem Rate-Grundstück in Hertz ausgedrückt zu konvertieren, 3rd Kanal im arithmetischen Modus festgelegt werden: das Eingabefenster geben Sie in "1000*smoothsec(ch2,2)". Dann wählen Sie die Einheiten im Dropdown-Menü Hertz.
Hinweis: Erfolgreiche Aufnahmen können mit mehreren verschiedenen Aufnahme-Setups durchgeführt werden, aber "Einheit Spike bei Veranstaltungen und einfache Schwelle" ist wahrscheinlich die einfachste, da es erlaubt eine Anpassung der Schwelle oberhalb der Hintergrundaktivität für jeden einzelnen Aufnahme. Aufnahmen unter der Einstellung "Custom-Source Input" erhöhen Reproduzierbarkeit der Daten vorausgesetzt, die Hintergrundaktivitäten nicht anders zwischen den Aufnahmen ist. - Engen Dialogboxen, um zum Hauptbildschirm zurückzukehren. Die y-Achse sollte in Hz und der x-Achse in Zeit ausgedrückt werden.
(3) zerlegen Sie und bereiten Sie der Larven Drosophila CNS vor
Hinweis: Methoden für die Larven CNS Dissektion sind deutlich in Hafer und Schedl27, aber diese zuvor veröffentlichten Methoden reduzieren Sie die Länge der absteigenden Neuronen, die wichtig für die Messung von Spike Frequenz sind. Hier ist eine zusätzliche Methode beschrieben, um die Larven CNS Verbrauchsteuern, die lange, intakte absteigende Neuronen unterhält.
- Kochsalzlösung Vorbereitung.
- Bereiten Sie die Dissektion und Aufnahme Kochsalzlösung an folgende in mM28: 157 NaCl, 3 KCl, 2 CaCl2, 4 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic Säure (HEPES); titrieren Sie pH-Wert auf 7,25.
- Die Larven Drosophila CNS zu sezieren.
- Identifizieren Sie und extrahieren Sie einer wandernden dritte Instar Drosophila Melanogaster aus dem Kulturfläschchen und in 200 µL der Saline (Abb. 3A).
- Greifen Sie die Mund-Haken mit einer feinen Pinzette und begreifen Sie den Bauch die Maden mit einem zweiten paar der Zange (Abb. 3 b).
Hinweis: Gelten Sie nicht zuviel Druck auf den Bauch, da dies der kutikulären Dünnschicht des die Maden zu reißen führen kann. - Ziehen Sie vorsichtig den Mund Haken und Bauch in verschiedene Richtungen zu trennen kaudalen Ende der Maden aus der Kopfregion und setzen die Eingeweide von Maden (Abbildung 3).
Hinweis: Die CNS wird mit der Luftröhre und Verdauungstrakt verflochten. Geschnitten Sie die CNS Weg von jedem möglichem Gewebe um zu vermeiden, schneiden die absteigenden peripheren Nerven nicht. - Die CNS aus dem Verdauungstrakt und Luftröhre mit Zange (Abbildung 3D) necken.
- Falls erforderlich, stören Sie die Blut-Hirn-Schranke, indem manuell vor der CNS nach der zerebralen Lappen mit einer Schere Vannas Frühling.
Hinweis: Dies sollte basierend auf physiochemischen Eigenschaften der verwendeten Chemikalie erfolgen. Die rote Linie in Abbildung 4A ist die vorgeschlagene Durchtrennung und die durchtrennten CNS mit intakten absteigenden peripheren Nerven Stämme dargestellt in Abbildung 4 b. Die durchtrennten CNS ist bereit für Experimente nach Abschluss von Schritt 3.2.5.
(4) extrazelluläre Aufnahme von Drosophila CNS.
- Aufnahme die CNS vorbereiten.
- Ziehen Sie eine Pipette Glaselektrode aus Borosilikatglas Kapillaren zu einem Widerstand von 5-15 mΩ.
- Legen Sie die durchtrennten CNS in die Wachs-Kammer, die 200 µL Kochsalzlösung enthält. Klemmen Sie eine unbeschichtete Insekt Pin mit der Krokodilklemme an die Masseleitung angelötet und setzen Sie den Stift in die Kochsalzlösung um den Stromkreis zu schließen.
- Orientieren Sie mit Hilfe der Mikromanipulatoren, sich die Elektrode am kaudalen Ende des durchtrennten ZNS. Beseitigen Sie Aufnahme Hintergrundgeräusche durch die Anpassung der Schwellenwert in der Akquisition/Analyse-Software vor der Kontaktaufnahme mit den peripheren Nerven-Stämmen.
- Ziehen Sie bequeme peripheren Nerven in die Absaugung Elektrode durch leichten negativen Druck auf die Spritze.
Hinweis: Die Grundlinie feuern Frequenz ist die Anzahl der Neuronen in der Elektrode gezogen, wo führen zu mehr Neuronen oft erhöhte Resistenz der Elektrode korreliert.
- Starten Sie die extrazelluläre Aufnahme des ZNS absteigenden Nerven-Aktivität.
- Starten Sie die Aufnahme auf der Datenerfassungs-Software und überwachen Sie die Grundlinie feuern Frequenz zu. Lassen Sie die Feuerrate, equilibrate für 5 min vor der Grundlinie feuern Tarifdaten zu sammeln.
- Die Vorbereitung und Aufnahme zu verwerfen, wenn das Muster der Abschuss von Kontrolle der Behandlung kein bersten Muster ähnlich dem in Abbildung 5Agezeigt ist.
Hinweis: Veränderte Muster der Zündung schlägt abnorme oder instabile Aktivität des zentralen Pattern-Generator, der neuronale Funktion verändern können. - Fügen Sie nach 5 min 200 µL der Saline + Fahrzeug bringen das Gesamtvolumen der Kammer in 400 µL Aufnahmesteuerung feuern Preise beginnen.
- Nachdem Grundlinie etablierten (3-5 min) wurde, 200 µL der Saline zurückziehen und 200 µL des experimentellen Agenten solubilisiert in Kochsalzlösung hinzufügen.
Hinweis: Dimethyl Sulfoxid (DMSO) ist die empfohlene Lösungsmittel für lipophile Verbindungen und 0,1 % V/Vnicht überschreiten. - Gelten Sie Droge-Konzentrationen in einer seriellen Weise (niedrige bis hohe Konzentrationen), und notieren Sie jede Konzentration für einen ausgewählten Zeitraum (bestimmt durch den Prüfarzt basierend auf die chemischen Eigenschaften der Droge29). Beschriften Sie diesem Zeitpunkt Drug Application in der Akquisition/Analyse-Software durch die Aufnahme einer Anmerkung, die das Medikament und die letztendliche Konzentration enthält.
Hinweis: Brand Aktivität des ZNS wird sinken um ca. 10-20 % nach 30-50 min nach der Präparation und daher entsprechende unbehandelte Kontrollen durchgeführt werden und medikamentöse Behandlungen sollte diesen Zeitraum nicht überschreiten.
- Die Daten zu analysieren.
Hinweis: Mehrere Untersuchungen können auf die gesammelten Daten, wie z. B. Veränderungen in Aktionspotential platzt29, Spike Wellenform Amplitude und zeitlicher Verlauf und Bestimmung der mittleren Spitze Frequenzen nach Medikament Behandlung26,30 durchgeführt werden , 31 , 32. die am weitesten verbreitete ist die Bestimmung des Einflusses ein Medikaments muss die mittlere Spitze Frequenzen über einen bestimmten Zeitraum hinweg, die unten beschrieben ist.- Tabellieren Sie mittlere Spitze Frequenzen durch die gesamte Region von Interesse (d. h. die medikamentöse Behandlung Zeitraum) auswählen und bestimmen Sie, mittlere Spitze Frequenzen automatisch durch das "Alter" befindet sich auf der Hauptsymbolleiste auf der Akquisition/Analyse Software.
- Ermitteln Sie die mittlere Spitze Frequenz des ZNS nach medikamentöse Behandlung auf die mittlere Spitze Frequenz der Fahrzeugkontrolle (Baseline). Die prozentuale Veränderung der Feuerrate nach medikamentöse Behandlung nach folgender Formel zu berechnen: (Frequenz/Baseline-Frequenz behandelt) × 100.
- Verwenden Sie das mittlere Spitze Frequenzen oder Prozent Feuern der Steuerung für jede Konzentration um eine Antwort Konzentrationskurve mit Standard Grafik-Software zu erstellen.
- Statistische Analysen durchführen (z. B. ungepaarten t-test) Bedeutung zwischen den Zeitpunkten, Konzentrationen oder medikamentöse Behandlungen zu bestimmen.
Hinweis: Es gibt zwei primäre Methoden zur Erzeugung und Analyse von Konzentration-Wirkungs-Kurven. Die erste Methode ist eine Konzentration pro Individualanfertigung. Hier ist die Spikerate der einzelnen Konzentration auf Basis Spikerate für jede Zubereitung normalisiert. Die Leistungen werden gekürzt heruntergekommen der Vorbereitung durch verkürzte Aufnahmezeit, während die Fallstricke steigen Dissektion Zeit, weil diese Methode besteht aus 5-7 individuelle CNS Vorbereitungen pro Konzentration, und größere Fehler bars auf den gemittelten Daten Satz. Die zweite Methode ist mehrere Konzentrationen pro Individualanfertigung. Hier werden die Spikerate für jede der 3-5-Konzentrationen, die gleiche Grundlinie Spikerate normalisiert. Die Vorteile sind weniger Dissektion Zeit und weniger Variabilität zwischen repliziert für Droge-Konzentrationen, während die Fallstricke der Anforderung ein schnell wirkendes Medikament und unbekannten Auswirkungen der Vorbehandlungen Medikament Konzentration auf nachfolgende chemische Behandlungen sind.
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Representative Results
Spontane Aktivität der absteigenden peripherer Nerven aus Drosophila Zentralnervensystem kann konsistente Reproduzierbarkeit extrazelluläre Saugelektroden mit aufgezeichnet werden. Spontane Aktivität der ausgeschnittenen und durchtrennten Drosophila CNS erzeugt ein zyklisches Muster platzen mit 1-2 s der Zündung mit ca. 1 s von in der Nähe von ruhenden Aktivität. Die CNS ist z. B. in der Nähe von ruhenden (1-2 Hz) für 0,5-1 s, gefolgt von einem Ausbruch (100-400 Hz) für ca. 1 s, und anschließend wieder zurück, in der Nähe von Ruhezustand (1-2 Hz) für 0,5-1 s (Abb. 5A). Diese feuern Muster wiederholt sich alle 2-3 s. Die durchschnittliche Spike Entlastung von Drosophila CNS Frequenzbereiche von ca. 20-50 Hz über einen Zeitraum von 3-5 min wenn die Schwelle oberhalb der Grundlinie Lärm festgelegt ist. Die Basislinie feuern Frequenz ist die Anzahl der peripheren Neuronen in der Elektrode gezogen und die Dichtung zwischen der Elektrode-Öffnung und der ventralen Ganglien gebildet korreliert. Wichtig ist, ändert Anwendung von chemischen Lösungsmittel DMSO auf eine Endkonzentration von 0,1 % nicht die Spitze Entlastung Frequenz der Drosophila CNS (Abb. 5A).
Diese elektrophysiologische Vorbereitung bietet eine Methode, um die erregenden oder dämpfenden Eigenschaften von verschiedenen kleinen Molekülen auf der Spike-Frequenz eines gut charakterisierten Insekt neural Systems charakterisieren. Propoxur, einem bekannten Inhibitor der Insekten Acetylcholinesterase (AChE), ist ein Neuroexcitant und erhöht die Spike-Entlastung-Frequenz der durchtrennten Drosophila CNS in gewissem Sinne Konzentration abhängig (Abb. 5 b). Im Gegenteil, Gamma - Aminobuttersäure (GABA), ein bekannter hemmenden Neurotransmitter handeln auf das Insekt GABA-vermittelte Chloridkanal, ein Neurodepressant und reduziert die Spike-Entlastung-Frequenz in gewissem Sinne Konzentration abhängig (Abbildung 5 ). Meine Spitze Entlastung, die Frequenzen über den erfassten Zeitraum für jede Konzentration ermöglichen den Bau einer Konzentrationskurve Reaktion festgestellt werden können, die 50 % wirksame Konzentration (EG50) bestimmt eine Antwort zu entlocken. Propoxur ist hier haben eine EG-50 von 338 nM (95 % Konfidenzintervall (CI): 241-474; Hang: 1,8; R2: 0.77) mit einer Konzentration von 1 µM erzeugen maximale Anregung von Drosophila CNS bei 300 % Aktivität des Steuerelements (Abbildung 5D)26. GABA wird gezeigt, eine IC-50 von 1,1 mM (95 % CI: 0,7-1,5; Hang: 1,5; R2: 0.95) mit maximale Hemmung bei 5 mM (Abb. 5E).
Oft sind molekularen Sonden neuronaler Systeme nicht in der Lage, in physiologische oder toxikologische Tests aufgrund ihres Mangels an korrekten physiochemischen Eigenschaften verwendet werden, die Penetration der Blut-Hirn-Schranke zu ermöglichen. Zum Beispiel Monomeren Tacrine ist ein potenter Inhibitor (ca. 200 nM) von Insekten AChE33, ändert jedoch nicht die Spike-Frequenz der intakten Drosophila CNS (Abb. 6A). Führte jedoch Störung der neuronalen Lamelle und die Blut-Hirn-Schranke durch Durchtrennung posterior, die zerebrale Lappen ein in der Nähe von unmittelbaren Anstieg der Spike Häufigkeit der Drosophila CNS nach Exposition gegenüber 100 µM Monomeren Tacrine ( Abbildung 6 b). Ähnliche Daten wurden zuvor beschriebenen30.
Abbildung 1: herausgeschnitten CNS von dritte Instar Drosophila Melanogaster. Pfeile zeigen auf verschiedenen anatomischen Strukturen des ZNS, die die Bezeichnungen entsprechen. Der Maßstabsbalken entspricht 250 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Elektrophysiologie-Setup, das verwendet wird, um die extrazelluläre Aufnahmen durchzuführen. (A) Faraday-Käfig; (B) Vibrationstisch; (C) Mikroskop seziert; AC/DC Differenzverstärker (D) ; (E) Audio-Monitor; (F) Lärm Eliminator; Datenerfassungssystem (G) ; (H) laufenden Computerraum chart pro-Software; (I) LWL Kabel mit externen Lichtquelle; (J) Mikromanipulator; (K) Mikroelektrode Halter mit Druckanschluß mit Glasschale Elektrode und Vorbereitung Wachs. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Methode für die CNS von dritte Instar Maden besteuert. (A) intakt Made in 200 µL Kochsalzlösung getaucht. Der Pfeil zeigt die Mund-Haken, die für die Trennung von der Körperwand verwendet werden. (B) zwei Paare der Zange befinden sich in der Mitte von den Maden und an den Mund Haken zur Trennung von der Körperwand beginnen. (C) Körperwand ist getrennt durch leichte und kontinuierlichen Druck der Eingeweide aussetzen. (D) CNS ist deutlich sichtbar (weisse Pfeile) und ist gelegentlich mit den Eingeweiden verflochten. Die Maßstabsleiste stellt 1000 µm, 750 µm, 500 µm und 200 µm für Platten A, B, C und D, beziehungsweise. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: Störung der Blut-Hirn-Schranke durch das ZNS vor. (A) intakt CNS mit absteigenden Nerven deutlich sichtbar am kaudalen Ende der ventralen Ganglien. Die rote Linie gibt den Speicherort der zu der CNS um die BBB zu stören. (B) A durchtrennten CNS mit dem kaudalen Ende der ventralen Ganglien noch lange absteigende Neuronen auszusetzen. Die ventralen Ganglien können verworfen werden. Die Maßstabsleiste stellt 200 µm für beide Platten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5: neurophysiologische Aufnahmen von der CNS dritte Instar Larven von D. Melanogaster. Repräsentative Nerven Entlastung Spuren vor und nach der Exposition auf (A) DMSO, Propoxur (B) und (C) GABA. Erste Zündung Frequenzen in Spikes/s (Hz) für jedes Experiment sind links von jeder Spur gegeben. Konzentration-Wirkungs-Kurven für Propoxur (D) und GABA (E) , CNS Nerven Entlastung von D. Melanogaster Larven von replizierten Aufnahmen (n = 3-5 Konzentrationen pro Kurve, mit jeder Konzentration mindestens 5 Mal repliziert). Pfeile stehen für Punkt Drug Application. Datenpunkte mittlere Prozent Anstieg der Basislinie Feuerrate und Fehlerbalken darstellen Standardabweichung. Wenn Fehlerindikatoren abwesend sind, dann deshalb, weil sie kleiner als die Größe des Symbols sind. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 6: erhöhte Eindringen des Nervensystems nach Durchtrennung des ZNS von Tacrine. Durchtrennten repräsentative Aufnahmen intakt (A) und (B) Larven CNS Monomeren Tacrine, die den Pfeil angewendet wurde ausgesetzt. Erste Zündung Frequenzen in Spikes/s (Hz) für jedes Experiment sind links von jeder Spur gegeben. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Die Angaben in dem zugehörigen Video und Text haben wichtige Schritte, um die Aktivität und Spike erfassen Häufigkeit von Drosophila CNS ex VivoEntlastung zur Verfügung gestellt. Die Dissektion Wirksamkeit ist der wichtigste Aspekt der Methode, weil kurze oder paar absteigende Neuronen verkürzt die Grundlinie Feuerrate, die zu großen Abweichungen zwischen den Wiederholungen führt. Jedoch sobald die Dissektion Technik gemeistert hat, sind die Daten mit diesem Test sehr reproduzierbar und amendable für eine Vielzahl von Disziplinen. Eine Änderung der beschriebenen Methode ist die Aufnahme eines automatisierten Fülle-Systems, das die Notwendigkeit, manuell die Salinen und chemische Lösungen pipette in die CNS-Kammer verhindert werden. Aufnahme des Fülle Systems verringert Störungen des ZNS während der Aufnahmen, die gelegentlich, während der Anwendung von Medikamenten mit manuellen Pipetten auftreten.
Diese elektrophysiologische Methode nutzt das Dienstprogramm der Vorbereitung für den Einbau in Droge/Insektizid Wirkstoffforschung. Darüber hinaus ist dieses Präparat zugänglich für den Unterricht zur Demonstration der grundlegenden Konzepte in Neurophysiologie. Die Methode erfordert relativ bescheidenen finanziellen Investitionen und minimaler Vorbereitungszeit und bietet gleichzeitig eine robuste und stabile Aufnahme, die eingesetzt werden kann, um dem Einfluss von Drogen auf die Funktion zu veranschaulichen fliegen CNS. Zum Beispiel ist die finanzielle Belastung durch die Aufnahme Rig einem Anschaffungskosten von rund 10.000 US-Dollar mit geringen Folgekosten (z. B. Kochsalzlösung Salze, Fliege Kolonie Wartung, etc.). Darüber hinaus ist die Zeit, die Ersteinspielung von CNS Vorbereitung mussten ca. 10 min. Obwohl Drosophila sind sehr pflegeleicht in Kultur innerhalb eines Labors oder Klassenzimmer, sei darauf hingewiesen, dass dieser Sauger Elektrode Assay mit CNS die Stubenfliege Musca Domesticaund wahrscheinlich noch andere moosigen Fliegenlarven auch durchgeführt werden können Auch. Die Pest-Status der Musca Domestica an Nutztiere schlägt dieser Assay von erheblichen Nutzen für die Forschung entwickelt werden könnte, die Programme mit dem Ziel, die neuronale Empfindlichkeit fliegen aus verschiedenen Populationen zu charakterisieren oder die Potenz des neu zu bestimmen Neurotoxicants für eventuelle Kontrolle über parasitäre Erkrankungen.
Zusätzlich zu charakterisieren die Wirksamkeit von Medikamenten, kann dieses Präparat verwendet werden, um den Einfluss von genetischen Mutationen und Manipulation auf die Aktivität des Nervensystems Drosophila zu charakterisieren. Vorarbeiten hat gezeigt, dass CNS-spezifische Knockdown von gen-Codierung nach innen Gleichrichter, Kaliumkanal (Kir) die Grundlinie CNS feuern Frequenz von ca. 2-fach erhöht, im Vergleich zum Fliegen31steuern. Diese Daten wurden kombiniert mit pharmakologischen Daten letztlich spekulieren, dass die physiologische Rolle Kir-Kanäle, Drosophila Funktion des Nervensystems dienen.
Obwohl diese Technik einen leistungsstarke Assay, vielfältige physiologische und toxikologische Hypothesen zu testen darstellt, Beschränkungen in Bezug auf die Probe existieren und müssen berücksichtigt werden. Zum Beispiel durch Absaugung Elektrode Aufnahmen selten generierten Daten einen Ionenkanal schlüssigen Beweise für die genaue Wirkungsweise eines Medikaments oder genaue physiologische Rolle vorsehen und müssen im Tandem mit mehr Zell-basierte Messungen, wie z. B. geprüft werden Patch-Clamp-Elektrophysiologie. Eine weitere Einschränkung dieser Methode ist, dass die verschiedenen Rezeptoren und Ionen-Kanal Sub-Typen nicht die CNS Spikerate in gleicher Weise beeinflussen. Daher ist es möglich, dass eine Modulation eines spezifischen Rezeptor oder Ionenkanal Untertyps keinen signifikanten auf die Spikerate des ausgeschnittenen ZNS Einfluss kann, aber möglicherweise in der Tat einen entscheidenden Einfluss auf die Funktion des gesamten Nervensystems und/oder Integration von Signalen.
Zwar Einschränkungen vorhanden sind, durch Absaugung Elektrode Aufnahmen gesammelten Daten liefern Beweis-vonkonzept Qualitätsdaten und erlauben Forschern, Hypothesen über Wirkmechanismen zu generieren, die durch Spannung-Klemme überprüft werden können Elektrophysiologie, biochemische Analysen oder durch zusätzliche pharmakologischen Tests. Z. B. Letzteres wurde durchgeführt, um die Hypothese zu testen, dass Insektenspray, N, N- Diethyl-3-Methylbenzamide (DEET), in einer Bemühung, den Mechanismus der Toxizität für die Mücken zu beschreiben das Octopaminergic-System im Insekt CNS Hemmung war und 26fliegt. DEET wurde gezeigt, um eine Neuroexcitant der Stubenfliege CNS Tätigkeit sein und auch verändert das evozierte exzitatorische postsynaptischen Potential an der neuromuskulären Synapse, die cholinerge und glutamatergen Systeme, bzw.26. Diese Daten vorgeschlagen, dass DEET nicht induzieren Toxizität durch cholinerge Hemmung, wahrscheinlich war wie zuvor vorgeschlagenen34. Aufnahmefrequenz die Entlastung der Fliege CNS nach Exposition mit Phentolamin, ein bekannten Octopamin-Antagonisten, zeigte eine vollständige Hemmung der DEET-vermittelten Neuroexcitation, aber nicht, dass der Propoxur, die deutlichen Anzeichen dafür, dass DEET mehr vorgesehen Das Octopaminergic System als AChE26wahrscheinlich beeinträchtigt. Diese veröffentlichten Datensätze markieren Sie die Vielzahl von Hypothesen und experimentellen Bedingungen, die mit dieser Methode untersucht werden können.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Wir möchten danken Frau Rui Chen für die Dissektion und Bilder von Drosophila CNS in den Abbildungen dargestellt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila melanogaster (strain OR) | Bloomington Drosophila Stock Center | 2376 | |
| Vibration isolation table | Kinetic Systems | 9200 series | |
| Faraday Cage | Kinetic Systems | N/A | |
| Dissecting Microscope on a Boom | Nikon | SMZ800N | Multiple scopes can be used; boom stand is critical |
| AC/DC differential amplifier | ADInstruments | AM3000H | The model 1700 can be used instead of the model 3000 |
| audio monitor | ADInstruments | AM3300 | |
| Hum Bug Noise Eliminator | A-M Systems | 726300 | |
| Data Acquisition System (PowerLab) | ADInstruments | PL3504 | Multiple PowerLab models can be used. |
| Lab Chart Pro Software | ADInstruments | N/A - Online Download | |
| Fiber Optic Lights | Edmund Optics | 89-740 | Different light sources can be used, but fiber optics are the most adaptable |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | M325 | |
| Microelectrode Holder | World Precision Instruments | MEH715 | Different models are acceptable |
| BNC cables | World Precision Instruments | multiple based on size | |
| Glass Capillaries | World Precision Instruments | PG52151-4 | |
| Microelectrode Puller | Sutter Instruments | P-1000 | Also can use Narashige PC-100 |
| Black Wax | Carolina Biological Supply | 974228 | |
| Non-coated insect pins, size #2 | Bioquip | 1208S2 | |
| Fince Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-03 |
References
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