Summary
Her deler vi metoder til måling af mitokondrie iltforbrug, et definerende begrebet ernæringsmæssige energetik og proton lækage, den primære årsag til ineffektivitet i mitokondrie generation af ATP. Disse resultater kan udgøre 30% af den energi tabt i næringsstofudnyttelse til at hjælpe med at evaluere mitokondrie funktion.
Abstract
Forbrug af ilt, proton motiv tvinge (PMF) og proton lækage er målinger af mitokondrie respiration, eller hvor godt mitokondrier er købedygtig omforme NADH og FADH i ATP. Da mitokondrier er også den primære lokalitet for oxygen brug og næringsstof oxidation til CO2 og vand, hvor effektivt de bruger ilt og producerer ATP direkte vedrører effektiviteten af næringsstof metabolisme, næringsstofbehov af dyret, og sundhed af dyret. Formålet med denne metode er at undersøge mitokondrie respiration, som kan bruges til at undersøge virkningerne af forskellige stoffer, kostvaner og miljømæssige effekter på mitokondrie stofskifte. Resultaterne omfatter iltforbrug målt som proton afhængige respiration (tilstand 3) og proton lækage afhængige respiration (status 4). Forholdet mellem staten 3 / stat 4 respiration er defineret som luftvejskontrol ratio (RCR) og kan repræsentere mitokondrie energiske effektivitet. Mitokondrie proton lækage er en proces, der giver mulighed for spredning af mitokondrielle membran potentiale (MMP) ved frakobling oxidativ fosforylering af ADP faldende effektiviteten i ATPsyntesen. Ilt og TRMP + følsomme elektroder med mitokondrie substrater og elektron transport kæde hæmmere anvendes til at måle tilstand 3 og staten 4 respiration, mitokondrielle membran PMF (eller potentiale til at producere ATP) og proton lækage. Begrænsninger til denne metode er at leveren væv skal være så frisk som muligt og alle biopsier og assays skal udføres i mindre end 10 h. Dette begrænser antallet af prøver, der kan indsamles og behandles af en enkelt person i en dag til ca 5. Dog er kun 1 g af levervævet nødvendige, så i store dyr, som malkekvæg, mængden af prøven nødvendige er lille i forhold til leveren størrelse og der er lidt restitutionstid behov.
Introduction
Mitokondrier er meget følsomme over for stress og deres cellulære miljø kan bidrage til en bred vifte af metaboliske sygdomme. Forbrug af ilt og proton lækage i mitokondrier er indikatorer for mitokondrier sundhed. De beskrevne i dette papir skøn mitokondriets energieffektivitet ved hjælp af RCR metoder baseret på iltforbrug med og uden proton lækage. Disse resultater kan udgøre 30% af den energi tabt i næringsstofudnyttelse1. Ændringer i ilt forbrug og proton lækage kan identificere mitokondriel dysfunktion, som bidrager til metabolisk sygdom og resulterer i nedsat energieffektivitet. Disse metoder kan også bruges til at undersøge effekten af forskellige behandlinger på mitokondrie respiration. Det overordnede mål for måling af mitokondrie iltforbrug og proton lækage kinetik er at evaluere mitokondrie-funktion og energiske effektivitet.
Nedsat mitokondriel dysfunktion har været forbundet med flere sygdomme i malkekvæg. Cellulære metabolisme evne til at skifte mellem kulhydrat og lipid brændstoffer når de står med et energi underskud i tidlig laktation er påvirket af den nummer og funktion af mitochondrier i cellen2. Defekter i mitokondrierne evne til at tilpasse sig til en øget efterspørgsel efter energi og øget β-oxidation kan føre til ophobning af intracellulære lipid associeret med insulinresistens og kan føre til dannelse af fedtlever i tidlig laktation malkekøer. Mitokondrierne, kan som stedet for keton organ produktion og anvendelse, spille en nøglerolle i ketosis i malkekøer3. Manglende mitokondrier eller mitokondriel dysfunktion vil påvirke brændstof tilgængelighed til periferien og afspejles i ændringer i forbrug af ilt eller RCR.
Mitokondrie ilt forbrug ændringer som reaktion på betændelse. Syv dage gamle slagtekyllinger blev tilfældigt tildelt en gruppe, der er inficeret med Eimeria maxima og en kontrol gruppe4. Slagtekyllinger, der ikke undergår coccidiose udfordring havde lavere forbrug af ilt på grund af proton lækage og højere RCR med angivelse af at leveren mitokondrier reagere på en immun udfordring ved stigende proton lækage. Mens proton lækage og reaktive ilt arter produktion blev engang betragtet som et tegn på mitokondrielle membran dysfunktion og skadelig for energiske effektivitet, nu det er kendt at det er vigtigt for import af proteiner og calcium til mitokondrier5 , og for generation af varme1.
Elektron lækage fra respiratorisk kæden gør mitokondrier modtagelige for reaktive ilt arter produktion og oxidative skader til mitokondrielle Membranproteiner, lipider og mitokondrie-DNA. Som mitokondrier alder, skaden kan ophobes især til mtDNA forårsager yderligere dysfunktion i mitokondrie stofskifte6 og større modtagelighed af koen til sygdom. I praksis, er mange dyr dyr fodret høje niveauer af kosttilskud såsom Cu, Zn og Mn at øge antioxidant funktion. Men fodring høje niveauer af Cu, Zn og Mn faldt mælkeproduktion og øget iltforbrug på grund af proton lækage (State 4 respiration)7.
Tidligere forskning på rollen mitokondriel funktion i energieffektivitet i kvæg har fokuseret på ændringer i mitokondrie iltforbrug og proton lækage. Meget få undersøgelser er blevet offentliggjort i malkekvæg og de fleste papirer sammenligne produktionseffektivitet i form af resterende foderoptagelse (RFI) til mitokondrie-funktion kødkvæg. Variation i mitokondrie respiration satser blev undersøgt ved måling tilstand 3, stat 4 og RCR i lever fra både ammende Holstein køer og ammende oksekød køer (Angus og Hereford, Brangus)8. Forskerne fandt ikke nogen korrelation i mitokondrie respiration med vækst eller malkning træk for kødkvæg men rapport en korrelation mellem mitokondriel respiration og malkning træk for Holstein. I to undersøgelser, blev RFI sammenlignet i kødkvæg til mitokondrie respiration satser (tilstand 3, stat 4 og RCR) i muskel mitokondrier9,10. Mitokondrie respiration satser ændret svar på DMI og lave priser var forbundet med mindre effektive oksekød stude. I en anden undersøgelse, RFI af stude fra højt eller lavt RFI tyre blev sammenlignet med mitokondrie respiration satser og proton lækage kinetik mellem de to grupper af afkom11. Forskellene skyldtes gevinst bekræfter den konklusion, at få gør ikke virkning mitokondrie respiration i kødkvæg.
I dette papir, et eksperiment undersøger leveren RCR svar på fodring 3 antioxidant mineraler til ammende malkekvæg illustrerer brugen af metoder til at måle iltforbruget under State 4 og 3 respiration og PMF.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metoder, protokol og undersøgelser beskrevet her blev godkendt af institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) fra University of California, Davis.
1. at opnå en leverbiopsi fra Holsten malkeko
Bemærk: En leverbiopsi bør udføres af en autoriseret dyrlæge. Leveren biopsier kan udføres på webstedet mejeri hvor køerne er placeret. Ammende malkekøer kan fortsætte med at blive malket normalt og mælk skal ikke trækkes fra fødevareforsyning før eller efter indgrebet. Det anbefales, at mindst 4 personer er nødvendige for at udføre den leverbiopsi på en malkeko: en dyrlæge til at udføre biopsi, en dyr handler til at stå på koens hip at beskytte biopsi område og dyrlæge, en laborant på ydersiden af pennen til at transf Øh værktøj, materialer og biopsi prøve til og fra dyrlægen og opretholde den rent område, som kan være på bagsiden af et køretøj (figur 1), og en tekniker at hente lever prøven og begynde mitokondrie isolation.
- En måned før leveren biopsier, køer give en clostridia vaccination. Oprette kirurgisk packs ved autoklavering kirurgisk håndklæder, biopsi instrument, skalpel indehavere og kirurgisk udstyr.
- En dag før leverbiopsi, injicere koen med Ceftiofur hydrochlorid 0.044 mL/kg legemsvægt subkutant i nakken. Overvåge ko temperatur, indtagelse og fækal score til brug som en baseline for normal funktion.
- Oprette mitokondrier isolation medier (MIM) containining 220 mM mannitol, 70 mM saccharose, 20 mM HEPES, 1 mM EDTA og 0,1% (w/v) fedtsyre gratis BSA, pH 7,4 ved 4 ° C. Ca. 30 mL pr. prøve vil være nødvendig.
- Dy ko fysisk udnytter en håret med en halterneck efter behov (figur 2). Bruger tøvet, binde hendes hoved til venstre side af standeren. Hvis det er nødvendigt, en kemisk tilbageholdenhed (xylazin hydrochlorid 100 mg/mL IV på 0.010-0,015 mg/kg legemsvægt) kan bruges.
- Området af biopsi er fundet på højre 10 - 11 interkostale rum (figur 3). Tegn en lige linje fra højre knold hofterne til punktet af højre skulder. Webstedet biopsi er, hvor denne linje skærer med 10-11 interkostale rum. Sterilisere området af ko at være biopsi ved barbering en 10 cm firkantet område (figur 4). Vaskes område med 10% providone krat (figur 5) ved hjælp af en cirkulær bevægelse. Spray område med 70% ethanol opløsning (figur 6). Gentag providone og ethanol vasker.
Bemærk: Leveren er i en lidt anden position i Holsten malkekvæg sammenlignet med kødkvæg. - Injicere 2% lidocain HCl (10-15 mL) lokalt til området for at give anæstesi af huden og underliggende muskler og bindevæv (figur 7). Gentag providone og 70% ethanol vasker.
Bemærk: Nerveender i huden og muskel, men ikke indre organer, så kun en lokal anesthestic er nødvendig. På de fleste bør koen kun føle pres og ingen smerter under biopsi proceduren. - Gøre en 1-2 cm stikke-snit gennem huden af den 10-11 interkostale rum (figur 8). Passere en Schackelford-Courtney bovin leverbiopsi instrument gennem huden og direkte biopsi instrument i en lille kraniel retning, mens han fortsatte gennem mellemgulvet og ind i leveren (figur 9, fig. 10). Opnå en 1 g prøve af leveren og fjerne instrument (Figur 11). Lukke huden med sutur placering (figur 12).
- Placer lever prøve i en konisk slange med nok MIM til at dække prøve på ice til øjeblikkelig mitokondrier isolation
- Check indsnit for eventuelle rødme, hævelse, varme, eller smerter inden for 24 timer efter biopsi og injicere koen med Ceftiofur hydrochlorid 0.044 mL/kg legemsvægt subkutant i nakken en gang om dagen for de næste 3 dage (Figur 13). Overvåge koens temperatur, indtagelse og fækal scores dagligt i 1 uge efter leverbiopsi. Hvis en feber udvikler, fortsætte antibiotika efter skøn af dyrlægen.
Bemærk: Hvis en ko udviser tegn på smerter, som sparker på indsnit stedet, recumbancy, rødme, varme eller reaktion at røre inden for 1 time efter leverbiopsi, en 1 mg/kg legemsvægt IV injektion af flunixin meglumine kan bruges til at lindre smerter og betændelse. En anden injektion kan gives, hvis det er nødvendigt. - Fjern suturer 7 dage efter biopsi.
2. isolering af mitokondrier fra malkeko lever
- Hurtigst muligt efter eksemplet leveren er fjernet fra koen, vaske lever prøven i MIM (trin 1.3) til at fjerne røde blodlegemer og fint hakkekød prøven med en saks. Leveren skal være hakket i en kølet bægerglas indeholdende nok isolering medier for at holde væv fugtig.
- Sted hakket leveren i en 30 mL hætteglas med en teflon pistil af 0.16 mm frihøjde inkuberes i isen og indeholdende MIM (1:4 w/v).
- Homogeniseres lever prøven i teflon støder på 500 rpm for en min med 4 slag/min.
Bemærk: Den lever homogenatet er holdt i en is-pakket bægerglas i MIM under hele processen, og alle de følgende trin, centrifugering er afsluttet ved 4 ° C - Centrifugeres homogenatet på 500 x g i 10 min., kassere pellet, overføre supernatanten til en kølet centrifugeglas og derefter centrifugeres den resulterende supernatanten ved 10.000 x g i 10 min at få den mitokondrielle pellet.
- Resuspend og vaske toerstoffet i 10 mL af MIM med fedtsyre gratis BSA og centrifugeres ved 8100 x g i 10 min. Fjern supernatanten.
- Resuspend og vaske toerstoffet i 10 mL af MIM uden fedtsyre gratis BSA og centrifugeres ved 8100 x g i 10 min. Fjern supernatanten.
- Suspendere pellet i 200 µL af isolation medier og Anbring på is indtil bruges til forbrug af ilt og proton lækage kinetic assays.
- Bestemme proteinkoncentration af pellet suspension (1/100 fortynding) ved hjælp Bicinchoninic syre (BCA) kit pr. producentens protokol med BSA som standard. Alle proteiner anses for at være mitokondrie protein.
3. måling af mitokondrie iltforbrug (tilstand 3 og statslige 4)
- Oprette ilt forbrug medier (OCM) fra 120 mM KCl, 5 mM KH2PO4, 5 mM MgCl2, 5 mM Hepes og 1 mM EGTA, pH 7,4 ved 30 ° C, med 0,3% affedtede BSA. Ca. 3 mL per prøve vil være nødvendig. Også forberede en opløsning af 8 μg/mL oligomycinets i ethanol.
- Inkuber OCM ved 30 ° C. Nedsat åndedræt kammer, pumpe og ilt elektrode ifølge producentens anvisninger (oxygraph system). Oxygraph software skal allerede være installeret på computeren.
- 1 mL af OCM i respiration kammer og rør kraftigt. Dette vil hjælpe med at sikre, at løsningen bliver mættet med luft.
- Tilføje 0,35 mg protein af mitokondrielle proteiner til respiration afdeling og vedligeholde temperatur på 30 ° C.
- Optage iltforbrug i ca 5 min. Oxygraph system poster iltkoncentrationen falder så som åndedræt stiger, iltkoncentration. Når iltforbrug bliver konstant (en faldende lige linje), optage iltforbrug (hældningen af linjen = koncentration af ilt/tid). Dette er baseline iltforbrug.
- Tilføje 1,25 µL af 4 mM rotenon løsning til at hæmme kompleks jeg og derefter tilsættes 5 µL 1 M succinat løsning at nå frem til en endelig koncentration i respiratoriske salen på 5 mM succinat. Dette er staten 4 respiration.
- Tilføj 1 µL af 100 mM ADP løsning at nå frem til en endelig koncentration i salen, respiration 100 μm. Iltkoncentrationen formindskes (øget respiration) og derefter efter ca. 5 min. bliver en lige linje. Optage iltforbrug (hældningen af linjen = koncentration af ilt/tid). Dette er staten 3 respiration.
- Valgfrit: I slutningen af flugt, tilføje FCCP (0,2 μM samlede volumen) for at fremkalde maksimal respiration. Optage respiration i ca 5 min (ca). Når iltforbrug bliver konstant, optage iltforbrug. Dette er maksimal iltforbrug.
- Beregne respiratorisk kontrol Ratio (RCR) ved hjælp af ligningen tilstand 3 iltforbrug / stat 4 iltforbrug.
- Opsug alle løsninger ud af respiration salen. Skyl i salen flere gange med dobbelt ionbyttet vand.
4. måling af membran potentiale (MMP) og Proton drivkraft (PMF)
- Forberede løsning af 80 ng/mL nigericin i ethanol.
Bemærk: Disse kemikalier er opløst i ethanol, og bør være gjort alt for at begrænse mængden af ethanol, der er føjet til mindre end 1 μL, da ethanol kan koble elektronen transportsystem og forårsage mitchondrial dysfunktion. - Efter grundigt skylning kammer med dobbelt ionbyttet vand, læg 1 mL af den åbne koordinationsmetode i respiration kammer og rør kraftigt med en magnetisk røre bar. Dette vil hjælpe med at sikre, at løsningen bliver mættet med luft. Tilføje methyl-trifenyl-phosphonium (TPMP +) følsomme elektrode til kammer setup. TPMP + elektrode skal tilsluttes et pH-meter og værdier er læst fra pH-meter.
- Tilføje 0,35 mg af mitokondrielle proteiner til respiration kammer.
- Tilføje 1,25 µL af 4 mM rotenon løsning til at hæmme komplekse I. post respiration for 2-5 min (ca). Når iltforbrug bliver konstant, optage iltforbrug.
- Tilføje 0,56 μL af 8 μg/mL oligomycinets løsning til en endelig koncentration på 2,8 µg oligomycinets /0.35 mg af mitokondrielle proteiner til at hæmme ADP udnyttelse. Optage respiration for 2-5 min (ca). Når iltforbrug bliver konstant, optage iltforbrug.
- Tilføj 0.112 μl 80 ng/mL nigericin løsning for at afskaffe pH gradient over mitokondriets indre membran. Optage respiration for 2-5 min (ca). Når iltforbrug bliver konstant, optage iltforbrug.
Bemærk: Rotenon og oligomycinets bruges til at blokere elektron transport kæde på kompleks og ATPsyntase, henholdsvis. Nigericin er tilføjet til at konvertere transmembrane H + gradient til et K + forløb, der kan måles med en elektrode. - Forbered en standardkurve for TPMP + ved at tilføje 5 µL af 10 mM TPMP + løsning til den mitokondrielle inkubation. Gentag dette trin fire gange mere indtil en samlet koncentration af 2,5 μM TPMP + er blevet tilføjet.
- Indlede åndedræt ved at tilføje 5 μl 1M succinat til salen.
- Optage respiration, indtil du har opnået et stabilt spor, og derefter titreres systemet ved at tilføje malonate. Tilføjelser af malonate bør være 0,5 µL, 1 µL, 1,5 µL, 3,0 µL, 6.0 µL, 9.0 µL, derefter 12,5 µL af 0,1 mM Malonate løsning til at opnå flere på hinanden følgende tilføjelser af malonate koncentrationer i salen, inkubation af 0,1, 0,2, 0,3, 0,6, 1.2, 1.8 og 2.5 mM.
- Indsamle data fra de to elektroder (ilt og TPMP+). Data erhvervelse software fra oxygraph system kan bruges til at indsamle samtidige målinger af mitokondrie iltforbrug og mitokondrielle membran potentiale og observere ændringer i forbrug af ilt i realtid. Figur 14 viser, hvordan oxygraph systemet registrerer iltforbrug efterhånden som eksperimentet skrider frem.
- Beregne MMP i mV baseret på Nernst-ligningen:
MMP = 61,5 log ([TPMP +] tilføjet – ekstern [TPMP +]) x TPMP+ bindende korrektion / (0,001 x mg protein/ml x [TPMP +])
En TPMP + bindende korrektion af 0,4 µL/mg af mitokondrie protein-1 bruges.
Eksempel beregning baseret på koncentrationer i protokollen:
MMP = 61,5 x log (5 µM – 2 µM) x 0,4 / (0,001 x 0,35 mg mitokondrie protein/mL x 2 µM)
MMP = 198.9 mV - Estimat PMF plotte en graf over MMP vs iltforbrug (Figur 15). PMF er rapporteret som iltforbrug på en membran potentiale af 165 mV.
Bemærk: Tilsætningen elektron transportkæden med malonate (0,1 til 2,5 mM) viser den kinetiske svar af proton lækage til MMP. Derefter, plotte MMP mod iltforbrug bestemmer proton lækage kinetik. PMF bestemmes ved at beregne iltforbrug på en fælles membran potentiale (165 mV). - I slutningen af det sidste løb i prøven, tilføje FCCP (0,2 μM samlede volumen) for at fremkalde maksimal respiration og frigive TPMP + til baseline korrektion.
- Opsug alle løsninger ud af respiration salen. Skyl i salen flere gange med dobbelt ionbyttet vand. I slutningen af dagen, bør Parlamentet også skylles et par gange med ethanol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Positive resultater viser RCR og proton lækage kinetik er vist i tabel 1 og Figur 15, henholdsvis. I denne undersøgelse7, RCR og protein lækage blev kinetik målt i Holsten malkekøer på 70 dage i mælk efter køer havde fået 1 af 5 forskellige niveauer af Cu, Zn og Mn i 28 dage. Staten 4, maksimale proton lækage-afhængige respiration, havde en tendens til at blive påvirket af mineral indtagelse af Cu, Mn og Zn (p < 0,1). Tilstand 3 respiration (maksimale ATP stimuleret respiration) og RCR = stat 3 / stat 4 (respiratorisk kontrol ratio) blev ikke påvirket af mineral indtagelse. Staten 4 åndedræt var højest i LowMn og lavest i kontrol, med angivelse af at Mn spiller en vigtig rolle i at minimere proton lækage afhængige respiration. Mangan, gennem enzym Mn superoxiddismutase er kendt for at mindske reaktive ilt arter i mitokondriets matrix og reducere proton læk12. Højere staten 4 åndedræt var forbundet med lavere mælk og protein mælkeydelse. Da proton lækage er et vigtigt element i energi-effektivitet, kunne reduktion af statens 4 respiration gennem Mn tilskud forbedre effektiviteten.
| Behandlinger1 | ||||||
| Høj | Med | Lav | LowMn | Kontrol | SEM | |
| Mælk, kg | 47.4ab | 50,9en | 46.0ab | 43.6b | 49.7en | 2.9 |
| Mælkeprotein, kg | 1,38ab | 1,44en | 1,40ab | 1.23b | 1,43en | 0,09 |
| Tilstand 3 | 75.8 | 64,4 | 78,2 | 73 | 64.1 | 13 |
| Staten 4 | 26,2ab | 22,6ab | 25,9ab | 27,1en | 22,0b | 3 |
| RCR | 2.89 | 2,76 | 2,98 | 2,65 | 2,83 | 0,27 |
| en b Midler inden for en række ikke efterfulgt af den samme hævet bogstav er signifikant forskellige (P < 0,1). | ||||||
| 1 høj behandling indeholder højeste niveauer af Cu, Zn og Mn alt godt over krav13, Med behandling indeholder mellemliggende niveauer af Cu, Zn og Mn over krav, lav behandling indeholder lavere niveauer af Cu, Zn og Mn, men stadig over krav, lav Mn behandling indeholder de laveste niveauer af Mn (og lavere niveauer af Cu og Zn) men stadig over krav og kontrol behandling indeholder de laveste niveauer af Cu og Zn, som er tæt på krav. | ||||||
Tabel 1: effekt af Cu, Mn og Zn tilskud på leveren mitokondrie ilt forbrug og mælk produktion fra malkekøer på 70 dage i mælk. Denne tabel er blevet tilpasset fra Acetoze et al. 20177.
Mitokondrie proton lækage er en proces, der afleder MMP gennem bevægelse af protoner på tværs af den indre membran uden produktionen af ATP14. Proton lækage kinetik er vurderet ved beregning af satser for iltforbrug på en fælles membran potentiale af 165 mV. En lavere membran potentiale betyder, at protoner 'lækker' på tværs af de mitokondrielle membran, som resulterer i lavere ATPsyntesen (Figur 15). I Holsten ko undersøgelse var hepatisk proton lækage afhængige åndedræt størst i LowMn og lavest i kontrol, der er enig med resultaterne i tabel 1, at staten 4 åndedræt var størst i LowMn og lavest i kontrol.
Figur 15. Proton lækage kinetik hos Holstein køer fodret med forskellige mængder af Cu, Mn og Zn. Denne graf er baseret på data fra Acetoze et al. 20177. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Negative resultater er illustreret i tabel 2 og Figur 16. Foderudnyttelsen (RFI) var højere i Angus stude født fra lav RFI tyre end høj RFI tyre, men dette blev ikke afspejlet i mitokondrie RCR (tabel 2) eller proton lækage kinetik (Figur 16). Der var ingen forskel i mitokondrie respiration og proton lækage kinetik mellem grupper af stude, men der var en forskel i RFI. Der var også nogen forskelle (p = 0,88) i leverens mitokondrie proton lækage i høj og lav RFI stude (Figur 16). Der var store standard fejl i forbindelse med mitokondrie respiration målinger, og proton lækage kinetic kurver var flad. Leveren prøver fra denne undersøgelse blev indhentet efter stude blev slagtet, en proces, der forsinkede lever prøve indsamling og bearbejdning af en time. Variation i mitokondrie respiration foranstaltninger kan afspejle mitokondrie respiration nedbrydning som følge af vævsdød. Proton lækage kinetic linjer var flad fordi ilt forbrug målinger ikke begynder indtil 8 min. Når plateauet havde allerede nået på grund af en fejlfunktioner i udstyr.
| Lav RFI | Høj RFI | SEM | P -værdi | |
| (n = 7) | (n = 8) | |||
| RFI | -0.58 | -0.01 | 0,1 | 0,05 |
| Tilstand 3 | 31,3 | 30,8 | 9,42 | 0,9 |
| Staten 4 | 9.76 | 10.4 | 3.23 | 0,8 |
| RCR | 3,05 | 3,03 | 0,24 | 0,93 |
Tabel 2: ydeevne og mitokondriel respiration af høj og lav resterende Feed indtag (RFI) Angus tyren afkom. Denne tabel er blevet tilpasset fra Acetoze et al. 201511.
Figur 16. Proton lækage kinetik for afkom af høj og lav RFI Angus tyre. Denne graf er blevet tilpasset fra Acetoze et al. 201511. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 1: rydde området for kirurgisk og biopsi materialer beliggende på bagsiden af et køretøj og uden for ko pen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: tilbageholdenhed koens ved hjælp af en grime bundet til et korset pol på hovedet låsen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: området i ko til at rense for biopsi og placering af biopsi på højre 10 - 11 interkostale rum findes ved at tegne en lige linje fra højre knold hofterne til punktet af højre skulder. Webstedet biopsi er, hvor denne linje skærer med 10-11 interkostale rum. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: barbering en 10 cm område af ko til at forberede sig på at sterilisere for biopsi. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: vaske biopsi område af koen med 10% providone krat ved hjælp af en cirkulær bevægelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6. Spray biopsi område med 70% ethanol opløsning. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: injicere 2% lidocain HCl (10-15 mL) lokalt til området for at give anæstesi af huden. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8: en 1-2 cm stikke-snit gennem huden af den 10-11 interkostale plads til at indsætte biopsi værktøj. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 9: indsættelse af kvæg leverbiopsi instrument gennem huden. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 10: biopsi instrument bør rettes i en lille kraniel retning, mens han fortsatte gennem mellemgulvet og i leveren. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 11: en 1 g prøve af leveren bliver flyttet fra biopsi instrument til Falconer rør til transport til mitokondrie isolation station. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 12: sutur i huden for at lukke biopsi indsnit. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 13: injektion af ko med Ceftiofur hydrochlorid 0.044 mL/kg legemsvægt subkutant i nakken. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 14: Oxygraph software resultater viser ilt forbrug svar til tilsætning af hvert stof til at måle mitokondrielle membran potentiale (MMP) og proton motiv tvinge (PMF). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det mest kritiske punkt i protokollen at opnå en repræsentativ lever vævsprøve og begynder isolering af mitokondrier hurtigst muligt efter biopsi. Variation i respiration målinger er lavt (tabel 1) på grund af en kort transporttid fra ko til laboratorium. For at reducere transporttiden, en lille laboratorium blev oprettet i office af mejeriet, og leveren prøver blev kørt til office laboratorium, som hver blev indsamlet, således at mitokondrier var isoleret inden for 10 min af biopsi. Opsætning og afprøvning af respiration kammer og elektroder (ilt, TPMP +) med pH-meteret anvendes til at registrere forskellene i proton forløb dagen før indsamling og behandling af prøver kan undgå funktionsfejl såsom manglende tidlige målinger i proton lækage kinetik (Figur 16).
På grund af behovet for frisk lever prøver og hurtige isolering af mitokondrier er antallet af prøver, der kan indsamles og behandles i en dag begrænset. Hver prøve tager ca 5-6 h at fuldføre; Derfor kan kun omkring 5 prøver pr. dag indsamlet og analyseret pr. respiration kammer. Dette er ikke en høj overførselshastighed metode; stikprøvestørrelse for behandlinger er begrænset og små fejl kan øge variabilitet forbundet med resultater og evne til at detektere betydning.
Isolation teknik kan udelukke nogle mitokondrier, der er forbundet med nogle celle komponenter og forbliver integreret i pellet eller mindre mitokondrier kan gå tabt i pellet vasker under centrifugering trin. Dette kan føre til resultater, der ikke afspejler den komplette befolkning af mitokondrier. Mitokondrier kan ændre i størrelse og tæthed afhængigt af fysiologiske stater som sult og motion (uddannelse)15. Estimering af mitokondrie antal med enzymaktivitet ved hjælp af citrat syntase16 eller succinat dehydrogenase17 til at underbygge konklusionerne kan være nødvendig.
Ingen ændringer blev foretaget til de oprindelige teknikker etableret i gnavere til mitokondrie isolation18, respiration19 og proton lække kinetik20. Ændringer af denne teknik kan gøres afhængig af væv kilde af mitokondrier og eksperimentelle behandlinger. BSA (affedtede) bruges til at binde frie fedtsyrer i væv. Hvis vævet har en masse af fede syrer (større end 10%) forbundet med det, mere affedtede BSA kan tilføjes, fordi frie fedtsyrer vil forstyrre de mitokondrielle målinger.
Måling af mitokondrie iltforbrug og proton lækage kinetik ved hjælp af denne teknik er den normale procedure. Leveren har været væv af valg, primært fordi det har en masse af mitochondrier, de er ret nemt at udvinde og leveren er den primære lokalitet af næringsstof behandling. Ændringer af denne teknik er blevet brugt til at måle iltforbruget i andre væv som muskler og brystkirtler. Dog skal mitokondrie isolation teknikker ændres for at passe væv. For eksempel, i muskel, mitokondrier er indlejret i muskelfibre og så den isolation Auditproceduren omfatter et protein fordøjelse og fordøjelsen skal kontrolleres for at sikre, at mitokondriel funktion ikke forstyrres.
Der er andre metoder til måling af mitokondrie respiration, der kræver et analyseapparat, specielt designet til at måle åndedræt. Celler skal være høstet fra væv og fastgjort til inkubation plader. Analyzer foranstaltninger hele cellen ilt forbrugssats (OCR; basal), ATP knyttet OCR (forbundet med mitokondrier), nonmitochondrial OCR og maksimal OCR. Men da mitokondrier er hæmmet i løbet af nogle af inkubationen, isolerede mitochondrier målinger er ikke muligt. Denne metode har været brugt til at undersøge OCR ændringer med sygdom og stofmisbrug interventioner21 hos mennesker.
Nuværende og fremtidige programmer
Bidrag af proton lækage til energi krav af dyret kan være store og vejledende af den fysiologiske tilstand af dyret herunder vækst, laktation og sygdom. I fortiden, er denne teknik primært bruges til at undersøge sammenslutningen af mitokondrie iltforbrug og bidrag af proton lækage til foder eller energiske effektivitet. Men som vores forståelse af mitokondrier i metabolisme rolle udvides, betydningen af denne teknik vil også øge især i kombination med andre mitokondrie foranstaltninger som elektron transportkæde enzym aktiviteter, calcium Dynamics i apoptose og enzym aktiviteter af TCA cyklus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Denne forskning blev støttet af Alltech og USDA Hatch midler gennem Center for Food Animal Health ved UC Davis School of Veterinary Medicine.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Liver Biopsy | |||
| Equipment | |||
| Schackelford-Courtney bovine liver biopsy instrument | Sontec Instruments Englewood CO | 1103-904 | |
| Suture | Fisher Scientific | 19-037-516 | |
| Suture needles | NA | NA | Included with Suture |
| Scalpels | Sigma - Aldrich | S2896 / S2646 | # for handle and blades |
| Surgery towels | Fisher Scientific | 50-129-6667 | |
| Falcon tubes 50 mL | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Tweezers | Sigma - Aldrich | Z168750 | |
| 50 mL syringes | Fisher Scientific | 22-314387 | |
| Injection needles (22, 2 1/2) | VWR | MJ8881-200342 | |
| Cow halter | Tractor Supply Co. | 101966599 | |
| Cotton swabbing | Fisher Scientific | 14-959-102 | |
| cotton gauze squares (4x4) | Fisher Scientific | 22-246069 | |
| Medical scissors | Sigma - Aldrich | Z265969 | |
| Chemicals | |||
| Coccidiosis Vaccine 0.75 bottle/cow | Provided by Veterinarian | ||
| Clostridia Vaccine | Provided by Veterinarian | ||
| Liver biopsy antibiotics excenel 2 cc/100 lbs for 3 days | Provided by Veterinarian | ||
| Providone Scrub | Aspen Veteterinary Resources | 21260221 | |
| Ethanol 70% | Sigma - Aldrich | 793213 | |
| Xylazine hydrochloride 100 mg/mL IV at 0.010-0.015 mg/kg bodyweight | Provided by Veterinarian | ||
| 2% lidocaine HCl (10-15 mL) | Provided by Veterinarian | ||
| 1 mg/kg IV injection of flunixin meglumine | Provided by Veterinarian | ||
| Isolation of Mitochondria (liver) | |||
| Equipment | |||
| Wheaton vial 30 mL with a Teflon pestle of 0.16 mm clearance | Fisher Scientific | 02-911-527 | |
| Homogenizer Motor | Cole Parmer | EW-04369-10 | |
| Homogenizer Probe | Cole Parmer | EW-04468-22 | |
| Auto Pipette (10 mL) | Cole Parmer | SK-21600-74 | |
| Beaker (500 mL) with ice | Fisher Scientific | FB100600 | |
| Refrigerated microfuge | Fisher Scientific | 75-002-441EW3 | |
| Microfuge tubes (1.5 mL) | Fisher Scientific | AM12400 | |
| Chemicals | |||
| Bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit (microplates for plate reader) | abcam | ab102536 | |
| Sucrose | Sigma - Aldrich | S7903-1KG | |
| Tris-HCl | Sigma - Aldrich | T1503-1KG | |
| EDTA | Sigma - Aldrich | EDS-1KG | |
| BSA (fatty acid free) | Sigma - Aldrich | A7030-50G | |
| Mannitol | Sigma - Aldrich | M4125-1KG | |
| Deionized water | Sigma - Aldrich | 38796 | |
| Hepes | Sigma - Aldrich | H3375-500G | |
| Use to create mitochondria isolation media: 220 mM mannitol, 70 mM sucrose, 20 mM HEPES, 20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, and 0.1% (w/v) fatty acid free BSA, pH 7.4 at 4 °C, will last 2 days in refrigerator | |||
| Mitochondrial Oxygen Comsuption | |||
| Equipment | |||
| Oxygraph Setup + Clark type oxygen electrode | Hansatech (PP Systems) | OXY1 | |
| Thermoregulated Water Pump | ADInstruments | MLE2001 | |
| Clark type Oxygen electrode | NA | NA | |
| Autopipette (1 mL) | Cole Parmer | SK-21600-70 | Included with Oxy1 |
| Small magnetic stir bar | Fisher Scientific | 14-513-95 | |
| Micropipette (10 μL) | Cole Parmer | SK-21600-60 | |
| pH meter | VWR | ||
| Chemicals | |||
| KCl | Sigma - Aldrich | P9333-1KG | |
| Hepes | Sigma - Aldrich | H3375-500G | |
| KH2PO4 | Sigma - Aldrich | P5655-1KG | |
| MgCl2 | Sigma - Aldrich | M1028-100ML | |
| EGTA | Sigma - Aldrich | E3889-100G | |
| Use to make mitochondrial oxygen consumption media: 120 mM KCL, 5 mM KH2PO4, 5 mM MgCl2, 5 mM Hepes and 1 mM EGTA, pH 7.4 at 30 °C with 0.3% defatted BSA | |||
| Rotenone (4 mM solution) | Sigma - Aldrich | R8875-5G | |
| Succinate (1 M solution) | Sigma - Aldrich | S3674-250G | |
| ADP (100 mM solution) | Sigma - Aldrich | A5285-1G | |
| Oligomycin (solution of 8 μg/mL in ethanol) | Sigma - Aldrich | 75351 | |
| FCCP | Sigma - Aldrich | C2920 | |
| Mitochondrial Membrane Potential and Proton Motive Force | |||
| Equipment | |||
| TPMP electrode | World Precision Instruments. | DRIREF-2 | |
| Chemicals-solutions do not need to be fresh but they do need to be kept in a freezer between runs | |||
| Malonate (0.1 mM solution) | Sigma - Aldrich | M1296 | |
| Oligomycin (8 μg/mL in ethanol), keep in freezer | Sigma - Aldrich | 75351 | |
| Nigericin (80 ng/mL in ethanol), keep in freezer | Sigma - Aldrich | N7143 | |
| FCCP | Sigma - Aldrich | C3920 | |
| TPMP | Sigma - Aldrich | T200 | |
| TPMP solution: 10 mM TPMP, 120 mM KCL, 5 mM Hepes and 1 mM EGTA, pH 7.4 at 30 °C with 0.3% defatted BSA |
References
- Brand, M. D., Divakaruni, A. S. The regulation and physiology of mitochondrial proton leak. Physiology. 26, 192-205 (2011).
- Stephenson, E. J., Hawley, J. A. Mitochondrial function in metabolic health: A genetic and environmental tug of war. Biochimica et Biophysica Acta. 1840, 1285-1294 (2014).
- Bartlett, K., Eaton, S. Mitochondrial B oxidation. European Journal of Biochemistry. 271, 462-469 (2004).
- Acetoze, G., Kurzbard, R., Klasing, K. C., Ramsey, J. J., Rossow, H. A. Oxygen Consumption, Respiratory Control Ratio (RCR) and Mitochondrial Proton Leak of broilers with and without growth enhancing levels of minerals supplementation challenged with Eimeria maxima (Ei). Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition. 101, e210-e215 (2016).
- Wallace, D. C., Fan, W. Energetics, epigenetics, mitochondrial genetics. Mitochondrion. 10, 12-31 (2010).
- Paradies, G., Petrosillo, G., Paradies, V., Ruggiero, F. M. Oxidative stress, mitochondrial bioenergetics and cardiolipin in aging. Free Radicals in Biology and Medicine. 48, 1286-1295 (2010).
- Acetoze, G., Champagne, J., Ramsey, J. J., Rossow, H. A. Liver mitochondrial oxygen consumption and efficiency of milk production in lactating Holstein cows supplemented with Copper, Manganese and Zinc. Journal of Animal Physiology Animal Nutrition. 102, e787-e797 (2017).
- Brown, D. R., DeNise, S. K., McDaniel, R. G. Mitochondrial respiratory metabolism and performance of cattle. Journal of Animal Science. 66, 1347-1354 (1988).
- Golden, M. S., Keisler, J. W., H, D. The relationship between mitochondrial function and residual feed intake in Angus steers. Journal of Animal Science. 84, 861-865 (2006).
- Lancaster, P. A., Carstens, G. E., Michal, J. J., Brennan, K. M., Johnson, K. A., Davis, M. E. Relationships between residual feed intake and hepatic mitochondrial function in growing beef cattle. Journal of Animal Science. 92, 3134-3141 (2014).
- Acetoze, G., Weber, K. L., Ramsey, J. J., Rossow, H. A. Relationship between liver mitochondrial respiration and proton leak kinetics in low and high RFI steers from two lineages of RFI Angus bulls. ISRN Vet Sci. 2015 (194014), (2015).
- Halliwell, B., Gutteridge, J. M. C. Protection against oxidants in biological systems: The superoxide theory of oxygen toxicity. Free Radicals in Biology and Medicine. , Oxford University Press. Oxford. 186-187 (1989).
- National Research Council. Nutrient Requirements of Dairy Cattle. , 7th revised edition, National Academy Press. Washington, DC. (2001).
- Ramsey, J. J., Harper, M. E., Weindruch, R. Restriction of energy intake, energy expenditure, and aging. Free Radical Biology and Medicine. 29, 946-968 (2000).
- Mehta, M. M., Weinberg, S. E., Chandel, N. S. Mitochondrial control of immunity: beyond ATP. Nature. 17, 608-620 (2017).
- Kirby, D. M., Thorburn, D. R., Turnbull, D. M., Taylor, R. W. Biochemical assays of respiratory chain complex activity. Methods in Cell Biology. 80, 93-119 (2007).
- Alex, A. P., Collier, J. L., Hadsell, D. L., Collier, R. J. Milk yield differences between 1x and 4x milking are associated with changes in mammary mitochondrial number and milk protein gene expression, but not mammary cell apoptosis or SOCS gene expression. Journal of Dairy Science. 98, 4439-4448 (2015).
- Lossa, S., Lionetti, L., Mollica, M. P., Crescenzo, R., Botta, M., Barletta, A., Liverini, G. Effect of high-fat feeding on metabolic efficiency and mitochondrial oxidative capacity in adult rats. British Journal of Nutrition. 90, 953-960 (2003).
- Boily, G., Seifert, E. L., Bevilacqua, L., He, X. H., Sabourin, G., Estey, C., Moffat, C., Crawford, S., Saliba, S., Jardine, K., Xuan, J., Evans, M., Harper, M. E., McBurney, M. W. SirT1 regulates energy metabolism and response to caloric restriction in mice. PloS One. 3 (3), e1759 (2008).
- Chen, Y., Hagopian, K., Bibus, D., Villaba, J. M., Lopez-Lluch, G., Navas, P., Kim, K., McDonald, R. B., Ramsey, J. J. The influence of dietary lipid composition on liver mitochondria from mice following 1 month of calorie restriction. Bioscience Reports. 33, 83-95 (2013).
- Chacko, B. K., Kramer, P. A., Ravi, S., Benavides, G. A., Mitchell, T., Dranka, B. P., Ferrick, D., Singal, A. K., Ballinger, S. W., Bailey, S. M., Hardy, R. W., Zhang, J., Zhi, D., Darley-Usmar, V. M. The bioenergetic health index: a new concept in mitochondrial translational research. Clinical Science. 127, 367-373 (2014).
