Summary
Mate-guardar comportamiento desempeña un papel importante en la reproducción de intermareales copépodos del género Tigriopus. Sin embargo, no se han descrito bien los métodos para el estudio de este comportamiento. Aquí describimos los métodos para: cultura 1) individual de animales de Tigriopus Virgen y 2) análisis cuantitativo de su comportamiento de protección mate.
Abstract
Copépodos del género Tigriopus, que son el zooplancton común en pozas de marea rocosa, mostrar comportamiento de protección mate precopulatory donde un macho abrocha un compañero potencial para formar un par. Mientras que este fenómeno ha despertado el interés de investigadores, métodos para su análisis no han sido bien descritos. Aquí describen los procedimientos para: cultivo y puesta en escena de Tigriopus juveniles y adultos y 2) video análisis de su comportamiento de protección mate 1) individual. El método de cultivo permite un control experimental de pelado experiencia de animales así como la capacidad de rastrear su desarrollo antes de pruebas de comportamiento. El método de análisis permite la evaluación cuantitativa de aspectos varios del comportamiento mate-guardar, incluyendo captura de intentos por parte de los varones y trayectoria de mate-guardar parejas de la natación. Aunque estos métodos fueron establecidos originalmente para estudios etológicos de Tigriopus, con modificaciones adecuadas se puede también aplicar a estudios de otros zooplancton en campos de investigación diferentes, tales como fisiología, toxicología y ecológico genética.
Introduction
Intermareales copépodos del género Tigriopus están ampliamente distribuidos en piscinas intermareales alto rocosos a través de varios continentes1. Estos copépodos exhiben comportamiento mate-guardar como parte de su reproducción, donde un hombre adulto capta una pareja potencial (juvenil o adulto) utilizando sus antenas primer enganchadas antes de la cópula (figura 1 y figura 2)2 ,3,4,5. Aunque este fenómeno ha sido objeto de estudios etológicos y bioquímicos para décadas2,3,6,7, los procedimientos detallados para los estudios de este comportamiento, incluyendo cultura individual de los animales Virgen y criterios de comportamiento eventos en un intento de protección mate, no han sido bien descritas. Por lo tanto, aquí establecemos métodos para estudios del comportamiento en un entorno experimental controlado.
Cultivo individual y puesta en escena de los animales
Estudios anteriores de la reproducción de Tigriopus emplean convencionalmente un par extraer método para preparar a los juveniles (copepodids) y las hembras adultas para las pruebas de comportamiento y cría experimentos3,8,9 ,10. Sin embargo, este método permite a los animales a los pares de la forma y potencialmente para copular antes de pruebas (discutidas en 1988 Ito11), que pueden alterar propiedades de comportamiento de animales5. Además, es un potencial para misjudge etapas de desarrollo de copépodos con los protocolos convencionales ya que dependen de tamaño del cuerpo aparente para la puesta en escena. En este papel, describimos un método de cultivo individual utilizado en nuestro estudio reciente con Tigriopus californicus5, que fue diseñado para abordar estas limitaciones por experiencia emparejamiento de los animales de control y seguimiento de su desarrollo de copepodid a etapas adultas.
Análisis cuantitativo del comportamiento de protección mate
El comportamiento de protección mate de Tigriopus especies se ha estudiado no sólo en el campo de la etología2,6 , sino también en otros campos como la genética evolutiva3,4, y Ecotoxicología 7 , 8 , 9 , 10. sin embargo, los estudios anteriores han explicado el curso de este comportamiento principalmente en escritos formularios sin suficientes ilustraciones visuales para delinear el comportamiento y los métodos para el estudio, que crea dificultades técnicas para la replicación y el avance de los estudios. Aquí, ofrecemos descripciones detalladas de algunos de los eventos clave en el comportamiento de protección mate de Tigriopus copépodos apoyada por material visual. También demostramos el equipo y métodos para el análisis cuantitativo del comportamiento. Estos métodos permiten la evaluación de propiedades de comportamiento de los animales durante los intentos de protección mate precisamente experimentos replicados.
Con estos métodos pretendemos proporcionar una base metodológica de los estudios controlados y reproducibles en el comportamiento de protección mate de género Tigriopus.
Protocol
1. preparación de animales vírgenes para la observación del comportamiento
- Obtener huevos fertilizados y que puedan eclosionar.
- Recoger las hembras grávidas con huevos naranja claro (es decir, fecundado y en etapas avanzadas de desarrollo) (figura 3) de un cultivo con una pipeta Pasteur. Enjuague las hembras transfiriendo suavemente les limpio medio de cultivo para evitar la transferencia de otros animales, incluyendo nauplial larvas que pueden haber tramado en la cultura.
Nota: En este protocolo, agua de mar artificial con una salinidad de 35% se utiliza como medio de cultivo. Uso diverso medio (e.g. artificial agua de mar con una salinidad mayor o un soluto adicional) según el propósito de un experimento.
Nota: Ver Barreto et al. 201512 para un método para el establecimiento de las poblaciones de cultivo de laboratorio y Pereira et al. 201613 ejemplos de sitios de recolección de las poblaciones naturales de T. californicus. Peterson et al también divulgó sus sitios de colección de T. californicus, T. fulvusy T. japonicus con información de latitud y longitud9. Utilizar pipetas de plástico con una capacidad de aproximadamente 30-50 mL para recoger Tigriopus copépodos de piscinas de roca. - Coloque cada mujer individualmente en un pozo de una placa de cultivo celular 6-bien con medio de cultivo limpio (figura 4, izquierda). Asegúrese de que ningún otro animal (incluyendo nauplial larva) está contaminando el pozo.
- Mantener las placas en una incubadora fija en 20 ° C con un ciclo de luz-oscuridad de 12 horas a la cultura las hembras hasta que lanzan sacos de huevo. Este paso generalmente lleva uno a diez días dependiendo de las especies y etapas de desarrollo de embriones. Mientras tanto, cada hembra grávida alimentar dos veces a la semana con dos granos de alimento para peces finamente molido (aproximadamente < 0,5 mm de diámetro) (para detalles, véase Tabla de materiales ).
Nota: Use diferentes temperaturas y ciclos de luz según el propósito de un experimento. Temperaturas más altas pueden facilitar el más rápido desarrollo de los embriones.
Nota: No dejar exceso de comida en descomposición en pozos. Si residuos de comida empiezan a decaer, pipeta de pozos con una pipeta Pasteur. - Después de sacos de huevos son liberados, retire las hembras de los pozos de la cultura con una pipeta Pasteur.
Nota: Las hembras inseminadas son capaces de desove múltiples garras de descendencia2,3. Si es necesario, transferir las hembras a otros pozos para recoger más garras.
- Recoger las hembras grávidas con huevos naranja claro (es decir, fecundado y en etapas avanzadas de desarrollo) (figura 3) de un cultivo con una pipeta Pasteur. Enjuague las hembras transfiriendo suavemente les limpio medio de cultivo para evitar la transferencia de otros animales, incluyendo nauplial larvas que pueden haber tramado en la cultura.
- Recoger el copepodids de la cultura individual.
- Mantener las placas con nauplios nacidos en la incubadora y los nauplios de la cultura hasta que se convierten a la primera etapa de copepodid (CI) (figura 4, media). Este paso generalmente lleva de una a dos semanas. Cada alimento con varios granos de finamente molido de pescado alimentos mientras buscaban animales CI una vez cada dos días. Rellenar el agua evaporada de cría con agua destilada.
Nota: Si los desechos flotantes obstruyen la vista, descremada con un trozo de toalla de papel. - Tan pronto como CI animales comienzan a emerger, recoger de los pozos con una micropipeta P-10 con su volumen de pipeteo de aproximadamente 8 μl, bajo un estereomicroscopio de 10 X a 40 X de ampliación (figura 4, derecha). Lavar cada animal CI transfiriendo suavemente en agua de mar artificial limpio y colocar en un pocillo de la placa de cultivo celular de 24 pocillos que contienen 2-3 mm de profundidad (aproximadamente 400-600 μL) de agua de mar artificial.
Nota: Evite transportar exuvias nauplial u otros animales en los pozos de la cultura individual.
- Mantener las placas con nauplios nacidos en la incubadora y los nauplios de la cultura hasta que se convierten a la primera etapa de copepodid (CI) (figura 4, media). Este paso generalmente lleva de una a dos semanas. Cada alimento con varios granos de finamente molido de pescado alimentos mientras buscaban animales CI una vez cada dos días. Rellenar el agua evaporada de cría con agua destilada.
- Seguimiento de desarrollo de los individuos por contar exuvias mudadas.
- Examinar dentro de cada pozo de exuvias mudadas cada dos o tres días (ajuste de frecuencia si es necesario) mediante la observación estereoscópica bajo una iluminación de campo oscuro de 10 X a 40 aumentos. Exuvias de copepodids son transparentes y reconocibles con cerdas de las patas, un par de rami caudal (es decir, fino que resaltan las estructuras en el extremo caudal) o segmentación de prosome y urosome (figura 5). Cambiar el enfoque y la iluminación para detectar exuvias a diferentes profundidades en un pozo (figura 6A).
Nota: Exuvias mudadas son más pequeños que el animal que les ha fundiendo. Partir de examen aumentos inferiores para un animal y sus exuvias relativamente reciente y cambio a mayor aumento para mayores exuvias (es decir, más pequeño).
Nota: Si están dañadas exuvias en un pozo, eliminar el pozo de mayor desarrollo seguimiento para evitar el error en el cálculo de etapas de desarrollo.
Nota: Si los desechos flotantes obstruyen la vista (Figura 6B), descremada con un trozo de toalla de papel. - Grabar un número de exuvias de copepodid en cada pocillo con una marca de la cuenta en la tapa de la placa (figura 7). Añadir una línea a la marca como un nuevo exuvias es encontrado en el pozo.
Nota: Si hay nauplial exuvias contaminación en el pozo, eliminar de la cuenta. - Alimentación de cada individuo con dos granos de molido finamente comida de pescado. Rellenar el agua evaporada de cría con agua destilada para mantener la salinidad.
Nota: La alimentación copepodids cada dos o tres días para evitar que consumidores y dañen exuvias mudadas, que potencialmente podrían influir en la estimación de la etapa del desarrollo (paso 1.3.4). - Estimar la etapa de desarrollo de los animales basado en el número de las exuvias. Si no hay ningún exuvias, el individuo se estima en etapa de CI. Si hay exuvias de uno a cuatro, el individuo se estima en el CII a etapas de CV. Si hay cinco exuvias, el individuo se estima que un adulto.
- Examinar dentro de cada pozo de exuvias mudadas cada dos o tres días (ajuste de frecuencia si es necesario) mediante la observación estereoscópica bajo una iluminación de campo oscuro de 10 X a 40 aumentos. Exuvias de copepodids son transparentes y reconocibles con cerdas de las patas, un par de rami caudal (es decir, fino que resaltan las estructuras en el extremo caudal) o segmentación de prosome y urosome (figura 5). Cambiar el enfoque y la iluminación para detectar exuvias a diferentes profundidades en un pozo (figura 6A).
- Identificar el sexo de los adultos basado en la morfología.
- Animales sexo examinando su morfología. Los machos adultos de Tigriopus poseen antenas primer articulados con estructuras ganchudas y globulares en el extremo distal (Figura 3A). Las hembras adultas poseen antenas más suaves y relativamente más delgadas primeros (figura 3B) que los de los machos. Algunas mujeres también presentan color verde oscuro de lípidos gonadal en sus cuerpos (figura 3B, 3D).
- Marca el sexo en la tapa del pozo (figura 7B).
2. comportamiento prueba y grabación de vídeo del comportamiento de protección Mate
- En un día de prueba, seleccionar animales de escenario deseado y el sexo para una prueba de comportamiento.
- Los individuos seleccionados en los pozos de la cultura de la alimentación con alimento para peces de tierra finamente y que puedan comer durante 30 minutos. Mientras tanto, proceda al paso de la 2.1.2 para preparar pruebas de cámaras.
- Preparar dos placas celular parte inferior plana de 48-así como pruebas de cámaras; una placa (de ahora en adelante llamada "placa A") es para los hombres y la otra ("placa B") es para objetivos (por ejemplo, copepodids, las hembras adultas, machos adultos). Añadir 400 μL de agua de mar limpia artificial con una salinidad de 35% en los pocillos de las placas. Coloque las placas sobre una almohadilla de luz LED cubierta con un tablero de acrílico translúcido como un difusor de luz (figura 8).
Nota: Uso diverso medio según un propósito de un experimento.
Nota: Para evitar el exceso de calor, no utilizar lámparas incandescentes o fluorescentes como una luz de fondo. - Después del tiempo de alimentación de 30 min descrito en 2.1.1, enjuague cada animal transfiriendo suavemente en una sucesión de cuatro pocillos de una placa de 24 pocillos llenado con agua de mar limpia artificial (figura 9) para evitar el arrastre de desechos y exuvias de los pozos de la cultura.
- Coloque a los individuos lavados en los pocillos de las placas A y B en el teclado de luz LED. Deje 30 minutos para el ajuste de los animales a los pozos.
- Establecer una cámara de video encima de la placa A durante el período de adaptación (figura 8). Utilice un trípode o un soporte para sujetar la cámara.
- Enfoque la cámara en los varones dentro de la placa A permitir una observación de antenas.
Nota: Para reducir el parpadeo de la luz de fondo en películas, establezca una velocidad igual o mitad de una frecuencia eléctrica y utilizar un tiempo de exposición. Igualmente, mantenga la tecla luz LED cubierta con un tablero de acrílico translúcido, como se describe en el paso 2.1.2.
- Después del período de ajuste descrito en el paso 2.1.4, iniciar la grabación de vídeo y la prueba de comportamiento.
- Transferir los objetivos de la placa B a placa A con una pipeta Pasteur. Si el experimento es sensible a los componentes químicos en el medio, cambiar de pipetas para cada par de pruebas.
Nota: Cuando uso un animal de la placa B, no perseguirla en el agua con una pipeta Pasteur como disturbio del agua puede estimular el animal y provocar su exceso de movimiento. Sostener una punta de la pipeta ligeramente por encima de la superficie del agua y esperar a que la persona a venir debajo de la punta. Suavemente la pipeta hacia arriba con una pequeña cantidad de agua de mar artificial y luego expulsarlo en un pozo en placa A. - De acuerdo con un plan experimental, permiten un hombre y un destino interactuar en cada pozo para un período de tiempo de observación (por ejemplo 10 minutos) después de la transferencia.
- Detener la grabación después del tiempo de observación. Si es necesario descargar las películas grabadas desde la cámara a un ordenador.
- Transferir los objetivos de la placa B a placa A con una pipeta Pasteur. Si el experimento es sensible a los componentes químicos en el medio, cambiar de pipetas para cada par de pruebas.
3. manual análisis de propiedades de comportamiento
- Examinar la película para el momento cuando cada destino fue transferido en el pozo en placa A.
- Examinar la iniciación y el tiempo de terminación de los eventos de interés y calcular la duración, la latencia y la frecuencia de los eventos.
- Definen inicio de la tentativa de guardar por un macho como un contacto de la antena del macho con cualquier parte del cuerpo de la blanco (figura 10, parte superior izquierda). El contacto antenal es precedido a menudo por un swift (< 0,5 s) perseguir o pounce.
- Definir terminación de intento guardar como un punto cuando ambas antenas del varón separan del cuerpo de un objetivo (figura 10, arriba a la derecha). Calcular la frecuencia de vigilancia de intentos como:
- Definir el inicio de la cópula por una curva del dorso del cuerpo de un hombre que es seguido por una prensa repetitiva de un urosome contra el de la hembra (figura 10, abajo a la derecha). Frecuencia de la presión es varias veces por segundo.
Nota: Un guardián varón se arrastra hasta el extremo caudal del cuerpo de la hembra antes de la cópula (figura 10, abajo a la izquierda). - Definir la terminación de la cópula por desprendimiento de la urosomes después de los acontecimientos descritos en 3.2.4.
Nota: La cópula ocurre generalmente durante varios minutos en los casos de T. californicus y T. japonicus.
4. dos dimensiones seguimiento de individuos y parejas
- Generar un video clip con un episodio de interés (por ejemplo, los primeros 3 s de un intento de protección) por recortar la película grabada en el paso 2 con software de edición de película.
- Instalar ImageJ14 de: https://imagej.nih.gov/ij/download.html. Descargar MTrackJ, un plugin de control de movimiento para ImageJ15, por siguiendo las instrucciones en: https://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/.
- Abrir ImageJ e importar una película de interés (por ejemplo, archivo > Importar > usando QuickTime; elegir "Convertir 8 bits escala de grises" para reducir la memoria requerida para el procesamiento de imágenes).
- Realizar la calibración espacial y tiempo.
- Seleccione la herramienta de selección de línea recta en la ventana de ImageJ para la calibración espacial.
- Dibujar una línea de selección a lo largo de un objeto con una longitud conocida (por ejemplo, el diámetro de un pozo) en la ventana de la película.
- Abra el menú "Set Scale" (Analyze > Set escala). Escriba la longitud conocida en el cuadro "distancia conocido" y su unidad (por ejemplo mm) en el cuadro de "Unidad de longitud". Haga clic en la casilla de verificación "Global" para utilizar la escala para otros videoclips.
- Abrir el menú de "Propiedades" (imagen > Propiedades) para la calibración de tiempo. Introduzca el intervalo de fotograma (recíproco de la velocidad de fotogramas) en el cuadro de "Frame interval".
- Configurar el seguimiento con MTrackJ.
- Abrir el plugin MTrackJ de Plugins > MtrackJ el ImageJ. Haga clic en el botón "Seguimiento" en la ventana de diálogo de MTrackJ para abrir un seguimiento menú de configuración.
- Establecer un intervalo de seguimiento de verificación "Mover al siguiente índice de tiempo después de agregar el punto" e introduciendo un número en la caja "Tamaño del paso del tiempo" en la ventana de diálogo de configuración. Para realizar el seguimiento de cuadro por cuadro, escriba "1" en el cuadro "Tamaño de paso de tiempo".
- Compruebe "Aplique el cursor local ajuste durante el seguimiento" y elija "Centro oscuro" como una función de ajuste. Esta opción permite una detección automática de centroide de un objeto oscuro (es decir, un individuo o un par) dentro de un cuadrado de detección ("gama de complemento") alrededor de un cursor. Seleccione un tamaño de la plaza para cubrir un todo par o animal en la película (por ejemplo, 31 x 31 píxeles).
- Haga clic en "Aceptar" para aplicar las opciones solicitadas.
- Realizar el seguimiento de dos dimensiones.
- Haga clic en el botón "Añadir" en la ventana de diálogo MTrackJ para iniciar el seguimiento.
- Poner un cursor (Plaza de detección) para cubrir un par o un individuo para realizar un seguimiento. Haga clic en detectar el centroide oscuro del objeto dentro del cuadrado.
- Repita el paso 4.6.2 para un número deseado de Marcos.
- Para generar tablas de datos, haga clic en botón de "Medida" en la ventana de diálogo de MTrackJ. Los datos se muestran en dos ventanas: "MTrackJ: pistas" ventana muestra un resumen de la trayectoria seguida bidimensional y "MTrackJ: puntos" muestra datos detallados para cada punto del tiempo. Para guardar cada tabla, elija Archivo > Guardar como... del menú en ImageJ.
Nota: Consulte el manual en línea proporcionado por el desarrollador (https://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/manual/) para las descripciones de cada columna de datos. - Para generar una película con una trayectoria de seguimiento dibujada como una línea de color, haga clic en el botón de "Película" en la ventana de diálogo de MTrackJ. Para guardar la película generada, elija Archivo > Guardar como... del menú en ImageJ.
- Guarde el resultado entero. Haga clic en el botón "Guardar" en la ventana de diálogo MTrackJ para guardar los resultados como los datos (paso 4.6.4) y la trayectoria bidimensional orugas (pasos 4.6.2 y 4.6.3).
Representative Results
El método de cultivo individual descrito en el paso 1 permite la preparación y puesta en escena de animales Virgen sin experiencia previa de emparejamiento.
El comportamiento descrito en el paso 2 permite grabación de vídeo y observación del comportamiento de protección mate de Tigriopus copépodos. El siguiente examen de vídeo grabado con los métodos descritos en los pasos 3 y 4 permite el análisis cuantitativo de aspectos varios del comportamiento que se muestra en la figura 1.
La figura 11 muestra una diferencia en la duración promedio de vigilancia de tentativas entre pares macho-hembra y macho de T. californicus. Un análisis manual demostró que pares macho mostraron relativamente menor duración de la vinculación de hombres y mujeres parejas.
Ejemplos de trayectorias de seguimiento con el método de análisis se presentan en la figura 12 y un resultado representativo del análisis de la velocidad se muestra en la figura 13. Seguimiento espacial bidimensional de pares guardar recién formados de T. californicus reveló que pares macho tendieron a mostrar una velocidad más alta que hombres y mujeres pares en los primeros 3 s de intentos de vigilancia.
Figura 1: Comportamiento de protección Mate de Tigriopus. (A) un macho adulto abrochar a un juvenil (copepodid) con la primera antena (indicada por las flechas azules). Barra = 1 mm. (B) un esquema de comportamiento mate-guardar. Un hombre intenta captar un individuo blanco (izquierda) y forma un par con él (medio). En pares de macho y algunos hombres y mujeres, un intento de protección termina sin cópula. Esta figura ha sido modificada desde Tsuboko Ishii y Burton 20175. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Etapas de desarrollo de Tigriopus. Especie de Tigriopus generalmente pasan por seis etapas Nauplio (desde NI a NVI), cinco etapas de copepodid (de CI a CV) y una fase adulta (CVI)16. Los machos hacen intentos de protección a los menores desde una fase temprana de copepodids (CI en6,de T. japonicus y T. fulvus17 ) y CII en T. californicus3, así como a los adultos de ambos sexos5 . Esta figura ha sido modificada desde Tsuboko Ishii y Burton 20175. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Morfología de los adultos (T. californicus). Macho adulto (A) . Hembra adulta (B) . (C) hembra adulta grávida con un saco de huevos con huevos fecundados y desarrollados (naranjas claro). (D) adulto hembra grávida con un saco de huevos no fecundados o no desarrolladas (verde oscuro) huevos. Las flechas indican los sacos de huevos. Barra = 1 mm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: esquema de preparación para cada cultura. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: fundiendo exuvias. (A) de exuvias de CI a etapas de CV de un solo animal de T. californicus. Barra = 1 mm. (B) etapas de exuvias de CI a CV en una cultura individual bien. Basura blanca es excremento de un animal en el pozo (no se muestra en la imagen). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: búsqueda de exuvias bajo un estereomicroscopio. Barras = 1 mm. (A) coordinación cambio de un estereomicroscopio para la detección de exuvias a diferentes profundidades. Magentas flechas indican exuvias centrado y flechas grises indican exuvias desenfocado. Imagen de arriba se centra en las exuvias de izquierda, que está hundido en el fondo del pozo. Imagen de fondo se centra en la derecha exuvias, que flotan bajo la superficie del medio. (B) imagen de arriba muestra un ejemplo de obstrucción de la examinación de escombros flotando en la superficie del medio. Una flecha verde indica un exuvias escondidos debajo de los escombros. Imagen de fondo muestra un resultado de limpieza con un trozo de toalla de papel. Un exuvias (indicado por una flecha verde) es visible después de la limpieza. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: puesta en escena y Sexaje de los animales. Ejemplos de cómo marcar el número de exuvias y sexo de los animales en la tapa de una placa de cultivo. (A) un ejemplo de un pozo que contiene cinco exuvias y un animal adulto. El número de las líneas de la marca de la cuenta en la tapa representa el número de exuvias encontró en el pozo. Cuando el número de exuvias llega a cinco, se puede determinar el sexo del animal basado en la morfología de las antenas (vea la figura 3). (B) un ejemplo de una tapa marcada de una placa de cultivo. Filas superiores contienen los animales más viejos (CIV a adulto) y filas de abajo contienen animales más jóvenes (es decir, recién recolectadas) (IC: a CIII). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8: esquema de comportamiento prueba. Configuración de grabación de vídeo del comportamiento de protección mate (izquierda) y un esquema de comportamiento prueba (derecha). Esta figura ha sido modificada desde Tsuboko Ishii y Burton 20175. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 9: enjuague de animales antes de un test de comportamiento Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 10: definición de eventos examinados en el análisis manual. Ilustraciones de eventos observados en relación con la tentativa de guardar mate. Se destacan los nombres de los eventos definidos y analizados en el paso 3. Eventos encerrados una línea de puntos no se pueden observar en algunos intentos de protección mate. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 11: Diferencia en guardando duración entre pares macho-hembra y macho de T. californicus. Cada símbolo de triángulo representa los datos de un par de prueba. Barras y bigotes representan medianas y rango intercuartil respectivamente. Duración promedio de captura fue mayor para hombres mujeres parejas (hombres y mujeres (n = 22), macho (n = 29); **p < 0.01 por prueba U de Mann-Whitney). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 12: trayectorias de pares en los primeros tres segundos de vigilancia intentos. Ejemplos de trayectorias bidimensionales seguidos de hombres y mujeres pares (izquierdas) y macho (derecha) de T. californicus. Puntos sobre las trayectorias representan puntos de tiempo (30 fotogramas por segundo). Barras = 10 mm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 13: La diferencia en la velocidad media después de la iniciación de la protección entre pares macho-hembra y macho de T. californicus. Cada símbolo de triángulo representa los datos de un par de prueba. Barras y bigotes representan medianas y rango intercuartil respectivamente. Promedio de velocidad del par en los primeros 3 s de vigilancia intentos fue mayor para los pares del macho (macho-hembra (n = 13), macho (n = 35). ***p < 0.001 por prueba U de Mann-Whitney). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Suplementario Figura 1: Efecto de aclarar el tratamiento sobre el comportamiento de Tigriopus. Cada círculo o triángulo símbolo representa los datos de una prueba individual o pareja. Barras y bigotes representan medianas y rango intercuartil respectivamente. Individuos en grupos "no aclarada" y "lavado" se manejaron de la misma manera, excepto que el grupo "no aclarada" no experimentó el tratamiento enjuague (paso 2.1.3) antes del tiempo de ajuste de 30 minutos (paso 2.1.4). (A) promedio de la velocidad de aclarado machos tendió a ser mayor que la de los varones no aclarados (aclarado (n = 6), no aclarado (n = 6), n.s.: ninguna diferencia significativa fue detectada por la U de Mann-Whitney test). Se midió la velocidad de 30 s basado en vídeos registrados después del tiempo de ajuste. (B) promedio de la velocidad de aclarado hembras tendió a ser mayor que la de las hembras no aclaradas (aclarado (n = 6), no aclarado (n = 6), n.s.: ninguna diferencia significativa fue detectada por la U de Mann-Whitney test). Se midió la velocidad de 30 s basado en vídeos registrados después del tiempo de ajuste, siguiendo el paso 4 (intervalo de seguimiento = 0,5 s). (C) frecuencia de intentos de vigilancia fue mayor para los pares de individuos enjuagados (aclarado (n = 6), no aclarado (n = 6). ** p < 0.01 por prueba U de Mann-Whitney). (D) duración de intentos de vigilancia tendió a ser mayor para los pares de individuos enjuagados (aclarado (n = 6), no aclarado (n = 6), n.s.: ninguna diferencia significativa fue detectada por la U de Mann-Whitney test). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
Cultivo individual y determinación de la etapa y sexo
Aquí describe el método utilizado en nuestro anterior estudio5 para preparar animales de Tigriopus Virgen con su experiencia de sincronización controlada al seguimiento de su desarrollo (figura 4 y figura 7). Como especies de Tigriopus se utilizan como animales de modelo en varios campos biológicos como Toxicología16,18, fisiología ecológica19,20,21y evolutivo genética13,22,23,24, este método tiene el potencial de proporcionar un medio valioso para evaluar la influencia de factores ambientales y genéticos en el ciclo de vida de estos copépodos.
Para lograr la exitosa puesta en escena, búsqueda normal y colección de CI copepodids de una cultura de masas (paso 1.2) es crítica, como colección en etapas posteriores puede resultar en mal puesta en escena de los animales. Además, una búsqueda exhaustiva de exuvias (paso 1.3) también es esencial para la precisa puesta en escena. Aumentar la frecuencia de recolección y escenificando si es necesario, como el intervalo entre mudas varía de uno a varios días dependiendo de la especie y cría condición2,25,26. Diferencias en la morfología de antenas copepodids y hembras adultas no son visiblemente significativas en algunas especies y poblaciones de Tigriopus16,25. Por lo tanto, puesta en escena antes de sexado es útil para distinguir las hembras adultas de copepodids avanzadas de cualquier sexo.
Pruebas de comportamiento y análisis manual de propiedades de comportamiento
En general, una de las partes más críticas de estudios etológicos es definición y descripción de los eventos de interés. Los métodos introducidos en este documento primero fueron desarrollados para nuestro reciente estudio5 y complementados con la descripción de la cópula y las ayudas visuales (figura 10). Además de eso, consistencia en el manejo de animales también desempeña un papel importante en los experimentos conductuales. Por ejemplo, el enjuague de copépodos potencialmente puede facilitar algunos aspectos de su comportamiento (suplementario Figura 1) y por lo tanto es conveniente llevar a cabo de manera consistente entre las muestras, estandarizado como en el paso 2.1.3. Esperamos que los materiales provistos en este artículo le ayudará a estudios controlados y reproducibles en el comportamiento de protección mate de Tigriopus, promover los estudios reproductivos y ecológicos de este habitante abundante de piscinas de la marea alta.
Una limitación posible con este método es baja magnificación de las imágenes obtenidas. Aunque películas grabadas con nuestro sistema permitan la identificación de estructuras del cuerpo prominentes incluyendo urosomes y antenas primera masculinas, uno no puede ser capaz de observar estructuras más sutiles como las piernas y los órganos genitales con nuestro método ya que no emplea magnificación microscópica para grabación de vídeo. Mientras que Kelly et al reportó que fueron capaces de observar a spermatophore transferencia de machos a hembras de T. japonicus bajo una observación microscópica a 100 X de ampliación (no vídeo grabado)7, no hemos sido capaces de observar un espermatóforo en nuestras películas, tal vez debido a la limitación de la resolución de imagen.
Seguimiento de dos dimensiones de pares
Aunque este método no permite seguimiento tridimensional de los animales, permite análisis de trayectoria bidimensional de zooplancton sin químicamente etiquetado animales (cf. Manteca de cerdo et al. 201027) mediante la utilización de programas distribuidos gratuitamente. Si el tamaño de un archivo de película es demasiado grande para ser procesados en ImageJ, uno puede reducir la resolución del archivo y convertirla en una película de escala de grises. Mientras que el método descrito fue desarrollado originalmente para parejas adultas de T. californicus (figura 12 y figura 13), también está disponible para adulto-juvenil parejas y personas individuales (suplementario Figura 1) como así como otras especies de Tigriopus en principio. Además esperamos que el método de análisis aplicable a corto plazo (de milisegundos a las escalas de tiempo segundo) trayectoria de zooplancton de otros taxa con ajustes apropiados.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo es apoyado por las subvenciones de la Fundación de Sumitomo, Japón (número de concesión de subvenciones para proyectos de investigación de ciencia básica,: 150932) e Instituto de investigación de invertebrados marinos, Japón (beca de investigación individuales 2018) STI y RSB y una subvención de los Estados Unidos Fundación de ciencia nacional (DEB-1556466) a RSB. Agradecemos a la Sra. Kiana Michelle Woodward para comentarios sobre el método de cultivo y puesta en escena.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instant Ocean Sea Salt | Spectrum Brands. Inc. | SS1-160P | For preparation of culture medium |
| PRO PlecoWafers | Tetra | 16447 | Food for copepods (used after being ground in a mortar) |
| Flat bottom 6-well tissue culture plate with lid | Corning Co., Ltd. | 353224 | Container for culture of gravid females and hatched nauplii |
| Flat bottom 24-well cell culture plate with lid | Corning Co., Ltd. | 353226 | Container for individual culturing |
| Flat bottom 48-well cell culture plate with lid | Nest Biotechnology Co., Ltd. | 748001 | Behavioral observation chambers |
| LED light pad | Shenzhen Huion Animation Technology Co., Ltd. | Litup LP4 | Backlight for behavioral observation |
| Camera | Canon | 0591C003 (model: Rebel T6i) | For recording of behavior |
| Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-678-6A | For transfer of copepods |
| P10 micropipette tips | VWR | 613-0735 | For transfer of C1 stage copepodids |
| ImageJ | NIH | Version 1.49t | For semi-automatic analysis of movies |
| MTrackJ | Version 1.5.1 | ImageJ plugin for tracking developed by Dr. Erik Meijering (Biomedical Imaging Group Rotterdam, Erasmus University Medical Center, The Netherlands) |
References
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