Summary
在这里, 我们分享测量线粒体耗氧量的方法, 营养能量学的一个决定性概念, 和质子泄漏, 这是线粒体产生 atp 效率低下的主要原因。这些结果可以占营养利用损失能量的 30%, 以帮助评估线粒体功能。
Abstract
耗氧量、质子动力 (pmf) 和质子泄漏是线粒体呼吸的测量, 或线粒体能够将 nadh 和 fadh 转化为 atp 的程度。由于线粒体也是氧气使用和营养氧化的主要场所, 二氧化碳和水, 他们如何有效地使用氧气和产生 atp 直接关系到营养代谢的效率, 动物的营养需求,动物的健康。该方法的目的是检查线粒体呼吸, 可用于检查不同药物、饮食和环境对线粒体代谢的影响。结果包括作为质子依赖性呼吸 (状态 3) 测量的耗氧量和质子泄漏依赖性呼吸 (状态 4)。国家 3/状态4呼吸的比例被定义为呼吸控制比 (rcr), 可以表示线粒体的能量效率。线粒体质子泄漏是通过从 adp 中分离氧化磷酸化来消除线粒体膜电位 (mmp) 的过程, 从而降低了 atp 合成的效率。氧和 trmp + 敏感电极与线粒体底物和电子传输链抑制剂被用来测量状态3和状态4呼吸, 线粒体膜 pmf (或产生 atp 的潜力) 和质子泄漏。这种方法的局限性是肝脏组织必须尽可能新鲜, 所有活检和检测必须在不到10小时内进行。这将一个人一天可以收集和处理的样本数量限制在大约5个。然而, 只需要1克的肝脏组织, 所以在大型动物, 如奶牛, 所需的样本量是小的相对于肝脏大小, 几乎不需要恢复时间。
Introduction
线粒体对压力非常敏感, 它们的细胞环境会导致多种代谢疾病。线粒体中的耗氧量和质子泄漏是线粒体健康的指标。本文所描述的基于有质子泄漏和无质子泄漏的耗氧量的 rcr 估计线粒体能量效率的方法。这些结果可以占营养利用1所损失能量的 30%.氧气消耗和质子泄漏的变化可以识别线粒体功能障碍, 从而导致代谢疾病, 并导致能源效率下降。这些方法也可用于检查不同治疗方法对线粒体呼吸的影响。测量线粒体耗氧量和质子泄漏动力学的总体目标是评估线粒体功能和能量效率。
肝线粒体功能障碍与奶牛的几种疾病有关。早期泌乳时, 当面对能量不足时, 细胞代谢在碳水化合物和脂类燃料之间切换的能力受到细胞2中线粒体数量和功能的影响.线粒体适应能量需求增加和β氧化增加的能力存在缺陷, 可导致与胰岛素抵抗相关的细胞内脂质积累, 并可能导致早期哺乳奶牛脂肪肝的形成。线粒体作为酮体生产和使用的场所, 在奶牛3中的酮症中发挥着关键作用。线粒体或线粒体功能障碍的缺乏将影响外围燃料的供应, 并反映在氧气消耗或 rcr 的变化上。
线粒体耗氧量随炎症而变化。7天龄的肉鸡随机分为感染 eimeria 最大值的组和对照组 4。没有经历过球虫病挑战的肉鸡由于质子泄漏而耗氧量较低, rcr 较高表明肝脏线粒体通过增加质子泄漏来应对免疫挑战。虽然质子泄漏和活性氧的产生曾经被认为是线粒体膜功能障碍的表现, 对能量效率不利, 但现在大家都知道, 将蛋白质和钙导入线粒体很重要。, 并为热的产生1。
从呼吸链的电子泄漏使线粒体容易产生活性氧, 并对线粒体膜蛋白、脂质和线粒体 dna 造成氧化损伤。随着线粒体年龄的增加, 损伤尤其会积累到 mtdna 中, 导致线粒体代谢的进一步功能障碍, 并使奶牛对疾病的易感性更强。实际上, 许多牲畜动物被喂养高水平的补充剂, 如铜, 锌和锰, 以提高抗氧化功能。然而, 由于质子泄漏 (状态4呼吸), 摄入高水平的铜、锌和锰会减少牛奶产量, 增加耗氧量.
此前关于线粒体功能在牛能量效率中的作用的研究主要集中在线粒体耗氧量和质子泄漏的变化上。在奶牛中发表的研究很少, 大多数论文将剩余饲料摄入量 (rfi) 的生产效率与肉牛的线粒体功能进行了比较。通过测定哺乳期荷斯坦奶牛和哺乳牛牛 (安格斯、布拉古斯和赫里福德) 肝脏中的3、4和 rcr 状态, 检测线粒体呼吸速率的变异性.研究人员没有发现肉牛线粒体呼吸与生长或挤奶性状有任何相关性, 但确实报告了线粒体呼吸与霍尔斯坦挤奶性状之间的相关性。在两项研究中, 将牛牛的 rfi 与肌肉线粒体 9、10的线粒体呼吸速率 (状态3、状态4和 rcr) 进行了比较。线粒体呼吸率随着 dmi 的变化而变化, 低呼吸率与效率较低的牛肉转向有关。在另一项研究中, 将高或低 rfi 公牛的蒸手的 rfi 与两组后代11之间的线粒体呼吸速率和质子泄漏动力学进行了比较.差异的原因是证实了增益不影响肉牛线粒体呼吸的结论。
本文通过一项实验, 对奶牛饲养3种抗氧化矿物质的肝脏 rcr 进行了研究, 阐述了用方法测量4号和3号州呼吸和 pmf 期间的耗氧量。
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Protocol
这里描述的所有方法、协议和研究都得到了加州大学戴维斯分校动物护理和使用机构委员会 (iacuc) 的批准。
1. 从荷斯坦奶牛获得肝脏活检
注: 肝脏活检应由有执照的兽医进行。肝脏活检可以在奶牛所在的乳品现场进行。哺乳奶牛可以继续正常挤奶, 牛奶不需要在手术前或手术后从食物供应中提取。建议至少需要4人在奶牛上进行肝脏活检: 一名兽医进行活检, 一名动物处理员站在奶牛的臀部保护活检区和兽医, 一名实验室技术人员在笔外进行转运和技术人员在车辆后部 (图 1) 和技术人员检索肝脏样本并开始线粒体隔离时, 可以在车辆后部保持清洁区域。
- 在肝脏活检前一个月, 给奶牛接种梭菌疫苗。通过高压灭菌手术毛巾、活检仪器、手术刀架和手术设备创建手术包。
- 在肝活检前一天, 给奶牛注射盐酸头孢菌在颈部皮下的重量 0.044 mL/kg。监测奶牛的体温、摄入量和粪便得分, 作为正常功能的基线。
- 创建线粒体分离介质 (mM), 其中包含 220 mm 甘露醇、70 mm 蔗糖、20 mm hepes、1 mm edta 和 0.1% (w/v) 不含脂肪酸的 bsa, 在4°c 下 ph 7.4。每个样品大约需要30毫升。
- 根据需要, 在物理上使用带吊环的头锁, 以身体上的方式约束奶牛 (图 2)。用吊环, 把她的头绑在支架的左侧。如有必要, 可使用化学约束 (盐酸 Xylazine 100 mgm/ml iv 在0.010-0.015 毫克/千克体重)。
- 活检区域位于正确的10-11 肋间空间 (图 3)。画一条直线, 从右块茎到右肩点。活检部位是这条线与10-11th 跨海岸空间相交的地方。通过剃须10厘米见方的面积, 对牛的生物化面积进行消毒 (图 4)。用圆周运动用10% 的规定擦洗清洗区域 (图 5)。用70% 乙醇溶液喷洒区域 (图 6)。重复提供和乙醇清洗。
注: 与肉牛相比, 荷斯坦奶牛的肝脏处于稍有不同的位置。 - 在局部注射2% 利多卡因 hcl (10-15 ml), 以提供皮肤和底层肌肉及结缔组织的麻醉 (图 7)。重复提供和70% 乙醇清洗。
注意: 神经末梢在皮肤和肌肉, 但不是内脏, 所以只需要局部麻醉。在活检过程中, 牛最多只能感觉到一些压力, 没有疼痛。 - 在10-11th 肋间空间的皮肤上做一个1-2 厘米的刺伤切口 (图 8)。通过皮肤通过沙克福德-孔特尼牛肝脏活检仪器, 并将活检仪器定向到轻微的颅骨方向, 同时继续通过横隔膜进入肝脏 (图 9,图 10)。获取1克肝脏样本并取出仪器 (图 11)。用缝合位置缝合皮肤 (图 12)。
- 将肝脏样本放置在有足够 mim 覆盖样本的锥形管中, 放在冰上立即分离线粒体
- 在活检24小时内检查切口是否有红肿、发热或疼痛, 并在接下来的3天内每天一次在颈部注射盐酸头孢菌 (ceftiofurmL/kg)。在肝活检后1周内, 每天监测奶牛的体温、摄入量和粪便得分。如果出现发烧, 请由兽医酌情使用抗生素。
注: 如果奶牛在肝脏活检后1小时内出现疼痛症状, 如踢切口部位、呕吐、发红、发热或反应接触, 可用于注射 1 mg* kg 体重 iv 注射氟尼辛素, 以减轻疼痛和炎症。如有必要, 可进行第二次注射。 - 活检后7天取出缝合线。
2. 从奶牛肝脏中分离线粒体
- 在将肝脏样本从奶牛中取出后, 尽快在 mim (步骤 1.3) 中清洗肝脏样本, 去除红细胞, 并用剪刀将样本切碎。肝脏应在含有足够隔离介质的冷冻烧杯中碎, 以保持组织湿润。
- 将碎肝放入一个30毫升的玻璃瓶中, 在冰中孵育0.16 毫米的小管, 并含有 mL (1:4 wv)。
- 在500转/分的时候将肝脏样本同质化, 用 4 strokesk/min 进行一分钟。
注: 在整个过程中, 肝脏均质保存在 mim 的冰包装烧杯中, 并在4°c 下完成以下所有离心步骤 - 以 500 x 克离心均质 10分钟, 丢弃颗粒, 将上清液转移到冷却的离心管中, 然后以 10, 000 x 克离心产生的上清液 10分钟, 以获得线粒体颗粒。
- 用无脂肪酸 bsa 和离心机在 8100 x g 下回收和清洗 mL 10 毫升中的颗粒10分钟。
- 在没有脂肪酸 bsa 的情况下, 在 mL 10 毫升中回收和清洗颗粒, 在 8100 x 克的情况下, 在 8100 x g 处溶解上清液10分钟。
- 将颗粒悬浮在200μl 的隔离介质中, 放在冰上, 直到用于耗氧和质子泄漏动力学检测。
- 根据制造商的协议, 以 bsa 为标准, 使用双氯苯酸 (bca) 试剂盒确定颗粒悬浮液 (半稀释) 的蛋白质浓度。所有蛋白质都被认为是线粒体蛋白。
3. 测量线粒体耗氧量 (第3个州和4号州)
- 从 120 mm kcl、5 mm kh 2 po 4、5 mm mgcl2、5 mm 肝和 1 mm egta 创建耗氧介质 (ocm), ph 值7.4 在30°c 下, 脱脂 bsa 为 0.3%.每个样品大约需要3毫升。还在乙醇中制备了8μgml 寡霉素溶液。
- 在30°c 下培养 ocm。根据制造商的发展方向 (氧图系统) 设置呼吸室、泵和氧电极。应已在计算机上安装了氧图软件。
- 将 ocm 的1毫升放入呼吸室, 用力搅拌。这将有助于确保溶液中充满空气。
- 将0.35 毫克的线粒体蛋白添加到呼吸室, 并将温度保持在30°c。
- 记录耗氧量约5分钟。氧图系统记录氧浓度, 随着呼吸的增加, 氧浓度降低。当耗氧量变为恒定 (一条下降的直线) 时, 记录耗氧量 (线的斜率 = 氧气浓度)。这是基准耗氧量。
- 加入1.25μl 的 4 mm 鱼烯酮溶液来抑制复合 i, 然后加入5μl 的 1 m 琥珀酸溶液, 在琥珀酸 5 mm 的呼吸室中达到最终浓度。这是状态4呼吸。
- 加入1μl 的 100 mm adp 溶液, 在100μm 的呼吸室中达到最终浓度。氧气浓度将减少 (增加的呼吸), 然后在大约5分钟以后成为一条直线。记录耗氧量 (线的斜率 = 氧气浓度/时间)。这是状态3呼吸。
- 可选: 在运行结束时, 添加 fccp (0.2μm 总体积) 以诱导最大呼吸。记录呼吸约 5分钟 (约)。当耗氧量变为不变时, 记录耗氧量。这是最大耗氧量。
- 使用方程计算呼吸控制比 (rcr) 3 耗氧量/状态4耗氧量。
- 将所有的溶液从呼吸室中取出。用双去离子水冲洗几次室。
4. 线粒体膜电位 (mmp) 和质子作用力 (pmf) 的测量
- 在乙醇中制备 80 ngml nigericin 溶液。
注: 这些化学物质溶解在乙醇中, 应尽一切努力将添加的乙醇用量限制在低于1μl 的范围内, 因为乙醇会使电子输运系统解联并导致 mitch病症功能障碍。 - 用双去离子水彻底冲洗腔后, 将 ocm 的1毫升放入呼吸室, 用磁搅拌杆大力搅拌。这将有助于确保溶液中充满空气。在室内设置中加入甲基三苯基磷 (tpmp +) 敏感电极。tpmp + 电极应连接到 ph 计, 并从 ph 计读取值。
- 在呼吸室加入0.35 毫克的线粒体蛋白。
- 加入1.25μl 的 4 mm 鱼藤酮溶液, 以抑制复杂 i. 记录呼吸 2-5 (约)。当耗氧量变为不变时, 记录耗氧量。
- 加入0.56 微克/升寡霉素溶液, 最终浓度为2.8 微克寡霉素/0.56 毫克的线粒体蛋白, 以抑制 adp 的利用。记录呼吸 2-5 (约)。当耗氧量变为不变时, 记录耗氧量。
- 加入 0.1μl 80ng/ml nigericin 溶液, 废除线粒体内膜的 ph 梯度。记录呼吸 2-5 (约)。当耗氧量变为不变时, 记录耗氧量。
注: 罗氏酮和寡霉素分别用于阻断复杂 i 和 atp 合酶的电子传输链。添加尼日利亚蛋白是为了将跨膜 h + 梯度转换为 k + 梯度, 可以用电极测量。 - 在线粒体培养中加入5μl 的 10mm tmp + 溶液, 为 tpmp + 准备一个标准曲线。再重复这一步四次, 直到添加了2.5 微米 tmp + 的总浓度。
- 在腔内加入5μl 的1m。
- 记录呼吸, 直到你达到了一个稳定的跟踪, 然后滴定系统通过添加丙二酸。丙二酸盐的添加应为0.5μl、1μl、1.5μl、3.0μl、9.0μl, 然后为 0.1 mm 丙二酸溶液的12.5 μl, 以实现在0.1、0.2、0.3、0.6、1.2、1.8、1.8 和 2.5 mm 的培养室中连续添加丙二酸盐浓度。
- 收集两个电极 (氧气和 tpmp+) 的数据。氧图系统的数据采集软件可用于收集线粒体耗氧量和线粒体膜电位的同步测量, 并实时观察耗氧量的变化。图 14显示了随着实验的进展, 氧谱系统是如何记录耗氧量的。
- 根据 nernst 方程计算 mv 中的 mmp:
mmp = 61.5 日志 ([tpmp +] 添加–外部 [tpmp +]) x tpmp + 结合校正/(0.001 x 蛋白醇 x [tpmp +])
采用 tpmp + 线粒体蛋白-1 0.4μlmg 的结合校正方法。
基于协议中浓度的示例计算:
mmp = 61.5 x 日志 (5μm–2μm) x 0.4/(0.001 x 0.001 毫克线粒体蛋白/毫升 x 2μm)
mmp = 198.9 mv - 通过绘制 mmp与耗氧量的图来估计 pmf (图 15)。据报道, 在膜电位为 165 mv 的情况下, pmf 为耗氧量。
注: 用丙二酸 (0.1 至 2.5 mm) 滴定电子传输链显示质子泄漏对 mmp 的动力学响应。然后, 针对耗氧量绘制 mmp, 确定质子泄漏动力学。pmf 是通过计算普通膜电位 (165 mv) 的耗氧量来确定的。 - 在样品的最后一次运行结束时, 加入 fccp (0.2μm 总体积) 以诱导最大呼吸, 并释放 tmp + 进行基线校正。
- 将所有的溶液从呼吸室中取出。用双去离子水冲洗几次室。在一天结束时, 腔内也应用乙醇冲洗几次。
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Representative Results
表 1和图 15分别显示了 rcr 和质子泄漏动力学的阳性结果。本研究7在牛奶中喂养了5个不同水平的铜、锌和锰中的1种, 并在牛奶中测定了荷斯坦奶牛的 rcr 和蛋白质泄漏动力学。状态 4, 最大质子泄漏依赖呼吸, 有倾向于受矿物摄入铜, 锰和锌 (p & lt; 0.1)。状态 3 (最大 atp 刺激呼吸) 和 rcr = 状态 3/状态 4 (呼吸控制率) 不受矿物质摄入的影响。状态4呼吸在 lowmn 最高, 在控制中最低, 这表明 mn 在最大限度地减少与质子泄漏有关的呼吸方面起着重要作用。锰, 通过酶 mn 超氧化物歧化酶是已知的, 以减少活性氧在线粒体基质和减少质子泄漏12。较高的状态4呼吸与较低的牛奶和牛奶蛋白产量有关。由于质子泄漏是能源效率的重要组成部分, 通过补锰来降低状态4的呼吸可以提高效率。
| 治疗1 | ||||||
| 高 | 地中海 | 低 | lowmn | 控制 | Sem | |
| 牛奶, 公斤 | 474万ab | 50.9a | 46.0ab | 43.6b | 49.7a | 2。9 |
| 牛奶蛋白, 公斤 | 1.38ab | 1.44a | 1.40ab | 1.23b | 1.43a | 0.09 |
| 状态3 | 75。8 | 64。4 | 78。2 | 73 | 64。1 | 13 |
| 州4 | 26.2ab | 22.6ab | 25.9ab | 27.1a | 22.0b | 3个 |
| rcr | 2.89 | 2.76 | 2.98 | 2.65 | 2.83 | 0.27 |
| a b行内的均值不跟在同一个上标字母后面有显著差异 (p & lt; 0.1)。 | ||||||
| 1高处理中含有最高水平的铜、锌和锰都远远高于要求13, med 处理中位水平的铜、锌和锰高于要求, 低处理含有较低的铜、锌和锰水平, 但仍高于要求要求, 低锰处理包含最低的锰水平 (和较低的铜和锌水平), 但仍然高于要求和控制处理包含最低水平的铜和锌, 这接近要求。 | ||||||
表 1: 补充铜、锰和锌对奶牛70天牛奶中肝脏线粒体耗氧量和产奶量的影响。该表格改编自提太等人, 2017年7。
线粒体质子泄漏是一个过程, 通过质子在线粒体内膜上的运动来消散 mmp, 而不会产生 atp14。质子泄漏动力学是通过计算在165mv 的普通膜电位下的耗氧率来评估的。较低的膜电位意味着质子在线粒体膜上 "泄漏", 从而导致 atp 合成较低 (图 15)。在荷斯坦奶牛研究中, 肝质子泄漏依赖性呼吸在洛蒙的支持最大, 在对照中最低, 这与表 1中的结果一致, 即国家4的呼吸在洛蒙最大, 在对照中最低。
图 15。质子泄漏动力学在荷斯坦奶牛喂养不同数量的铜, 锰和锌。本图是根据 Acetoze等人 2017年的数据绘制的。请点击这里查看此图的较大版本.
负面结果如表 2和图 16所示。从低 rfi 公牛出生的安格斯钢的饲料效率 (rfi) 高于高 rfi 公牛, 但这并没有反映在线粒体 rcr (表 2) 或质子泄漏动力学 (图 16) 中。不同组的线粒体呼吸和质子泄漏动力学没有差异, 但 rfi 有差异。在高和低 rfi转向器中, 肝线粒体质子泄漏也没有差异 (p = 0.88) (图 16)。线粒体呼吸测量存在较大的标准误差, 质子泄漏动力学曲线为平面。这项研究的肝脏样本是在屠宰蒸手后获得的, 这一过程将肝脏样本的采集和处理推迟了一个小时。线粒体呼吸量的变化可能反映了组织死亡引起的线粒体呼吸退化。质子泄漏动力学线是平的, 因为氧气消耗测量直到8分钟才开始, 因为由于设备故障已经达到了高原。
| 低 rfi | 高 rfi | Sem | p值 | |
| (n=7) | (n=8) | |||
| 射频 干扰 | -0.58 | -0.01 | 0。1 | 0.05 |
| 状态3 | 31。3 | 30。8 | 9.42 | 0。9 |
| 州4 | 9.76 | 10。4 | 3.23 | 0。8 |
| rcr | 3.05 | 3.03 | 0.24 | 0.93 |
表 2: 高和低残留饲料摄入 (rfi) 安格斯牛后代的性能和线粒体呼吸。该表格改编自提太等人, 2015年11。
图 16。质子泄漏动力学的后代高和低 rfi 安格斯公牛。本图改编自提太等人, 2015年11。请点击这里查看此图的较大版本.
图 1: 位于车辆后部和牛笔外的手术和活检材料的清洁区域。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 使用绑在头锁交叉杆上的吊环约束牛。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: 牛的区域清洁活检和位置活检在正确的10-11 海岸间空间发现的一条直线从正确的块茎 coxae 到右肩点。活检部位是这条线与10-11th 跨海岸空间相交的地方。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4: 将牛的10厘米面积剃须准备消毒进行活检。请点击这里查看此图的较大版本.
图 5: 用圆周运动清洗牛的活检区域, 用10% 的方法进行擦洗。请点击这里查看此图的较大版本.
图 6。喷雾活检区与70% 乙醇溶液。请点击这里查看此图的较大版本.
图 7:1: 局部向该区域注入2% 的利多卡因 hcl (10-15 ml), 以提供皮肤麻醉。请点击这里查看此图的较大版本.
图 8: 1-2 厘米的刺伤切口穿过皮肤的10-11th 肋间空间插入活检工具。请点击这里查看此图的较大版本.
图 9: 通过皮肤插入牛肝活检仪器。请点击这里查看此图的较大版本.
图 10: 活检仪器应在轻微的颅骨方向, 同时继续通过横隔膜进入肝脏。请点击这里查看此图的较大版本.
图 11: 1 克肝脏样本从活检仪器转移到法尔科纳管, 运输到线粒体隔离站。请点击这里查看此图的较大版本.
图 12: 缝合皮肤关闭活检切口。请点击这里查看此图的较大版本.
图 13: 用盐酸头孢虫注射头孢菌在颈部皮下注射 0.44 mL/kg 体重。请点击这里查看此图的较大版本.
图 14: oxygraph 软件结果显示了氧气消耗对每种物质的添加反应, 以测量线粒体膜电位 (mmp) 和质子动力 (pmf)。请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
该协议中最关键的一点是获得具有代表性的肝脏组织样本, 并在活检后尽快开始分离线粒体。呼吸测量的变化很低 (表 1), 原因是从奶牛到实验室的运输时间很短。为了减少运输时间, 在奶牛场办公室设立了一个小型实验室, 并在收集每个样本时将肝脏样本送到办公室实验室, 以便在活检10分钟内分离线粒体。用 ph 计设置和测试呼吸室和电极 (氧气, tpmp +), 在采集和处理样品的前一天记录质子梯度的差异, 可以避免在质子泄漏中丢失早期测量等故障(图 16)。
由于需要新鲜的肝脏样本和线粒体的快速分离, 一天内可以采集和处理的样本数量有限。每个样品大约需要5-6 才能完成;因此, 每天只能收集和分析每个呼吸室的5个样本。这不是一种高吞吐量方法, 而是一种高吞吐量方法。处理的样本量是有限的, 小的误差可以增加变异性与结果和检测意义的能力。
分离技术可能会排除一些与某些细胞成分相关并残留在颗粒中的线粒体, 或者较小的线粒体在离心步骤中可能会在颗粒清洗中丢失。这可能会导致结果不能反映线粒体的完整种群。线粒体可以根据生理状态 (如饥饿和运动 (训练)15而改变大小和密度。使用柠檬酸合酶16或琥珀酸脱氢酶17估计具有酶活性的线粒体数量可能需要证实发现。
对啮齿类动物中建立的线粒体分离18、呼吸19和质子泄漏动力学20的原始技术没有进行任何修改。根据线粒体的组织来源和实验治疗, 可以对这一技术进行修改。bsa (脱脂) 用于结合组织中的游离脂肪酸。如果组织有大量与之相关的脂肪酸 (大于 10%), 则可以添加更多脱脂 bsa, 因为游离脂肪酸会干扰线粒体测量。
使用该技术测量线粒体耗氧量和质子泄漏动力学是标准程序。肝脏一直是首选的组织, 因为它有很多线粒体, 它们相当容易提取, 肝脏是营养物质加工的主要部位。对这一技术的改进已被用来测量其他组织的耗氧量, 如肌肉和乳房。然而, 线粒体分离技术必须修改, 以适应组织。例如, 在肌肉中, 线粒体被嵌入肌肉纤维中, 因此隔离过程必须包括蛋白质消化, 并且必须控制消化, 以确保线粒体功能不受干扰。
还有其他测量线粒体呼吸的方法, 需要专门设计用于测量呼吸的分析仪。细胞必须从组织中采集, 并固定在孵化板上。该分析仪测量整个细胞的耗氧率 (ocr; 基部)、atp 连接 ocr (与线粒体相关)、非线粒体 ocr 和最大 ocr。然而, 由于线粒体在某些孵育过程中受到抑制, 因此无法进行孤立的线粒体测量。这种方法已被用来检查 ocr 的变化与疾病和药物干预21在人类。
当前和未来的应用
质子泄漏对动物能量需求的贡献可能很大, 表明动物的生理状态, 包括生长、哺乳和疾病。在过去, 这种技术已主要用于检查线粒体耗氧量的关联和质子泄漏饲料或能量效率的贡献。然而, 随着我们对线粒体在新陈代谢中的作用的认识不断扩大, 这种技术的重要性也将特别增加, 特别是与其他线粒体措施相结合, 如电子运输链酶活性, 钙细胞凋亡的动态和 tca 周期的酶活性。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项研究得到了 alltech 和 usda 舱口基金通过加州大学戴维斯分校兽医学院食品动物健康中心的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Liver Biopsy | |||
| Equipment | |||
| Schackelford-Courtney bovine liver biopsy instrument | Sontec Instruments Englewood CO | 1103-904 | |
| Suture | Fisher Scientific | 19-037-516 | |
| Suture needles | NA | NA | Included with Suture |
| Scalpels | Sigma - Aldrich | S2896 / S2646 | # for handle and blades |
| Surgery towels | Fisher Scientific | 50-129-6667 | |
| Falcon tubes 50 mL | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Tweezers | Sigma - Aldrich | Z168750 | |
| 50 mL syringes | Fisher Scientific | 22-314387 | |
| Injection needles (22, 2 1/2) | VWR | MJ8881-200342 | |
| Cow halter | Tractor Supply Co. | 101966599 | |
| Cotton swabbing | Fisher Scientific | 14-959-102 | |
| cotton gauze squares (4x4) | Fisher Scientific | 22-246069 | |
| Medical scissors | Sigma - Aldrich | Z265969 | |
| Chemicals | |||
| Coccidiosis Vaccine 0.75 bottle/cow | Provided by Veterinarian | ||
| Clostridia Vaccine | Provided by Veterinarian | ||
| Liver biopsy antibiotics excenel 2 cc/100 lbs for 3 days | Provided by Veterinarian | ||
| Providone Scrub | Aspen Veteterinary Resources | 21260221 | |
| Ethanol 70% | Sigma - Aldrich | 793213 | |
| Xylazine hydrochloride 100 mg/mL IV at 0.010-0.015 mg/kg bodyweight | Provided by Veterinarian | ||
| 2% lidocaine HCl (10-15 mL) | Provided by Veterinarian | ||
| 1 mg/kg IV injection of flunixin meglumine | Provided by Veterinarian | ||
| Isolation of Mitochondria (liver) | |||
| Equipment | |||
| Wheaton vial 30 mL with a Teflon pestle of 0.16 mm clearance | Fisher Scientific | 02-911-527 | |
| Homogenizer Motor | Cole Parmer | EW-04369-10 | |
| Homogenizer Probe | Cole Parmer | EW-04468-22 | |
| Auto Pipette (10 mL) | Cole Parmer | SK-21600-74 | |
| Beaker (500 mL) with ice | Fisher Scientific | FB100600 | |
| Refrigerated microfuge | Fisher Scientific | 75-002-441EW3 | |
| Microfuge tubes (1.5 mL) | Fisher Scientific | AM12400 | |
| Chemicals | |||
| Bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit (microplates for plate reader) | abcam | ab102536 | |
| Sucrose | Sigma - Aldrich | S7903-1KG | |
| Tris-HCl | Sigma - Aldrich | T1503-1KG | |
| EDTA | Sigma - Aldrich | EDS-1KG | |
| BSA (fatty acid free) | Sigma - Aldrich | A7030-50G | |
| Mannitol | Sigma - Aldrich | M4125-1KG | |
| Deionized water | Sigma - Aldrich | 38796 | |
| Hepes | Sigma - Aldrich | H3375-500G | |
| Use to create mitochondria isolation media: 220 mM mannitol, 70 mM sucrose, 20 mM HEPES, 20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, and 0.1% (w/v) fatty acid free BSA, pH 7.4 at 4 °C, will last 2 days in refrigerator | |||
| Mitochondrial Oxygen Comsuption | |||
| Equipment | |||
| Oxygraph Setup + Clark type oxygen electrode | Hansatech (PP Systems) | OXY1 | |
| Thermoregulated Water Pump | ADInstruments | MLE2001 | |
| Clark type Oxygen electrode | NA | NA | |
| Autopipette (1 mL) | Cole Parmer | SK-21600-70 | Included with Oxy1 |
| Small magnetic stir bar | Fisher Scientific | 14-513-95 | |
| Micropipette (10 μL) | Cole Parmer | SK-21600-60 | |
| pH meter | VWR | ||
| Chemicals | |||
| KCl | Sigma - Aldrich | P9333-1KG | |
| Hepes | Sigma - Aldrich | H3375-500G | |
| KH2PO4 | Sigma - Aldrich | P5655-1KG | |
| MgCl2 | Sigma - Aldrich | M1028-100ML | |
| EGTA | Sigma - Aldrich | E3889-100G | |
| Use to make mitochondrial oxygen consumption media: 120 mM KCL, 5 mM KH2PO4, 5 mM MgCl2, 5 mM Hepes and 1 mM EGTA, pH 7.4 at 30 °C with 0.3% defatted BSA | |||
| Rotenone (4 mM solution) | Sigma - Aldrich | R8875-5G | |
| Succinate (1 M solution) | Sigma - Aldrich | S3674-250G | |
| ADP (100 mM solution) | Sigma - Aldrich | A5285-1G | |
| Oligomycin (solution of 8 μg/mL in ethanol) | Sigma - Aldrich | 75351 | |
| FCCP | Sigma - Aldrich | C2920 | |
| Mitochondrial Membrane Potential and Proton Motive Force | |||
| Equipment | |||
| TPMP electrode | World Precision Instruments. | DRIREF-2 | |
| Chemicals-solutions do not need to be fresh but they do need to be kept in a freezer between runs | |||
| Malonate (0.1 mM solution) | Sigma - Aldrich | M1296 | |
| Oligomycin (8 μg/mL in ethanol), keep in freezer | Sigma - Aldrich | 75351 | |
| Nigericin (80 ng/mL in ethanol), keep in freezer | Sigma - Aldrich | N7143 | |
| FCCP | Sigma - Aldrich | C3920 | |
| TPMP | Sigma - Aldrich | T200 | |
| TPMP solution: 10 mM TPMP, 120 mM KCL, 5 mM Hepes and 1 mM EGTA, pH 7.4 at 30 °C with 0.3% defatted BSA |
References
- Brand, M. D., Divakaruni, A. S. The regulation and physiology of mitochondrial proton leak. Physiology. 26, 192-205 (2011).
- Stephenson, E. J., Hawley, J. A. Mitochondrial function in metabolic health: A genetic and environmental tug of war. Biochimica et Biophysica Acta. 1840, 1285-1294 (2014).
- Bartlett, K., Eaton, S. Mitochondrial B oxidation. European Journal of Biochemistry. 271, 462-469 (2004).
- Acetoze, G., Kurzbard, R., Klasing, K. C., Ramsey, J. J., Rossow, H. A. Oxygen Consumption, Respiratory Control Ratio (RCR) and Mitochondrial Proton Leak of broilers with and without growth enhancing levels of minerals supplementation challenged with Eimeria maxima (Ei). Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition. 101, e210-e215 (2016).
- Wallace, D. C., Fan, W. Energetics, epigenetics, mitochondrial genetics. Mitochondrion. 10, 12-31 (2010).
- Paradies, G., Petrosillo, G., Paradies, V., Ruggiero, F. M. Oxidative stress, mitochondrial bioenergetics and cardiolipin in aging. Free Radicals in Biology and Medicine. 48, 1286-1295 (2010).
- Acetoze, G., Champagne, J., Ramsey, J. J., Rossow, H. A. Liver mitochondrial oxygen consumption and efficiency of milk production in lactating Holstein cows supplemented with Copper, Manganese and Zinc. Journal of Animal Physiology Animal Nutrition. 102, e787-e797 (2017).
- Brown, D. R., DeNise, S. K., McDaniel, R. G. Mitochondrial respiratory metabolism and performance of cattle. Journal of Animal Science. 66, 1347-1354 (1988).
- Golden, M. S., Keisler, J. W., H, D. The relationship between mitochondrial function and residual feed intake in Angus steers. Journal of Animal Science. 84, 861-865 (2006).
- Lancaster, P. A., Carstens, G. E., Michal, J. J., Brennan, K. M., Johnson, K. A., Davis, M. E. Relationships between residual feed intake and hepatic mitochondrial function in growing beef cattle. Journal of Animal Science. 92, 3134-3141 (2014).
- Acetoze, G., Weber, K. L., Ramsey, J. J., Rossow, H. A. Relationship between liver mitochondrial respiration and proton leak kinetics in low and high RFI steers from two lineages of RFI Angus bulls. ISRN Vet Sci. 2015 (194014), (2015).
- Halliwell, B., Gutteridge, J. M. C. Protection against oxidants in biological systems: The superoxide theory of oxygen toxicity. Free Radicals in Biology and Medicine. , Oxford University Press. Oxford. 186-187 (1989).
- National Research Council. Nutrient Requirements of Dairy Cattle. , 7th revised edition, National Academy Press. Washington, DC. (2001).
- Ramsey, J. J., Harper, M. E., Weindruch, R. Restriction of energy intake, energy expenditure, and aging. Free Radical Biology and Medicine. 29, 946-968 (2000).
- Mehta, M. M., Weinberg, S. E., Chandel, N. S. Mitochondrial control of immunity: beyond ATP. Nature. 17, 608-620 (2017).
- Kirby, D. M., Thorburn, D. R., Turnbull, D. M., Taylor, R. W. Biochemical assays of respiratory chain complex activity. Methods in Cell Biology. 80, 93-119 (2007).
- Alex, A. P., Collier, J. L., Hadsell, D. L., Collier, R. J. Milk yield differences between 1x and 4x milking are associated with changes in mammary mitochondrial number and milk protein gene expression, but not mammary cell apoptosis or SOCS gene expression. Journal of Dairy Science. 98, 4439-4448 (2015).
- Lossa, S., Lionetti, L., Mollica, M. P., Crescenzo, R., Botta, M., Barletta, A., Liverini, G. Effect of high-fat feeding on metabolic efficiency and mitochondrial oxidative capacity in adult rats. British Journal of Nutrition. 90, 953-960 (2003).
- Boily, G., Seifert, E. L., Bevilacqua, L., He, X. H., Sabourin, G., Estey, C., Moffat, C., Crawford, S., Saliba, S., Jardine, K., Xuan, J., Evans, M., Harper, M. E., McBurney, M. W. SirT1 regulates energy metabolism and response to caloric restriction in mice. PloS One. 3 (3), e1759 (2008).
- Chen, Y., Hagopian, K., Bibus, D., Villaba, J. M., Lopez-Lluch, G., Navas, P., Kim, K., McDonald, R. B., Ramsey, J. J. The influence of dietary lipid composition on liver mitochondria from mice following 1 month of calorie restriction. Bioscience Reports. 33, 83-95 (2013).
- Chacko, B. K., Kramer, P. A., Ravi, S., Benavides, G. A., Mitchell, T., Dranka, B. P., Ferrick, D., Singal, A. K., Ballinger, S. W., Bailey, S. M., Hardy, R. W., Zhang, J., Zhi, D., Darley-Usmar, V. M. The bioenergetic health index: a new concept in mitochondrial translational research. Clinical Science. 127, 367-373 (2014).
