Summary
السلوك حراسة رفيقه دوراً هاما في مجال الإنجاب الكانفاس المدية من جنس تيجريوبوس. ومع ذلك، لم تكن أساليب لدراسة هذا السلوك وصفاً جيدا. هنا يصف لنا طرق: 1) الفردية ثقافة العذراء تيجريوبوس الحيوانات و 2) التحليل الكمي لسلوكهم حراسة رفيقه.
Abstract
الكانفاس جنس تيجريوبوس، وهي العوالق الحيوانية المشتركة في برك المد والجزر الصخرية، إظهار سلوك حراسة ماتي بريكوبولاتوري حيث ذكر إقفال رفيقه محتملة لتشكيل زوج. في حين أن هذه الظاهرة قد جذبت اهتمام الباحثين، لم تكن أساليب للتحليل وصفاً جيدا. هنا يمكننا وصف إجراءات: استزراع 1) الفردية والتدريج تيجريوبوس الأحداث والبالغين، وتحليل سلوكهم حراسة رفيقه 2) القائم على الفيديو. طريقة تثقيف يمكن التحكم التجريبية للتقشير خبرة الحيوانات، فضلا عن القدرة على تتبع تطورها قبل الاختبارات السلوكية. يسمح أسلوب تحليل التقييم الكمي لعدة جوانب من السلوك حراسة ماتي، بما في ذلك الاستيلاء على محاولات من جانب الذكور والسباحة مسار من حراسة ورفيقه أزواج. على الرغم من أن هذه الأساليب قد أنشئت أساسا للدراسات اثولوجيكال في تيجريوبوس، مع إجراء التعديلات المناسبة يمكن أيضا تطبيقها على دراسات العوالق الأخرى في المجالات البحثية المختلفة، مثل علم وظائف الأعضاء، علم السموم، والإيكولوجية علم الوراثة.
Introduction
الكانفاس المدية من جنس تيجريوبوس توزع على نطاق واسع في برك المد العالية الصخرية عبر عدة قارات1. هذه الكانفاس يحمل رفيقه حراسة السلوك كجزء من تكاثرها، حيث ذكر بالغ يلتقط رفيقه محتملة (الأحداث أو الكبار) الاستفادة هوائيات أول مدمن مخدرات قبل الجماع(الشكل 1 و الشكل 2)2 3، ،،من45. ورغم أن هذه الظاهرة كانت موضوعا لدراسات اثولوجيكال والبيوكيميائية لعقود2،3،،من67، إجراءات مفصلة لإجراء دراسات لهذا السلوك، بما في ذلك لم تكن الثقافة الفردية للحيوانات العذراء والمعايير السلوكية الأحداث ينظر في محاولة حراسة رفيقه، وصفاً جيدا. وهكذا، هنا نقوم بإنشاء طرق لتمكين الدراسات المتعلقة السلوك في ظل بيئة تجريبية تسيطر عليها.
استزراع الفردية والتدريج من الحيوانات
الدراسات السابقة لاستنساخ تيجريوبوس المستخدمة تقليديا زوج فصل أسلوب إعداد الأحداث (كوبيبوديدس) والإناث البالغات للاختبارات السلوكية وتربية تجارب3،8،9 ،10. ومع ذلك، هذا الأسلوب يسمح الحيوانات على شكل أزواج، ويحتمل أن تكون جامع قبل الاختبارات (نوقشت في عام 1988 إيتو11)، التي قد تغير من الخصائص السلوكية للحيوانات5. وبالإضافة إلى ذلك، هناك أيضا إمكانية نخطئ مراحل النمو من الأرجل مع البروتوكولات التقليدية كما أنها تعتمد على حجم الجسم الظاهر التدريج. في هذه الورقة، ويصف لنا طريقة تثقيف فردية المستخدمة في دراستنا الأخيرة مع الكاليفورني تيجريوبوس5، الذي صمم لمعالجة هذه القيود عن طريق التحكم في تجربة الأقران للحيوانات وتتبع تطورها من كوبيبوديد إلى مراحل الكبار.
التحليل الكمي للسلوك حراسة ماتي
ودرست سلوك حراسة ماتي تيجريوبوس الأنواع ليس فقط في مجال الأخلاقيات2،6 ولكن أيضا في مجالات أخرى مثل علم السموم الإيكولوجية وعلم الوراثة التطوري3،4، 7 , 8 , 9 , 10-ومع ذلك، أوضحت الدراسات السابقة مسار هذا السلوك أساسا في كتب النماذج دون الرسوم التوضيحية المرئية كافية لتحديد السلوك والأساليب دراستها، مما يخلق عقبات تقنية النسخ المتماثل، والنهوض بالدراسات. هنا، نحن نقدم وصفاً مفصلاً لبعض الأحداث الرئيسية في سلوك حراسة ماتي الكانفاس تيجريوبوس تدعمها المواد البصرية. كما نبدي معدات وأساليب للتحليل الكمي للسلوك. تسمح هذه الطرق تقييم الخصائص السلوكية للحيوانات أثناء محاولات حراسة رفيقه في دقة التجارب المنسوخة نسخاً متماثلاً.
مع هذه الأساليب ونحن نهدف إلى توفير أساس منهجية للدراسات التي تسيطر عليها واستنساخه على سلوك رفيقه حراسة من جنس تيجريوبوس.
Protocol
1. إعداد الحيوانات العذراء للمراقبة السلوكية
- الحصول على البيض المخصب والسماح لهم بفتحه.
- جمع الإناث جرابيد تحمل البيض البرتقال واضح (أي، المخصبة، وفي مراحل متقدمة من التنمية) (الشكل 3) من ثقافة أسهم مع ماصة باستور. شطف الإناث بلطف بيبيتينج لهم في مستنبت نظيفة لتجنب نقل الحيوانات الأخرى، بما في ذلك نوبليال التي قد تكون دبرت اليرقات في الثقافة.
ملاحظة: يستخدم مياه البحر الاصطناعي مع ملوحة نسبة 35% في هذا البروتوكول، كالمتوسطة الثقافة. استخدام الوسيلة مختلفة (مثل مياه البحر الاصطناعي مع ملوحة أعلى أو المذاب إضافية) استناداً إلى الغرض من التجربة.
ملاحظة: انظر باريتو et al. عام 201512 طريقة لإنشاء مختبر الثقافة مخزونات وبيريرا et al. عام 201613 للحصول على أمثلة لمواقع تجميع السكان الطبيعية من الكاليفورني ت.. كما أفادت بيترسون وآخرون مواقعهم جمع الكاليفورني ت.و فولفوس ت. ت. japonicus مع معلومات الطول والعرض9. استخدام الماصات البلاستيكية بسعة حوالي 30-50 مل لجمع الكانفاس تيجريوبوس من تجمعات الصخور. - ضع كل أنثى منفردة في بئر صفيحة ثقافة الخلية 6-جيدا مع نظيفة الثقافة المتوسطة (الشكل 4من اليسار). تأكد من أن لا من الحيوانات الأخرى (بما في ذلك يرقة نوبليال) هو تلويث البئر.
- الحفاظ على اللوحات في حاضنة تعيين عند 20 درجة مئوية مع دورة الضوء الظلام 12 ساعة الثقافة الإناث حتى الإفراج عن الأكياس البيض. وتحيط هذه الخطوة عموما واحد إلى عشرة أيام حسب الأنواع ومراحل نمو الأجنة. ومن ناحية أخرى، تغذية كل أنثى جرابيد مرتين في أسبوع مع اثنين من الحبوب من ناعما الأرض (حوالي < 0.5 ملم في القطر) الأسماك الغذاء (انظر الجدول للمواد للحصول على التفاصيل).
ملاحظة: استخدام درجات حرارة مختلفة ودورات الخفيفة حسب الغرض من التجربة. ارتفاع درجات الحرارة يمكن أن يسهل التطور السريع أكثر من الأجنة.
ملاحظة: تجنب ترك فائض الغذاء المتحللة في الآبار. إذا كان بقايا الطعام يبدأ في الاضمحلال، "الماصة؛" من الآبار مع ماصة باستور. - بعد أن يتم الإفراج عن الأكياس البيض، إزالة الإناث من آبار الثقافة مع ماصة باستور.
ملاحظة: تلقح الإناث القادرة على التناسل براثن متعددة من ذرية2،3. إذا لزم الأمر، نقل الإناث إلى آبار أخرى لجمع المزيد من براثن.
- جمع الإناث جرابيد تحمل البيض البرتقال واضح (أي، المخصبة، وفي مراحل متقدمة من التنمية) (الشكل 3) من ثقافة أسهم مع ماصة باستور. شطف الإناث بلطف بيبيتينج لهم في مستنبت نظيفة لتجنب نقل الحيوانات الأخرى، بما في ذلك نوبليال التي قد تكون دبرت اليرقات في الثقافة.
- جمع كوبيبوديدس للثقافة الفردية.
- تبقى اللوحات مع النوبليوس مظلل في الحاضنة والثقافة الوظيفة حتى تطورها إلى كوبيبوديد (CI) المرحلة الأولى (الشكل 4والأوسط). وتحيط هذه الخطوة عادة من أسبوع إلى أسبوعين. تغذية كل منهما جيدا مع العديد من الحبوب من الأرض ناعما الأسماك الغذاء أثناء البحث عن الحيوانات CI مرة كل يومين. إعادة ملء تبخر المياه تربية مع الماء المقطر.
ملاحظة: إذا كان يعيق الحطام العائم الرأي، المقشود مع قطعة صغيرة من منشفة ورقية. - أقرب الحيوانات CI تبدأ في الظهور، جمع لهم من الآبار مع ميكروبيبيتي P-10 مع حجمه بيبيتينج في حوالي الساعة 8 ميليلتر، تحت ستيريوميكروسكوبي في 10 X إلى 40 X التكبير (الشكل 4، حق). تغسل كل الحيوانات CI بلطف بيبيتينج أنه في مياه نظيفة مصطنعة ووضعه في بئر لوحة الثقافة 24-جيدا خلية تحتوي على عمق 2-3 مم (حوالي 400-600 ميليلتر) من مياه البحر الاصطناعي.
ملاحظة: تجنب تحمل أكثر من اكسوفياي نوبليال أو غيرها من الحيوانات في الآبار للثقافة الفردية.
- تبقى اللوحات مع النوبليوس مظلل في الحاضنة والثقافة الوظيفة حتى تطورها إلى كوبيبوديد (CI) المرحلة الأولى (الشكل 4والأوسط). وتحيط هذه الخطوة عادة من أسبوع إلى أسبوعين. تغذية كل منهما جيدا مع العديد من الحبوب من الأرض ناعما الأسماك الغذاء أثناء البحث عن الحيوانات CI مرة كل يومين. إعادة ملء تبخر المياه تربية مع الماء المقطر.
- مسار التنمية للأفراد عن طريق العد مولتيد اكسوفياي.
- بحث داخل كل بئر اكسوفياي مولتيد كل يومين أو ثلاثة أيام (ضبط تردد إذا لزم الأمر) بمراقبة ستيريوميكروسكوبيك تحت إضاءة الظلام-ميدان الساعة 10 X إلى 40 X التكبير. اكسوفياي كوبيبوديدس تتسم بالشفافية ويمكن التعرف عليها مع الساقين تشكيكا، وزوج من رامي والذيلية (أي، رقيقة بارزة هياكل في نهاية والذيلية)، و/أو تجزئة بروسومي وأوروسومي (الشكل 5). تغيير التركيز والإضاءة للكشف عن اكسوفياي في أعماق مختلفة في بئر (الشكل 6A).
ملاحظة: اكسوفياي مولتيد أصغر من الحيوان الذي قد مولتيد لهم. بدء الفحص من التكبير السفلي لحيوان واكسوفياي حديثة نسبيا والتحول إلى أعلى التكبير لكبار السن اكسوفياي (أي، أصغر).
ملاحظة: في حالة تلف اكسوفياي في بئر، القضاء على البئر من زيادة التنموية تتبع لتجنب سوء التقدير مراحل النمو.
ملاحظة: إذا كان يعيق الحطام العائم الرأي (الشكل 6B)، خالي الدسم مع قطعة صغيرة من منشفة ورقية. - سجل عدد إجمالي من اكسوفياي كوبيبوديد في كل بئر بعلامة رصيده على غطاء لوحة (الشكل 7). إضافة خط لوضع علامة كما تم العثور على اكسوفياي جديدة في البئر.
ملاحظة: إذا كان هناك نوبليال اكسوفياي الملوثة في البئر، والقضاء عليها من العد. - إطعام كل فرد مع اثنين من الحبوب من الأرض ناعما الأسماك الغذاء. إعادة ملء تبخر المياه تربية مع الماء المقطر الاحتفاظ الملوحة.
ملاحظة: آر كوبيبوديدس كل يومين أو ثلاثة أيام لمنعهم من المستهلكة وإتلاف اكسوفياي مولتيد، التي يمكن أن تؤثر في احتمال تقدير المرحلة الإنمائية (الخطوة 1.3.4). - تقدير المرحلة الإنمائية من الحيوان على أساس العدد اكسوفياي. إذا لم يكن هناك لا اكسوفياي، يقدر الفرد بمرحلة CI. إذا كان هناك اكسوفياي واحد إلى أربعة، والفرد يقدر يكون في الاتحاد إلى مراحل السيرة الذاتية. إذا كان هناك خمسة اكسوفياي، يقدر الفرد أن يكون راشدا.
- بحث داخل كل بئر اكسوفياي مولتيد كل يومين أو ثلاثة أيام (ضبط تردد إذا لزم الأمر) بمراقبة ستيريوميكروسكوبيك تحت إضاءة الظلام-ميدان الساعة 10 X إلى 40 X التكبير. اكسوفياي كوبيبوديدس تتسم بالشفافية ويمكن التعرف عليها مع الساقين تشكيكا، وزوج من رامي والذيلية (أي، رقيقة بارزة هياكل في نهاية والذيلية)، و/أو تجزئة بروسومي وأوروسومي (الشكل 5). تغيير التركيز والإضاءة للكشف عن اكسوفياي في أعماق مختلفة في بئر (الشكل 6A).
- تحديد الجنس للبالغين استناداً إلى مورفولوجيا.
- الجنس الحيوانات بدراسة مورفولوجية بهم. تيجريوبوس من الذكور تمتلك هوائيات الأول يتناول مع هياكل مدمن مخدرات وكروي في النهاية البعيدة (الشكل 3A). الإناث البالغات تمتلك هوائيات أنعم وأرق نسبيا الأولى (الشكل 3B) من تلك التي للذكور. كما يحمل بعض الإناث داكنة اللون الأخضر من الدهن جوندال في أجسادهم (الشكل 3B، 3D).
- وضع علامة على نوع الجنس على غطاء البئر (الشكل 7).
2-الاختبار السلوكية وتسجيل فيديو للسلوك حراسة ماتي
- في يوم اختبار، وحدد الحيوانات للمرحلة المطلوبة ونوع الجنس لاختبار سلوكية.
- تغذية أفراد مختارين في آبار الثقافة مع الأغذية السمكية الأرض ناعما والسماح لهم بتناول الطعام لمدة 30 دقيقة. وفي الوقت نفسه، تابع إلى الخطوة 2.1.2 بإعداد اختبار الدوائر.
- تعد الخلية أسفل شقة 48-جيدا هما الثقافة لوحات كاختبار الدوائر؛ لوح واحد (وتسمى فيما يلي "لوحة A") للذكور وأخرى ("لوح ب") لأهداف (مثل كوبيبوديدس، الكبار من الإناث والذكور البالغين). إضافة 400 ميليلتر من مياه نظيفة الاصطناعية مع ملوحة نسبة 35% في آبار اللوحات. وضع اللوحات على منصة خفيفة الصمام مغطاة مجلس اكريليك شفافة الناشر ضوء (الشكل 8).
ملاحظة: استخدم المتوسطة مختلفة اعتماداً غرض تجربة.
ملاحظة: لتجنب الحرارة الزائدة، لا تستخدم المصابيح المتوهجة أو الفلورسنت كالإضاءة خلفية. - بعد 30 دقيقة وقت التغذية الموصوفة في 2.1.1، شطف كل الحيوانات بلطف بيبيتينج أنه في سلسلة من أربعة آبار لصفيحة 24-بئر مليئة بمياه نظيفة الاصطناعية (الشكل 9) لمنع ترحيل الأنقاض واكسوفياي من آبار الثقافة.
- وضع الأفراد مشطوف في آبار لوحات A و B على لوح الصمام الخفيفة. السماح لمدة 30 دقيقة لتكيف الحيوانات للآبار.
- تعيين كاميرا الفيديو أعلاه لوحة A خلال فترة التكيف (الشكل 8). استخدام ترايبود أو موقفا لعقد الكاميرا.
- وتركز الكاميرا على الذكور داخل طبق أ للسماح اقبة هوائيات.
ملاحظة: إلى تقليل وميض الإضاءة الخلفية في الأفلام، تعيين معدل إطار يساوي أو نصف التردد الكهربائي واستخدام وقت تعرض أطول. أيضا، تبقى لوحة المفاتيح الضوء LED مغطاة مجلس اكريليك شفافة كما هو موضح في الخطوة 2.1.2.
- بعد الفترة من التكيف هو موضح في الخطوة 2.1.4، بدء تسجيل الفيديو واختبار سلوكية.
- نقل الأهداف من لوحة ب إلى لوحة أ مع ماصة باستور. إذا كانت التجربة حساسة للمكونات الكيميائية في المتوسط، تغيير الماصات لكل زوج من الاختبار.
ملاحظة: عندما بيبيتينج حيوان من لوحة ب، لا مطاردة في المياه مع ماصة باستور اضطراب المياه يمكن أن تحفز الحيوان وتحظى به الحركة الزائدة. عقد تلميح من ماصة قليلاً فوق سطح الماء والانتظار للفرد لتأتي أسفل الحافة. بلطف "الماصة؛" فإنه حتى مع كمية صغيرة من مياه البحر الاصطناعي وثم إخراجها في بئر في لوحة أ - وفقا لخطة تجريبية، السماح للذكور، وهدفا للتفاعل في كل بئر لفترة المرجوة من وقت الملاحظة (مثلاً 10 دقائق) بعد النقل.
- إيقاف تسجيل الفيديو بعد وقت الملاحظة. إذا لزم الأمر، تحميل الأفلام المسجلة من الكاميرا إلى كمبيوتر.
- نقل الأهداف من لوحة ب إلى لوحة أ مع ماصة باستور. إذا كانت التجربة حساسة للمكونات الكيميائية في المتوسط، تغيير الماصات لكل زوج من الاختبار.
3-دليل تحليل الخصائص السلوكية
- فحص الفيلم للتوقيت عندما نقلت كل هدف في البئر في لوحة أ
- دراسة البدء وتوقيت الإنهاء من الأحداث ذات الأهمية وحساب مدة والكمون، وتواتر الأحداث.
- تعريف الشروع في محاولة حراسة من جانب الذكور كجهة اتصال للهوائي للذكور مع أي جزء من الجسم الهدف (الشكل 10، أعلى اليسار). كثيرا ما يسبق الاتصال باللوامس سريعة (< 0.5 s) مطاردة أو الانقضاض.
- تعريف إنهاء محاولة حراسة كنقطة عند فصل هوائيات كلا من الذكور من الجسم الهدف (الشكل 10، أعلى اليمين). حساب تكرار محاولات كحراسة:
- تعريف الشروع في الجماع بمنحنى جسم الظهرية من الذكور التي تبعتها تكرار الضغط أوروسومي مقارنة بالإناث (الشكل 10، أسفل اليمين). تواتر الضغط عدة مرات في الثانية الواحدة.
ملاحظة: ذكر حراسة يزحف وصولاً إلى نهاية والذيلية للهيئة للأنثى قبل الجماع (الشكل 10، أسفل اليسار). - تعريف إنهاء الجماع بمفرزة من أوروسوميس بعد الأحداث التي وصفها في 3.2.4.
ملاحظة: يأخذ الجماع عموما المكان لعدة دقائق في حالات الكاليفورني ت. و . ت. japonicus.
4-الأبعاد تتبع الأفراد والأزواج
- إنشاء مقطع فيديو يضم حلقة فائدة (مثلاً 3 أول ق من محاولة حراسة) تقليم الفيلم المسجلة في الخطوة 2 باستخدام برنامج تحرير الفيلم.
- تثبيت إيماجيج14 من: https://imagej.nih.gov/ij/download.html. ثم قم بتحميل متراكج، تتبع الحركة البرنامج المساعد إيماجيج15، اتباع الإرشادات على: https://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/.
- فتح إيماجيج واستيراد فيلم للفائدة (مثلاً، ملف > استيراد > "استخدام كويك تايم"؛ اختر "تحويل 8 بت تدرج الرمادي" لتقليل الذاكرة المطلوبة لمعالجة الصور).
- إجراء المعايرة المكانية والزمنية.
- حدد أداة "التحديد خط مستقيم" في إطار إيماجيج لمعايرة المكانية.
- رسم خط تحديد على طول كائن بطول معروفة (مثل قطره من بئر) في إطار الفيلم.
- فتح القائمة "ضبط مقياس" (تحليل > ضبط مقياس). أدخل طول المعروفة في مربع "معروف عن بعد" وبه وحدة (مثلاً مم) في مربع "وحدة طول". انقر فوق خانة الاختيار "العالمي" لاستخدام المقياس لمقاطع الفيديو الأخرى.
- فتح القائمة "خصائص" (صورة > خصائص) لمعايرة الوقت. أدخل الفاصل الزمني للإطار (المعاملة بالمثل لمعدل الإطارات) في مربع "الفاصل الزمني للإطار".
- تكوين تتبع مع متراكج.
- فتح البرنامج المساعد متراكج من الإضافات > متراكج في إيماجيج. انقر فوق الزر "متابعة" في إطار الحوار متراكج لفتح تعقب قائمة التكوين.
- تعيين فاصل زمني لتعقب عن طريق التحقق من "الانتقال إلى مؤشر الوقت القادم بعد إضافة نقطة" وإدخال رقم في مربع "الوقت خطوة الحجم" في إطار الحوار التكوين. لتنفيذ تتبع الإطار حسب الإطار، أدخل "1" في المربع "الوقت خطوة الحجم".
- تحقق من "تطبيق المؤشر المحلي العض أثناء تعقب" واختر "centroid الظلام" كميزة إضافية. يسمح هذا الخيار الكشف تلقائي عن centroid لكائن الظلام (أي، فرد أو زوج) ضمن كشف مربعة ("مجموعة الأدوات") حول مؤشر. اختر حجم من ساحة لتغطية كل زوج أو الحيوان في الفيلم (مثلاً 31 × 31 بكسل).
- انقر فوق "موافق" لتطبيق الخيارات المختارة.
- إجراء تتبع ثنائي الأبعاد.
- انقر فوق الزر "إضافة" في إطار الحوار متراكج لبدء تعقب.
- ضع رأس مؤشر (الكشف عن ساحة) لتغطية زوج أو فرد لتعقب. انقر فوق للكشف عن centroid الظلام الكائن داخل المربع.
- كرر الخطوة 4.6.2 لعدد المطلوب من الإطارات.
- لإنشاء جداول البيانات، انقر فوق زر "الإجراء" في إطار الحوار متراكج. يتم عرض البيانات في اثنين من النوافذ: نافذة "متراكج: المسارات" يعرض ملخصاً لتتبع مسار ثنائي الأبعاد ونقاط "متراكج:" يظهر بيانات تفصيلية لكل نقطة في الوقت. لحفظ كل جدول، اختر ملف > حفظ as... القائمة على إيماجيج.
ملاحظة: تشير إلى دليل على الإنترنت يقدم المطور (https://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/manual/) للحصول على وصف لكل عمود من البيانات. - لإنشاء فيلم مع مسار متعقبة رسم كخط ملونة، انقر فوق الزر "فيلم" في إطار الحوار متراكج. لحفظ الفيلم الذي تم إنشاؤه، اختر ملف > حفظ as... القائمة على إيماجيج.
- حفظ النتيجة كاملة. انقر فوق الزر "حفظ" في إطار الحوار متراكج حفظ النتائج بما في ذلك البيانات (الخطوة 4.6.4) وتتبع مسار ثنائي الأبعاد (الخطوات 4.6.2 و 4.6.3).
Representative Results
الطريقة تثقيف الفردية الموضحة في الخطوة 1 يسمح إعداد والتدريج من الحيوانات العذراء مع عدم وجود خبرة سابقة من الأقران.
يسمح اختبار سلوكية الموضحة في الخطوة 2 تسجيل الفيديو ومراقبة سلوك حراسة ماتي الكانفاس تيجريوبوس . فحص التالية لتسجيل الفيديو مع الأساليب الموصوفة في الخطوتين 3 و 4 يمكن التحليل الكمي لعدة جوانب من السلوك هو موضح في الشكل 1.
ويبين الشكل 11 فرق في متوسط مدة حراسة محاولات بين الأزواج الذكور والإناث والذكور الذكور أزواج الكاليفورني ت.. أظهر تحليل دليل أن الأزواج الذكور الذكور أظهرت مدة أقصر نسبيا من زوج من أزواج الذكور والإناث.
وترد أمثلة للمسارات التي تتبعها مع أسلوب التحليل في الشكل 12 وممثل نتيجة تحليل السرعة ويرد في الشكل 13. تتبع ثنائي الأبعاد المكانية من أزواج حراسة المنشأة حديثا من الكاليفورني ت. كشفت عن أن الأزواج الذكور الذكور تميل إلى إظهار السرعة الأعلى من الأزواج الذكور والإناث في ال 3 الأولى s لحراسة محاولات.
الشكل 1: السلوك حراسة رفيقه في تيجريوبوس- (أ) ذكر بالغ قبض الأحداث (كوبيبوديد) مع هوائيات الأول (المشار إليها بالأسهم الزرقاء). بار = 1- (ب) مخططا لحراسة رفيقه السلوك. رجل يحاول القبض فرد المستهدف (يسار) ويشكل زوج معها (الأوسط). في أزواج الذكور الذكور وبعض الأزواج الذكور والإناث، ينتهي بمحاولة حراسة دون الجماع. لقد تم تعديل هذا الرقم من تسوبوكو-إيشي و 2017 بيرتون5. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2: مراحل النمو من تيجريوبوس- عموما تخضع الأنواع تيجريوبوس ست مراحل nauplius (من ني لنفي) وخمس مراحل كوبيبوديد (من كاريتاس الدولية للسيرة الذاتية) ومرحلة الكبار (السيدا)16. الذكور إجراء محاولات حراسة للأحداث من مرحلة مبكرة من كوبيبوديدس (CI في6، ت. japonicus و فولفوس ت.17 )، والاتحاد في كاليفورنيكو ت.ق3، وكذلك للبالغين من كلا الجنسين5 . لقد تم تعديل هذا الرقم من تسوبوكو-إيشي و 2017 بيرتون5. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: مورفولوجية الكبار (الكاليفورني ت.)- (أ) الذكور البالغين. (ب) أنثى راشدة. (ج) أنثى راشدة Gravid مع كيس البيض مع البيض المخصبة والمتقدمة (برتقالي واضح). (د) جرابيد أنثى راشدة مع كيس البويضة المخصبة أو متخلفة (أخضر داكن) البيض. تشير الأسهم إلى الأكياس البيض. بار = 1 مم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: مخطط تفصيلي للتحضير للثقافة الفردية- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 5: مولتيد اكسوفياي- (أ) اكسوفياي من كاريتاس الدولية لمراحل السيرة الذاتية حيوان واحد من الكاليفورني ت. بار = 1- (ب) مراحل اكسوفياي من كاريتاس الدولية للسيرة الذاتية بالثقافة فردية أيضا. الحطام الأبيض براز حيوان مثقف في البئر (لا يظهر في الصورة). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 6: البحث عن اكسوفياي تحت ستيريوميكروسكوبي. أشرطة = 1 مم. (أ) تنسيق التغيير من ستيريوميكروسكوبي للكشف عن اكسوفياي في أعماق مختلفة. تشير الأسهم الأرجواني إلى اكسوفياي مركزة وتشير الأسهم الرمادية إلى اكسوفياي غير مركزة. الصورة العليا يركز على اكسوفياي اليسرى، والغارق في أسفل البئر. أسفل الصورة يركز على اكسوفياي الحق، الذي هو العائمة تحت سطح المتوسطة. (ب) الصورة العليا يبين مثالاً لعرقلة فحص الحطام تطفو على السطح المتوسطة. سهم أخضر يشير إلى اكسوفياي مخبأة تحت الأنقاض. يظهر أسفل الصورة نتيجة للسطح التنظيف مع قطعة صغيرة من منشفة ورقية. اكسوفياي (المشار إليها سهم أخضر) مرئياً بعد التنظيف. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 7: التجهيز والتلاعب من الحيوانات- أمثلة على كيفية وضع علامة لعدد من اكسوفياي والجنس من الحيوانات على غطاء للوحة الثقافة. (أ) مثال لبئر الذي يحتوي على خمسة اكسوفياي وحيوان الكبار. عدد الأسطر في علامة رصيده على الغطاء يمثل عدد اكسوفياي وجدت في البئر. عندما يصل عدد اكسوفياي إلى خمسة، يمكن تحديد جنس الحيوان استناداً إلى مورفولوجيا هوائيات (انظر الشكل 3). (ب) مثال عن غطاء ملحوظ للوحة الثقافة. تحتوي الصفوف الأعلى على كبار السن (العاجي للكبار) الحيوانات وتحتوي الصفوف أسفل الأصغر سنا (أي، التي جمعت حديثا) الحيوانات (CI إلى سيي). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 8: نظام اختبار سلوكية. الإعداد لتسجيل فيديو لحراسة رفيقه السلوك (يسار) وموجز لاختبار سلوكية (يمين). لقد تم تعديل هذا الرقم من تسوبوكو-إيشي و 2017 بيرتون5. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 9: شطف حيوانات قبل test. سلوكية الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 10: تعريف الأحداث التي درست في التحليل اليدوي. الرسوم التوضيحية للأحداث يلاحظ فيما يتعلق بمحاولة حراسة رفيقه. وترد أسماء الأحداث تعريفها وتحليلها في الخطوة 3. لا يمكن ملاحظة الأحداث محاطة بخط منقط في بعض المحاولات حراسة رفيقه. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 11: الفرق في حراسة المدة بين الأزواج الذكور والإناث والذكور الذكور أزواج الكاليفورني ت. ويمثل كل رمز المثلث البيانات من زوج اختبار واحد. أشرطة وشعيرات تمثل المتوسطات ونطاق المجال على التوالي. وكان متوسط مدة التقاط أكبر لأزواج من الذكور والإناث (الذكور والإناث (ن = 22)، والذكور الذكور (ن = 29)؛ * *ف < 0.01 باختبار مان-ويتني U). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 12: مسارات لأزواج في أول الثلاث ثوان لحراسة محاولات. أمثلة على مسارات ثنائية الأبعاد المتعقبة للأزواج الذكور والإناث (يسار) وأزواج الذكور الذكور (يمين) الكاليفورني ت.. وتمثل النقاط على المسارات النقاط الزمنية (30 لقطة في الثانية الواحدة). أشرطة = 10 مم- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 13: الفرق في متوسط السرعة بعد الشروع في حراسة بين الأزواج الذكور والإناث والذكور الذكور أزواج الكاليفورني ت. ويمثل كل رمز المثلث البيانات من زوج اختبار واحد. أشرطة وشعيرات تمثل المتوسطات ونطاق المجال على التوالي. متوسط سرعة الزوج في ال 3 الأولى s لحراسة محاولات كان أكبر بالنسبة للأزواج الذكور الذكور (الذكور والإناث (ن = 13)، والذكور الذكور (ن = 35). * * *ف < 0.001 باختبار مان-ويتني U). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
تكميلية الشكل 1: أثر الشطف العلاج على سلوك تيجريوبوس. يمثل كل رمز دائرة أو مثلث البيانات من الأفراد المختبرة أو زوج واحد. أشرطة وشعيرات تمثل المتوسطات ونطاق المجال على التوالي. الأفراد في "مشطوف" ومجموعات "لا تشطف" تعامل بنفس الطريقة، إلا أن المجموعة "لا تشطف" لم تشهد معاملة الشطف (الخطوة 2.1.3) قبل وقت التعديل 30 دقيقة (الخطوة 2.1.4). (أ) متوسط السرعة من الذكور مشطوف تميل إلى أن تكون أكبر من الذكور غير مشطوف (تشطف (n = 6)، غير مشطوف (n = 6)، نوفاسكوتيا: لا يوجد فرق كبير كان كشفتها يو مان-ويتني اختبار). وتم قياس السرعة 30 s استناداً إلى أشرطة الفيديو المسجلة بعد وقت التعديل. (ب) متوسط السرعة للإناث مشطوف تميل إلى أن تكون أكبر من الإناث غير مشطوف (تشطف (n = 6)، وليس مشطوف (n = 6)، نوفاسكوتيا: لا يوجد فرق كبير كان كشفتها يو مان-ويتني اختبار). وتم قياس السرعة 30 s استناداً إلى أشرطة الفيديو المسجلة بعد وقت التعديل، بعد الخطوة 4 (تتبع الفاصل الزمني = 0.5 s). (ج) كان التردد لحراسة محاولات أكبر لأزواج من الأفراد مشطوف (تشطف (n = 6)، غير مشطوف (n = 6). * * ف < 0.01 باختبار مان-ويتني U). (د) مدة الحراسة محاولات تميل إلى أن تكون أكبر بالنسبة لأزواج من الأفراد مشطوف (تشطف (n = 6)، وليس مشطوف (n = 6)، نوفاسكوتيا: لا يوجد فرق كبير كان كشفتها يو مان-ويتني اختبار). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Discussion
استزراع الفردية وتحديد المرحلة والجنس
هنا يمكننا وصف الطريقة المستخدمة في أعمالنا السابقة دراسة5 إعداد العذراء تيجريوبوس الحيوانات مع خبرتهم الأقران يسيطر حين تتبع تطورها (رقم 4 و رقم 7). كما تستخدم الأنواع تيجريوبوس كالحيوانات النموذجية في مختلف المجالات البيولوجية مثل علم السموم16،18، الفسيولوجيا البيئية19،،من2021، والتطوري الوراثة13،22،،من2324، إمكانات هذا الأسلوب لتوفير وسيلة قيمة لتقييم تأثير العوامل البيئية والوراثية في دورة حياة هذه الأرجل.
لتحقيق الانطلاق الناجح والبحث العادية وجمع CI كوبيبوديدس من ثقافة جماعية (الخطوة 1، 2) أمر بالغ الأهمية، كما جمع في مراحل لاحقة قد يؤدي سوء التدريج الحيوانات. وباﻹضافة إلى ذلك، بحث شامل عن اكسوفياي (الخطوة 1.3) ضروري أيضا التدريج دقيقة. زيادة تواتر جمع والتدريج إذا لزم الأمر، كما يختلف الفاصل بين مولتس من يوم واحد إلى عدة أيام تبعاً للأنواع وتربية الشرط2،،من2526. الاختلافات بين كوبيبوديدس والإناث البالغات في مورفولوجيا هوائيات ليست كبيرة واضح في بعض الأنواع والسكان من تيجريوبوس16،25. ومن ثم التدريج قبل sexing مفيدة التمييز بين الإناث البالغات من كوبيبوديدس متقدمة من أي من الجنسين.
الاختبارات السلوكية ودليل تحليل الخصائص السلوكية
وبوجه عام، واحدة من أهم أجزاء من دراسات اثولوجيكال هو تعريف ووصف للأحداث ذات الأهمية. طرق عرض في هذه الورقة أولاً وضعت لنا الدراسة الأخيرة5 وتستكمل مع وصف الجماع والمعينات البصرية (الشكل 10). وبالإضافة إلى ذلك، الاتساق في التعامل مع الحيوانات أيضا دوراً هاما في التجارب السلوكية. على سبيل المثال، الشطف من الأرجل قد يحتمل أن تيسر بعض جوانب سلوكهم (تكميلية الشكل 1) ولذلك من المستحسن يجب القيام بها بطريقة متسقة بين العينات، مثل النظام الموحد في خطوة 2.1.3. أننا نتوقع من المواد المقدمة في هذه الورقة سوف تساعد الدراسات التي تسيطر عليها واستنساخه في سلوك حراسة ماتي تيجريوبوس، تشجيع الدراسات الإنجابية والإيكولوجية لهذا ساكن وفيرة في برك المد العالي.
حد ممكن واحد مع هذا الأسلوب تضخم منخفضة للصور التي تم الحصول عليها. على الرغم من أن الأفلام المسجلة مع نظامنا يسمح تحديد هياكل هيئة بارزة بما في ذلك أوروسوميس وهوائيات أول الذكور، واحد قد لا قادراً على مراقبة هياكل خفية أكثر مثل الساقين، والأعضاء التناسلية مع أسلوب لدينا نظراً لأنها لا تستخدم التكبير المجهري لتسجيل الفيديو. في حين أفادت كيلي وآخرون أنها قادرة على مراقبة سبيرماتوفوري نقل من الذكور إلى الإناث من japonicus ت تحت ملاحظة مجهرية في 100 X التكبير (لا الفيديو المسجل)7، ونحن لم تكن قادرة على مراقبة سبيرماتوفوري في الأفلام لدينا، ربما بسبب الحد دقة وضوح الصورة.
تتبع ثنائي الأبعاد لأزواج
على الرغم من أن هذا الأسلوب لا يسمح بتتبع ثلاثي الأبعاد للحيوانات، يمكن تحليل مسار ثنائي الأبعاد من العوالق الحيوانية دون كيميائيا وسم الحيوانات (cf. شحم الخنزير وآخرون 201027) عن طريق استخدام البرامج التي توزع مجاناً. إذا كان حجم ملف الفيلم كبير جداً بحيث تتم معالجتها في إيماجيج، يمكن للمرء تقليل دقة الملف وتحويله إلى فيلم تدرج رمادي. بينما وصف الطريقة التي وضعت أصلاً للكبار أزواج الكاليفورني ت. (رقم 12 و رقم 13)، كما أنها متاحة لأزواج الأحداث الكبار والأفراد واحد (تكميلية الشكل 1) كما فضلا عن غيرها من الأنواع تيجريوبوس من حيث المبدأ. ونتوقع كذلك الأسلوب الذي يتم تحليل المسار تنطبق على المدى القصير (من ميلي ثانية إلى المقاييس الزمنية الثانية) من العوالق الحيوانية الأصناف الأخرى مع إجراء التعديلات المناسبة.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
يتم دعم هذا العمل من المنح المقدمة من مؤسسة سوميتومو، اليابان (منحة "مشاريع بحوث العلوم الأساسية" ومنح رقم: 150932) و "معهد أبحاث من اللافقريات البحرية"، اليابان (منحة بحثية فردية 2018) للأمراض المنقولة جنسياً و RSB، ومنحة من الولايات المتحدة مؤسسة العلوم الوطنية (ديب-1556466) إلى RSB. ونشكر السيدة عاشق الريم ميشيل وودوارد لردود الفعل على طريقة تثقيف والتدريج.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instant Ocean Sea Salt | Spectrum Brands. Inc. | SS1-160P | For preparation of culture medium |
| PRO PlecoWafers | Tetra | 16447 | Food for copepods (used after being ground in a mortar) |
| Flat bottom 6-well tissue culture plate with lid | Corning Co., Ltd. | 353224 | Container for culture of gravid females and hatched nauplii |
| Flat bottom 24-well cell culture plate with lid | Corning Co., Ltd. | 353226 | Container for individual culturing |
| Flat bottom 48-well cell culture plate with lid | Nest Biotechnology Co., Ltd. | 748001 | Behavioral observation chambers |
| LED light pad | Shenzhen Huion Animation Technology Co., Ltd. | Litup LP4 | Backlight for behavioral observation |
| Camera | Canon | 0591C003 (model: Rebel T6i) | For recording of behavior |
| Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-678-6A | For transfer of copepods |
| P10 micropipette tips | VWR | 613-0735 | For transfer of C1 stage copepodids |
| ImageJ | NIH | Version 1.49t | For semi-automatic analysis of movies |
| MTrackJ | Version 1.5.1 | ImageJ plugin for tracking developed by Dr. Erik Meijering (Biomedical Imaging Group Rotterdam, Erasmus University Medical Center, The Netherlands) |
References
- Chullasorn, S., Dahms, H. U., Klangsin, P. A new species of Tigriopus (Copepoda: Harpacticoida: Harpacticidae) from Thailand with a key to the species of the genus. Journal of Natural History. 47 (5-12), 427-447 (2013).
- Fraser, J. H. The occurrence, ecology and life history of Tigriopus fulvus (Fischer). Journal of the Marine Biological Association of the United Kingdom. 20 (3), 523-536 (1936).
- Burton, R. S. Mating system of the intertidal copepod Tigriopus californicus. Marine Biology. 86 (3), 247-252 (1985).
- Lazzaretto, I., Salvato, B., Libertini, A. Evidence of chemical signaling in Tigriopus fulvus (copepoda, harpacticoida). Crustaceana. 59 (2), 171-179 (1990).
- Tsuboko-Ishii, S., Burton, R. S. Sex-specific rejection in mate-guarding pair formation in the intertidal copepod, Tigriopus californicus. PLoS ONE. 12 (8), e0183758 (2017).
- Ito, T. The biology of a harpacticoid copepod, Tigriopus japonicus Mori. Journal of the Faculty of Science, Hokkaido University, Series 4, Zoology. 17 (3), 474-500 (1970).
- Kelly, L. S., Snell, T. W., Lonsdale, D. J. Chemical communication during mating of the harpacticoid Tigriopus japonicus. Philosophical Transactions of the Royal Society B-Biological Sciences. 353 (1369), 737-744 (1998).
- Kelly, L. S., Snell, T. W. Role of surface glycoproteins in mate-guarding of the marine harpacticoid Tigriopus japonicus. Marine Biology. 130 (4), 605-612 (1998).
- Peterson, D. L., et al. Reproductive and phylogenetic divergence of tidepool copepod populations across a narrow geographical boundary in Baja California. Journal of Biogeography. 40 (9), 1664-1675 (2013).
- Palmer, C. A., Edmands, S. Mate choice in the face of both inbreeding and outbreeding depression in the intertidal copepod Tigriopus californicus. Marine Biology. 136 (4), 693-698 (2000).
- Ito, T. Taxonomy within the genus Tigriopus (Copepoda: Harpacticoida) from Japan, with reference to the relationship between Tigriopus japonicus and T. californicus. Annual report of the Seto Marine Biological Laboratory. 2, 28-35 (1988).
- Barreto, F. S., Schoville, S. D., Burton, R. S. Reverse genetics in the tide pool: Knock-down of target gene expression via RNA interference in the copepod Tigriopus californicus. Molecular Ecology Resources. 15 (4), 868-879 (2015).
- Pereira, R. J., Barreto, F. S., Pierce, N. T., Carneiro, M., Burton, R. S. Transcriptome-wide patterns of divergence during allopatric evolution. Molecular Ecology. 25 (7), 1478-1493 (2016).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).
- Raisuddin, S., Kwok, K. W., Leung, K. M., Schlenk, D., Lee, J. S. The copepod Tigriopus: a promising marine model organism for ecotoxicology and environmental genomics. Aquatic Toxicology. 83 (3), 161-173 (2007).
- Lazzaretto, I., Franco, F., Battaglia, B. Reproductive behaviour in the harpacticoid copepod Tigriopus fulvus. Hydrobiologia. 292, 229-234 (1994).
- Medina, M. H., Morandi, B., Correa, J. A. Copper effects in the copepod Tigriopus angulatus Lang. Marine and Freshwater Research. 59 (12), 1061-1066 (1933).
- McDonough, P. M., Stiffler, D. F. Sodium regulation in the tidepool copepod Tigriopus californicus. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Physiology. 69 (2), 273-277 (1981).
- Hagiwara, A., Lee, C. -S., Shiraishi, D. J. Some reproductive characteristics of the broods of the harpacticoid copepod Tigriopus japonicus cultured in different salinities. Fisheries Science. 61 (4), 618-622 (1995).
- Pereira, R. J., Sasaki, M. C., Burton, R. S. Adaptation to a latitudinal thermal gradient within a widespread copepod species: the contributions of genetic divergence and phenotypic plasticity. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 284 (1853), 20170236 (2017).
- Barreto, F. S., Pereira, R. J., Burton, R. S. Hybrid dysfunction and physiological compensation in gene expression. Molecular Biology and Evolution. 32 (3), 613-622 (2015).
- Alexander, H. J., Richardson, J. M., Edmands, S., Anholt, B. R. Sex without sex chromosomes: genetic architecture of multiple loci independently segregating to determine sex ratios in the copepod Tigriopus californicus. Journal of Evolutionary Biology. 28 (12), 2196-2207 (2015).
- Foley, B. R., Rose, C. G., Rundle, D. E., Leong, W., Edmands, S. Postzygotic isolation involves strong mitochondrial and sex-specific effects in Tigriopus californicus, a species lacking heteromorphic sex chromosomes. Heredity. 111 (5), 391-401 (2013).
- Koga, F. On the Life History of Tigriopus japonicus Mori (Copepoda). Journal of Oceanography. 26 (1), 11-21 (1970).
- Powlik, J. J. Seasonal abundance and population flux of Tigriopus californicus (Copepoda : Harpacticoida) in Barkley Sound, British Columbia. Journal of the Marine Biological Association of the United Kingdom. 78 (2), 467-481 (1998).
- Lard, M., Backman, J., Yakovleva, M., Danielsson, B., Hansson, L. A. Tracking the small with the smallest - Using nanotechnology in tracking zooplankton. PLoS ONE. 5 (10), e13516 (2010).
