Summary
We delen hier, methoden voor het meten van mitochondriale zuurstofverbruik, een bepalende concept van nutritionele energetics en proton lek, de primaire oorzaak van inefficiëntie in mitochondriale generatie van ATP. Deze resultaten kunnen goed voor 30% van de energie verloren in nutriënten gebruik om te helpen evalueren van mitochondriale functie.
Abstract
Zuurstofverbruik proton motive force (PMF) en proton lek zijn metingen van de mitochondriale ademhaling, of hoe goed de mitochondriën zijn kundig voor bekeerling NADH en FADH in ATP. Aangezien mitochondriën ook de primaire site voor zuurstof gebruik en nutriënten oxidatie in kooldioxide en water zijn, hoe efficiënt ze zuurstof gebruiken en produceren van ATP rechtstreeks betrekking heeft op de efficiëntie van nutriënten metabolisme, voedingsstoffen eisen van het dier, en gezondheid van het dier. Het doel van deze methode is te onderzoeken van mitochondriale ademhaling, die kan worden gebruikt voor het bestuderen van de gevolgen van verschillende drugs, diëten en milieueffecten op mitochondriale metabolisme. Resultaten omvatten zuurstofverbruik gemeten als proton afhankelijke ademhaling (staat 3) en proton lek afhankelijke ademhaling (staat 4). De verhouding tussen staat 3 / staat 4 ademhaling wordt gedefinieerd als respiratoire controle verhouding (RCR) en mitochondriale energetische efficiëntie kan vertegenwoordigen. Mitochondriale proton lek is een proces waarmee dissipatie van Mitochondriale membraanpotentiaal (MMP) door ontkoppelingseiwit oxidatieve fosforylatie van ADP minderen van de efficiëntie van de ATP-synthese. Zuurstof en TRMP + gevoelige elektroden met mitochondriale substraten en elektronentransport keten remmers worden gebruikt als eenheid staat 3 en staat 4 ademhaling, mitochondriale membraan PMF (of het potentieel voor de productie van ATP) en proton lek. Beperkingen van deze methode zijn dat leverweefsel zo vers mogelijk moet en alle biopsies en tests moeten worden uitgevoerd in minder dan 10 h. Dit beperkt het aantal monsters dat kan worden verzameld en verwerkt door één persoon in een dag om ongeveer 5. Echter, slechts 1 g van leverweefsel nodig is, dus in grote dieren, zoals melkvee, de hoeveelheid monster nodig klein ten opzichte van de grootte van de lever is en er weinig hersteltijd nodig is.
Introduction
Mitochondriën zijn zeer gevoelig voor stress en hun cellulaire omgeving kan bijdragen tot een breed scala aan metabole ziekten. Zuurstofverbruik en proton lek in mitochondriën zijn indicatoren voor de gezondheid van de mitochondriën. De methoden die worden beschreven in dit papier schatting mitochondriale energie-efficiëntie met behulp van RCR gebaseerd op zuurstofverbruik met en zonder proton lek. Deze resultaten kunnen goed voor 30% van de energie verloren in nutriënten gebruik1. Wijzigingen in zuurstof verbruik en proton lek herkent mitochondriale dysfunctie die bijdraagt tot metabole ziekte en resulteert in verminderde energie-efficiëntie. Deze methoden kunnen ook worden gebruikt om te onderzoeken van het effect van verschillende behandelingen op mitochondriale ademhaling. Het algemene doel van het meten van mitochondriale zuurstofverbruik en proton lek kinetiek is mitochondriale functie en energetische doeltreffendheid te beoordelen.
Hepatische mitochondriale dysfunctie is gekoppeld aan verschillende ziekten in melkvee. Het vermogen van cellulaire metabolisme om te schakelen tussen koolhydraten en lipide brandstoffen wanneer zij worden geconfronteerd met een energie tekort in begin lactatie wordt beïnvloed door het aantal en de functie van de mitochondriën in de cel2. Defecten in het vermogen van de mitochondriën aan te passen aan een grotere vraag naar energie en hogere β-oxidatie kunnen leiden tot ophoping van intracellulaire lipide geassocieerd met insulineresistentie en kunnen leiden tot de vorming van vette lever in begin lactatie melkkoeien. Mitochondriën, kunnen als de site van keton lichaam productie en gebruik, een belangrijke rol in ketose in melkkoeien3. Een gebrek van de mitochondriën of mitochondriale dysfunctie zal gevolgen hebben voor de beschikbaarheid van de brandstof naar de periferie en worden weerspiegeld in veranderingen in zuurstofverbruik of RCR.
Mitochondriale zuurstof verbruik verandert in reactie op ontsteking. Zeven-dag-oude vleeskuikens werden willekeurig toegewezen aan een groep geïnfecteerd met Eimeria maxima en een controle groep4. Vleeskuikens die coccidiosis uitdaging niet ondergaan had lager zuurstofverbruik als gevolg van proton lek en hogere RCR die aangeeft dat de lever-mitochondria op een immuun uitdaging door toenemende proton lek reageren. Terwijl het proton lek en reactieve zuurstof soorten productie werd ooit beschouwd als een teken van mitochondriale membraan dysfunctie en ten koste van energetische efficiëntie, nu het is bekend dat het belangrijk is voor de invoer van proteïnen en calcium in mitochondriën5 , en voor de opwekking van warmte1.
Elektron lek uit de luchtwegen keten maakt mitochondriën vatbaar voor reactieve zuurstof soorten productie en oxidatieve schade aan mitochondriale membraaneiwitten, lipiden en mitochondriaal DNA. Als mitochondriën leeftijd, schade kan accumuleren vooral aan mtDNA, waardoor verdere dysfunctie in mitochondriale metabolisme6 en grotere gevoeligheid van de koe voor ziekte. In de praktijk worden veel dieren dieren hoge niveaus van supplementen zoals Cu, Zn en Mn te stimuleren anti-oxidant functie gevoed. Echter voeding van hoge niveaus van Cu, Zn en Mn daalde de melkproductie en toegenomen zuurstofverbruik als gevolg van proton lek (staat 4 ademhaling)7.
Eerder onderzoek over de rol van mitochondriale functie in energie-efficiëntie bij runderen heeft gericht op veranderingen in de mitochondriale zuurstofverbruik en proton lek. Weinig studies zijn gepubliceerd in melkvee en de meeste papieren vergelijk productie-efficiëntie in de vorm van residuele voeropname (RFI) aan mitochondriale functie in runderen. Variabiliteit in mitochondriale ademhaling tarieven werden onderzocht door het meten van toestand 3, staat 4 en RCR in levers van zowel zogende Holstein koeien en rundvlees zogende koeien (Angus, Brangus en Hereford)8. De onderzoekers did niet vondst ieder correlatie in mitochondriale ademhaling met groei of eigenschappen voor runderen melken maar een correlatie tussen mitochondriale ademhaling en melken eigenschappen voor Holsteins verslag. In twee studies, bedroeg RFI vergeleken in rundvlees vee naar mitochondriale ademhaling tarieven (staat 3, staat 4 en RCR) in spier mitochondriën9,10. Mitochondriale ademhaling tarieven gewijzigd in reactie op DMI en lage tarieven werden geassocieerd met minder efficiënt rundvlees ossen. In een andere studie, RFI van ossen uit de hoge of lage RFI stieren werden vergeleken met de tarieven van mitochondrial ademhaling en proton lek kinetiek tussen de twee groepen van nakomelingen11. Verschillen waren te wijten aan winst bevestigen de conclusie dat krijgen doet niet effect mitochondriale ademhaling in runderen.
In deze paper, een experiment dat onderzoekt lever RCR in reactie op het vervoederen van 3 antioxidant mineralen aan zogende melkvee het gebruik van methoden illustreert voor het meten van zuurstofverbruik tijdens staat 4 en staat 3 ademhaling en PMF.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle methoden, protocol en studies die hier beschreven werden goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van de Universiteit van Californië, Davis.
1. het verkrijgen van een lever biopsie van een melkkoe van Holstein
Opmerking: Een lever biopsie moet worden uitgevoerd door een erkende dierenarts. Lever biopten kunnen worden uitgevoerd op de zuivel-site waar de koeien zich bevinden. Zogende melkkoeien kunnen blijven normaal worden gemolken en melk hoeft niet te worden onttrokken aan de voedselvoorziening voor of na de ingreep. Het wordt aangeraden dat er minstens 4 personen nodig zijn voor het uitvoeren van de lever biopsie op een melkkoe: een dierenarts uit te voeren van de biopsie, een dierlijke handler te staan op de koemelk hip de biopsie gebied en de dierenarts, een lab technicus op de buitenkant van de pen om transf te beschermen Translator tools, materialen en biopsie proef en naar de dierenarts en handhaven van de schone omgeving, die in de achterkant van een voertuig (Figuur 1), en een technicus worden kan voor het ophalen van de lever monster en beginnen mitochondriale isolatie.
- Één maand vóór de biopsieën van het lever, koeien geven een clostridia vaccinatie. Maken van chirurgische packs door autoclaaf chirurgische handdoeken, biopsie instrument, scalpel houders en chirurgische apparatuur.
- Een dag voordat de lever biopsie, injecteren de koe met Ceftiofur Hydrochloride 0,044 mL/kg lichaamsgewicht subcutaan in de nek. Controleren van de temperatuur van de koe, inname en fecale scores te gebruiken als een basislijn voor normale functie.
- Mitochondriën isolatie media (MIM) containining 220 mM mannitol, sacharose 70 mM, 20 mM HEPES, 1 mM EDTA en 0,1% (g/v) vetzuur gratis BSA, pH 7.4 maken bij 4 ° C. Ongeveer 30 mL per monster nodig zullen zijn.
- Beperken van koe fysiek met behulp van een wurggreep met een halster desgewenst (Figuur 2). Met behulp van de halter, binden haar hoofd naar de linker kant van de staander. Indien nodig, een chemische terughoudendheid (Xylazine hydrochloride 100 mg/mL IV op 0.010-0,015 mg/kg lichaamsgewicht) kan worden gebruikt.
- Het gebied van de biopsie is gevonden op de recht 10 - 11e intercostale ruimte (Figuur 3). Een rechte lijn trekken met de juiste Knol coxae tot het punt van de rechterschouder. De biopsie site is waar deze lijn kruist met de 10-11e intercostale ruimte. Steriliseren van het gebied van de koe als biopsied door het scheren van een 10 cm vierkante ruimte (Figuur 4). Wassen gebied met 10% providone scrub (Figuur 5) met behulp van een cirkelvormige beweging. Spray gebied met 70% ethanol oplossing (Figuur 6). Terugkerende providone en ethanol wast.
Opmerking: De lever is in een enigszins andere positie in Holstein melkvee in vergelijking met runderen. - Injecteren van 2% lidocaïne HCl (10-15 mL) lokaal naar het gebied te verstrekken van de verdoving van de huid en de onderliggende spier en bindweefsel (Figuur 7). Herhaal providone en 70% ethanol wast.
Opmerking: De zenuwuiteinden in de huid en spier, maar geen inwendige organen, dus alleen een lokale anesthestic is nodig. De koe moet hooguit slechts enkele druk en geen pijn voelen tijdens de biopsie-procedure. - Het maken van een steek-incisie van 1-2 cm via de huid van de 10-11e intercostale ruimte (Figuur 8). Doorgeven van een Schackelford-Courtney boviene lever biopsie instrument via de huid en het instrument van de biopsie direct in een lichte craniale richting terwijl het voortdurend door het middenrif en in de lever (Figuur 9, Figuur 10). Verkrijgen van een monster van 1 g van de lever en het verwijderen van het instrument (Figuur 11). Sluit de huid met hechtdraad plaatsing (Figuur 12).
- Leg lever monster in een conische buis met genoeg MIM ter dekking van de steekproef, op ijs voor onmiddellijke mitochondriën isolatie
- Selectievakje ingesneden voor eventuele roodheid, zwelling, warmte, of pijn binnen 24 uur na biopsie en injecteren de koe met Ceftiofur Hydrochloride 0,044 mL/kg lichaamsgewicht subcutaan in de nek eenmaal per dag gedurende de komende 3 dagen (Figuur 13). Controleren dagelijks de koemelk temperatuur, inname en fecale scores voor 1 week na biopsie van de lever. Indien een koorts ontwikkelt, blijven antibiotica ter beoordeling van de dierenarts.
Opmerking: Als een koe is vertonen tekenen van pijn, zoals schoppen op de insnijding site, recumbancy, roodheid, warmte, of reactie te raken binnen 1 uur na de lever biopsie, een 1 mg/kg lichaamsgewicht IV injectie van flunixin meglumine kan worden gebruikt voor het verlichten van pijn en ontsteking. Een tweede injectie kan worden toegediend indien nodig. - Het verwijderen van hechtingen 7 dagen na biopsie.
2. het isoleren van Mitochondria van melkkoe lever
- Zo spoedig mogelijk nadat de lever monster is verwijderd uit de koe, wassen het lever monster in MIM (stap 1.3) te verwijderen van de rode bloedcellen en fijn gehakt van het monster met een schaar. De lever moet worden gehakt in een gekoeld bekerglas van voldoende isolatie media om te houden van het weefsel vochtig.
- Plaats de gehakte lever in een 30 mL glazen ampul met een teflon stamper van 0.16 mm klaring geïncubeerd in ijs en met MIM (1:4 m/v).
- Meng lever monster in teflon stamper bij 500 t/min voor een min met 4 slagen/min.
Opmerking: De lever homogenaat wordt gehouden in een bekerglas van ijs-verpakt in MIM tijdens het hele proces, en alle volgende centrifugeren stappen zijn voltooid bij 4 ° C - Centrifugeer homogenaat bij 500 x g gedurende 10 min, negeren pellet, supernatant overbrengen in een gekoeld centrifugebuis en vervolgens de resulterende supernatant bij 10.000 x g gedurende 10 minuten te verkrijgen van de mitochondriale pellet centrifugeren.
- Resuspendeer en wassen van de pellet in 10 mL MIM met vetzuur gratis BSA samen en centrifugeer bij 8100 x g voor 10 min. Discard supernatant.
- Resuspendeer en wassen van de pellet in 10 mL MIM zonder vetzuur gratis BSA samen en centrifugeer bij 8100 x g voor 10 min. Discard supernatant.
- Suspendeer de pellet in 200 µL van isolatie media en plaats op ijs totdat gebruikt voor zuurstofverbruik en proton lek kinetische testen.
- Bepaal de concentratie van de eiwitten van de pellet schorsing (verdunning 1/100) gebruikend Bicinchoninic zuur (BCA) kit per fabrikant protocol met BSA als norm. Wordt beschouwd als alle eiwitten mitochondriaal eiwit.
3. meting van de mitochondriale zuurstofverbruik (stand 3 en stand 4)
- Zuurstof verbruik media (OCM) maken op basis van 120 mM KCl, 5 mM KH2PO4, 5 mM MgCl2, 5 mM Hepes en 1 mM EGTA, pH 7.4 bij 30 ° C met 0,3% BSA ontvet. Ongeveer 3 mL per monster nodig zullen zijn. Ook bereid een oplossing van 8 μg/mL oligomycin in ethanol.
- Incubeer OCM bij 30 ° C. Ademhaling kamer, pomp en zuurstof-elektrode volgens de aanwijzingen van de fabrikant (oxygraph systeem) ingesteld. De software van de oxygraph moet al geïnstalleerd op de computer.
- 1 mL van de OCM in de ademhaling kamer plaatsen en roer krachtig. Dit zal helpen verzekeren dat de oplossing verzadigd is met lucht.
- 0.35 mg eiwitten mitochondriaal eiwit toevoegen aan de kamer van de ademhaling en temperatuur van 30 ° C.
- Record zuurstofverbruik gedurende ongeveer 5 minuten. De zuurstofconcentratie van oxygraph systeem records zo ademhaling toeneemt, zuurstofconcentratie vermindert. Wanneer wordt het zuurstofverbruik constante (een afnemende rechte lijn), record zuurstofverbruik (helling van lijn = concentratie van zuurstof/tijd). Dit is de basislijn zuurstofverbruik.
- Voeg 1,25 µL van 4 mM rotenon oplossing voor de remming van Complex ik en voeg vervolgens toe 5 µL van 1 M succinaat oplossing tot een uiteindelijke concentratie in de luchtwegen kamer van 5 mM succinaat. Dit is de staat 4 ademhaling.
- Voeg 1 µL van 100 mM ADP oplossing tot een uiteindelijke concentratie in de zaal van de ademhaling van 100 μM. Zuurstofconcentratie zal dalen (verhoogde ademhaling) en vervolgens na ongeveer 5 min verandert in een rechte lijn. Opnemen van zuurstofverbruik (helling van lijn = concentratie van zuurstof/tijd). Dit is de staat 3 ademhaling.
- Optioneel: Aan het einde van de termijn, toevoegen FCCP (0,2 micrometer totaalvolume) om maximale ademhaling. Ademhaling voor ongeveer 5 minuten (ongeveer) opnemen. Wanneer zuurstofverbruik verandert constant, record zuurstofverbruik. Dit is de maximale zuurstofverbruik.
- Berekenen van respiratoire controle Ratio (RCR) met behulp van de vergelijking staat 3 zuurstofverbruik / State 4 zuurstofverbruik.
- Gecombineerd alle oplossingen uit de kamer van de ademhaling. Spoel de kamer meerdere malen met dubbele gedeïoniseerd water.
4. meten van de Mitochondriale membraanpotentiaal (MMP) en Proton Motive Force (PMF)
- Bereid de oplossing van 80 ng/mL nigericin in ethanol.
Opmerking: Deze chemische stoffen zijn opgelost in ethanol, en alles in het werk moet worden gemaakt om de hoeveelheid ethanol die wordt toegevoegd aan minder dan 1 μL, omdat ethanol kan het elektronentransport systeem afkoppelen en mitchondrial dysfunctie veroorzaken te beperken. - Na het grondig spoelen de zaal met dubbele gedeïoniseerd water, plaats 1 mL van de OCM in de zaal van de ademhaling en roer krachtig met een magnetische roer bar. Dit zal helpen verzekeren dat de oplossing verzadigd is met lucht. Methyl-triphenyl-fosfonium (TPMP +) gevoelige elektrode om setup kamer toevoegen. TPMP + elektrode moet worden aangesloten op een pH-meter en waarden van de pH-meter worden gelezen.
- 0.35 mg van mitochondriale eiwit toevoegen aan de kamer van de ademhaling.
- Voeg 1,25 µL van 4 mM rotenon oplossing voor de remming van de ademhaling van de complexe I. Record voor 2-5 min (ongeveer). Wanneer zuurstofverbruik verandert constant, record zuurstofverbruik.
- Toevoegen van 0.56 μL van 8 μg/mL oligomycin oplossing voor een eindconcentratie van 2,8 µg oligomycin /0.35 mg van mitochondriale eiwit voor de remming van ADP gebruik. Opnemen (ongeveer) ademhaling voor 2-5 min. Wanneer zuurstofverbruik verandert constant, record zuurstofverbruik.
- Voeg 0.112 μL 80 ng/mL nigericin oplossing af te schaffen het pH verloop over de mitochondriale binnenste membraan. Opnemen (ongeveer) ademhaling voor 2-5 min. Wanneer zuurstofverbruik verandert constant, record zuurstofverbruik.
Opmerking: Rotenon en oligomycin worden gebruikt voor het blokkeren van elektronentransport ketting op Complex ik en ATP-synthase, respectievelijk. Nigericin is toegevoegd aan de transmembrane H + verloop omzetten in een K + verloop dat kan worden gemeten met een electrode. - Voorbereiden op een standaard curve TPMP + door 5 µL van 10 mM TPMP + oplossing toe te voegen aan de mitochondriale incubatie. Herhaal deze stap vier keer tot een totale concentratie van 2,5 μM TPMP + is toegevoegd.
- Starten ademhaling door 5 μL van 1M succinaat toe te voegen aan de kamer.
- Record ademhaling totdat u een stabiele spoor hebben bereikt, en Titreer vervolgens het systeem door toevoeging van malonaat. Toevoegingen van malonaat moet 0,5 µL 1 µL, 1.5 µL, 3.0 µL, 6.0 µL, 9.0 µL, dan 12,5 µL van 0.1 mM malonaat oplossing om opeenvolgende toevoegingen van malonaat concentraties in de zaal van de incubatie van 0,1 0,2 0,3, 0,6, 1.2, 1.8, en 2,5 mM.
- Gegevens verzamelen van de twee elektroden (zuurstof en TPMP+). De software van de overname van gegevens uit het oxygraph-systeem kan worden gebruikt voor het verzamelen van gelijktijdige metingen van mitochondriale zuurstofverbruik en Mitochondriale membraanpotentiaal en observeren van veranderingen in het zuurstofverbruik in real-time. Figuur 14 toont hoe de oxygraph systeem registreert zuurstofverbruik naarmate het experiment vordert.
- MMP in mV op basis van de Nernst vergelijking worden berekend:
MMP = 61,5 log ([TPMP +] toegevoegd – extern [TPMP +]) x TPMP+ bindende correctie / (0,001 x mg van eiwit/mL x [TPMP +])
Een TPMP + bindende correctie van 0.4 µL/mg van mitochondriale eiwit-1 wordt gebruikt.
Voorbeeld berekening is gebaseerd op concentraties in protocol:
MMP 61,5 x log (5 µM-2 µM) x 0,4 = / (0,001 x 0.35 mg mitochondriale eiwit/mL x 2 µM)
MMP 198.9 = mV - Schatting PMF uitzetten van een grafiek van MMP vs. zuurstofverbruik (Figuur 15). PMF is gerapporteerd als zuurstofverbruik op een membraanpotentiaal van 165 mV.
Opmerking: Titrating van het elektronentransport ketting met malonaat (0.1 tot en met 2.5 mM) toont de kinetische reactie van proton lek aan MMP. MMP samenzwering tegen zuurstofverbruik bepaalt vervolgens, proton lek kinetiek. PMF is bepaald op basis van zuurstofverbruik op een gemeenschappelijke membraanpotentiaal (165 mV). - Toevoegen aan het einde van de laatste run van het monster, FCCP (0,2 micrometer totaalvolume) om maximale ademhaling veroorzaken en release TPMP + voor correctie van de basislijn.
- Gecombineerd alle oplossingen uit de kamer van de ademhaling. Spoel de kamer meerdere malen met dubbele gedeïoniseerd water. Aan het eind van de dag, moet de kamer ook worden gespoeld een paar keer met ethanol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Positieve resultaten tonen de RCR en proton lek kinetiek worden weergegeven in tabel 1 en Figuur 15, respectievelijk. In deze studie7, RCR en eiwit lek kinetiek werden gemeten in Holstein melkkoeien op 70 dagen pas in melk nadat koeien had 1 van 5 verschillende niveaus van Cu, Zn en Mn gevoederd gedurende 28 dagen. Staat 4, maximale proton lek-afhankelijke ademhaling, had de neiging te worden beïnvloed door minerale inname van Mn, Cu en Zn (p < 0.1). Staat 3 ademhaling (maximale ATP gestimuleerd ademhaling) en RCR = staat 3 / 4 (respiratoire controle ratio) van de staat werd niet beïnvloed door minerale inname. Staat 4 ademhaling was in LowMn hoogste en laagste in Control, die aangeeft dat Mn een belangrijke rol speelt bij het minimaliseren van proton lek afhankelijke ademhaling. Mangaan, door middel van het enzym Mn Superoxide Dismutase is bekend dat het verminderen van reactieve zuurstof soorten in de mitochondriale matrix en proton lek12. Hoger staat 4 ademhaling werd geassocieerd met lagere melk en melk eiwit opbrengst. Aangezien proton lek een belangrijk onderdeel van de energie-efficiëntie is, kan vermindering van de staat 4 ademhaling via Mn suppletie efficiënter maken.
| Behandelingen1 | ||||||
| Hoge | Med | Lage | LowMn | Controle | SEM | |
| Melk, kg | 47.4ab | 50.9een | 46.0ab | 43.6b | 49.7een | 2.9 |
| Melkeiwit, kg | 1.38ab | 1,44een | 1,40ab | 1.23b | 1.43een | 0.09 |
| Toestand 3 | 75,8 | 64,4 | 78.2 | 73 | 64.1 | 13 |
| Staat 4 | 26.2ab | 22.6ab | 25.9ab | 27.1een | 22.0b | 3 |
| RCR | 2.89 | 2,76 | 2,98 | 2.65 | 2.83 | 0.27 |
| een b Aanzienlijk verschillen middelen binnen een rij niet gevolgd door de dezelfde superscript letter (P < 0.1). | ||||||
| 1 hoge behandeling bevat hoogste niveaus van Cu, Zn en Mn allemaal ruim boven vereisten13, Med behandeling bevat tussenliggende niveaus van Cu en Zn Mn boven vereisten, lage behandeling bevat lagere niveaus van Cu en Zn Mn maar nog steeds boven eisen, lage Mn behandeling bevat de laagste niveaus van Mn (en lagere niveaus van Cu en Zn) maar nog steeds boven de eisen en controle behandeling staan de laagste niveaus van Cu en Zn, die dicht bij de eisen. | ||||||
Tabel 1: Effect van Cu en Mn Zn suppletie op lever mitochondriale zuurstof verbruik en melk productie van melkkoeien op 70 dagen pas in melk. Deze tabel is aangepast van Acetoze et al. 20177.
Mitochondriale proton lek is een proces dat MMP door de beweging van protonen in het mitochondriale binnenste membraan zonder productie van ATP14 verdwijnt. Proton lek kinetiek worden beoordeeld door de berekening van de tarieven van zuurstofverbruik op een gemeenschappelijke membraanpotentiaal van 165 mV. Een lagere membraanpotentiaal betekent dat protonen 'lekken' over de mitochondriale membraan, wat in lagere ATP-synthese (Figuur 15 resulteert). In de studie van Holstein koe was hepatische proton lek afhankelijke ademhaling grootste in LowMn en het laagst in Control, die instemt met resultaten in tabel 1, dat staat 4 ademhaling was grootste in LowMn en het laagst in controle.
Figuur 15. Proton lek kinetiek in Holstein koeien gevoed verschillende hoeveelheden van Mn, Cu en Zn. Deze grafiek is gebaseerd op gegevens van Acetoze et al. 20177. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Negatieve resultaten worden geïllustreerd in tabel 2 en Figuur 16. Feed-efficiëntie (RFI) was hoger in Angus ossen geboren uit lage RFI stieren dan hoge RFI stieren, maar dit was niet weerspiegeld in de mitochondriale RCR (tabel 2) of proton lek kinetiek (Figuur 16). Er waren geen verschillen in het mitochondriale ademhaling en proton lek kinetiek tussen groepen van ossen, maar was er een verschil in RFI. Er waren ook geen verschillen (p = 0.88) in hepatische mitochondriale proton lekken hoge en lage RFI ossen (Figuur 16). Er waren grote standaardfouten mitochondriale ademhaling metingen is gekoppeld, en proton lek kinetische curven waren plat. Lever monsters uit deze studie werden verkregen na ossen afgeslacht, een proces dat lever monster verzameling en verwerking door een uur vertraagd. Variatie in het mitochondriaal ademhaling maatregelen kan duiden op aantasting van de mitochondriale ademhaling als gevolg van dood weefsel. Proton lek kinetische lijnen waren plat omdat zuurstof verbruik metingen niet tot 8 min begonnen wanneer plateau al als gevolg van een storing van de apparatuur bereikt had.
| Lage RFI | Hoge RFI | SEM | P -waarde | |
| (n = 7) | (n = 8) | |||
| RFI | -0.58 | -0.01 | 0.1 | 0,05 |
| Toestand 3 | 31.3 | 30,8 | 9,42 | 0.9 |
| Staat 4 | 9.76 | 10.4 | 3.23 | 0.8 |
| RCR | 3,05 | 3.03 | 0,24 | 0.93 |
Tabel 2: prestaties en mitochondriale ademhaling van hoge en lage residuele Feed inname (RFI) Angus koe nakomelingen. Deze tabel is aangepast van Acetoze et al. 201511.
Figuur 16. Proton lek kinetiek voor nakomelingen van hoge en lage RFI Angus stieren. Deze grafiek is aangepast van Acetoze et al. 201511. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 1: Reinig gebied voor chirurgische en biopsie materialen, gelegen aan de achterkant van een voertuig en buiten de koe-pen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: terughoudendheid van de koe met behulp van een halter vastgebonden aan een kruis pool van de hoofd lock. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: het gebied van de koe te reinigen voor de biopsie en de locatie van de biopsie op de recht 10 - 11e intercostale ruimte gevonden door een rechte lijn te trekken van de juiste Knol coxae tot het punt van de rechterschouder. De biopsie site is waar deze lijn kruist met de 10-11e intercostale ruimte. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: Shaving een gebied van 10 cm van de koe te bereiden op het steriliseren gedurende de biopsie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: wassen biopsie gebied van de koe met 10% providone scrub met behulp van een cirkelvormige beweging. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6. Spray biopsie gebied gebied met 70% ethanol oplossing. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 7: injecteren van 2% lidocaïne HCl (10-15 mL) lokaal naar het gebied te verstrekken van de verdoving van de huid. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 8: een steek-incisie van 1-2 cm via de huid van de 10-11e intercostale ruimte om in te voegen biopsie gereedschap. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 9: invoeging van boviene lever biopsie instrument via de huid. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 10: de biopsie instrument dienen gericht te worden in een lichte craniale richting terwijl het voortdurend door het middenrif en in de lever. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 11: een 1 g monster van de lever wordt verplaatst van de biopsie instrument naar Falconer buis voor transport naar de mitochondriale isolatie station. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 12: wordt de huid om te sluiten van de biopsie insnijding. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 13: injectie van de koe met Ceftiofur Hydrochloride 0,044 mL/kg lichaamsgewicht subcutaan in de nek. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 14: Oxygraph software resultaten tonen zuurstof verbruik reacties op toevoeging van elke stof voor het meten van de Mitochondriale membraanpotentiaal (MMP) en proton motive force (PMF). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het meest kritieke punt in het protocol is het verkrijgen van een steekproef representatief leverweefsel en beginnen het isolement van de mitochondriën zo spoedig mogelijk na biopsie. Variatie in ademhaling metingen is laag (tabel 1) als gevolg van een korte transporttijd van koe naar laboratorium. Verklein de transporttijd en een klein laboratorium opgericht in het kantoor van de melkerij, en lever monsters naar het laboratorium van office werden verdreven, zoals elk werd verzameld zodat mitochondriën geïsoleerd binnen 10 min van de biopsie werden. Installatie en testen van de kamer van de ademhaling en de elektroden (zuurstof, TPMP +) met de pH-meter gebruikt om record verschillen in proton verlopen de dag voordat het verzamelen en verwerken van monsters Voorkom storingen zoals ontbrekende vroege metingen in proton lek kinetiek (Figuur 16).
Vanwege de behoefte aan verse lever monsters en snelle Isolatievan mitochondriën is het aantal monsters dat kan worden verzameld en verwerkt in een dag beperkt. Elk monster duurt ongeveer 5-6 h te voltooien; Daarom kunnen slechts ongeveer 5 monsters per dag worden verzameld en geanalyseerd per ademhaling kamer. Dit is niet een hoge-doorvoer-methode; de grootte van de steekproef voor behandelingen is beperkt en kleine fouten kunnen verhogen variabiliteit die is gekoppeld aan de resultaten en de mogelijkheid om het detecteren van betekenis.
De isolatie-techniek kan enkele mitochondriën die worden geassocieerd met sommige celbestanddelen en ingebed in de pellet blijven uitsluiten of kleinere mitochondriën in de pellet wast tijdens het centrifugeren stappen mogelijk verloren. Dit kan leiden tot resultaten die niet met de volledige bevolking van mitochondriën overeen komen. Mitochondriën kunnen wijzigen in grootte en bevolkingsdichtheid afhankelijk van fysiologische toestanden zoals honger en oefenen ("opleiding"),15. Schatten van mitochondriale nummer met enzymactiviteit citraat synthase16 of succinaat dehydrogenase17 met bevindingen bevestigen kan nodig zijn.
Geen wijzigingen werden aangebracht in de originele technieken in knaagdieren voor mitochondriale isolatie18, ademhaling19 opgericht en proton lekken kinetiek20. Wijzigingen aan deze techniek kunnen men afhankelijk van weefsel bron van mitochondriën en experimentele behandelingen. BSA (ontvet) wordt gebruikt voor het binden van vrije vetzuren in weefsel. Als het weefsel alot heeft van vetzuren (meer dan 10%) gekoppeld, meer ontvet BSA kan worden toegevoegd omdat vrije vetzuren de mitochondriële metingen zullen verstoren.
Het meten van mitochondriale zuurstofverbruik en proton lek kinetiek met behulp van deze techniek is de standaardprocedure. Lever is het weefsel van keuze geweest, vooral omdat het heeft een heleboel mitochondriën, ze vrij makkelijk zijn te halen en de lever de primaire site van nutriënten verwerking is. Wijzigingen van deze techniek zijn gebruikt voor het meten van zuurstofverbruik in andere weefsels zoals spieren en de borstklieren. Mitochondriale isolatie technieken moeten echter worden gewijzigd om te passen van het weefsel. Bijvoorbeeld, in de spier, mitochondriën zijn ingebed in de spiervezels en dus de isolatie procedure moet bevatten een eiwit spijsvertering en de spijsvertering moeten worden gecontroleerd om ervoor te zorgen dat mitochondriale functie hierdoor niet wordt verstoord.
Er zijn andere methodes voor het meten van mitochondriale ademhaling die een analysator speciaal ontworpen vereisen voor het meten van de ademhaling. Cellen moeten worden geoogst van weefsel en bevestigd aan incubatie platen. De snelheid van analyzer maatregelen hele cel zuurstof verbruik (OCR; basale), ATP gekoppeld OCR (in verband met de mitochondriën), nonmitochondrial OCR en maximale OCR. Echter, aangezien mitochondriën zijn geremd tijdens enkele van de incubatie, geïsoleerde mitochondriën metingen zijn niet mogelijk. Deze methode is gebruikt om te onderzoeken OCR veranderingen met de ziekte en drug interventies21 bij de mens.
Huidige en toekomstige toepassingen
De bijdrage van proton lek om energie-eisen van het dier kunnen grote en indicatief voor de fysiologische toestand van het dier, met inbegrip van groei, lactatie en ziekte. In het verleden, is deze techniek voornamelijk gebruikt te onderzoeken van de vereniging van mitochondriale zuurstofverbruik en bijdrage van proton lek te voeden of energetische efficiëntie. Echter, aangezien ons begrip van de rol van mitochondria in metabolisme groeit, het belang van deze techniek zal ook toenemen vooral in combinatie met andere mitochondriale maatregelen zoals elektronentransport keten enzym activiteiten, calcium dynamiek in apoptosis en enzym-activiteiten van de TCA-cyclus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd gesteund door Alltech en USDA Hatch fondsen door het centrum voor levensmiddelen, diergezondheid bij UC Davis School voor diergeneeskunde.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Liver Biopsy | |||
| Equipment | |||
| Schackelford-Courtney bovine liver biopsy instrument | Sontec Instruments Englewood CO | 1103-904 | |
| Suture | Fisher Scientific | 19-037-516 | |
| Suture needles | NA | NA | Included with Suture |
| Scalpels | Sigma - Aldrich | S2896 / S2646 | # for handle and blades |
| Surgery towels | Fisher Scientific | 50-129-6667 | |
| Falcon tubes 50 mL | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Tweezers | Sigma - Aldrich | Z168750 | |
| 50 mL syringes | Fisher Scientific | 22-314387 | |
| Injection needles (22, 2 1/2) | VWR | MJ8881-200342 | |
| Cow halter | Tractor Supply Co. | 101966599 | |
| Cotton swabbing | Fisher Scientific | 14-959-102 | |
| cotton gauze squares (4x4) | Fisher Scientific | 22-246069 | |
| Medical scissors | Sigma - Aldrich | Z265969 | |
| Chemicals | |||
| Coccidiosis Vaccine 0.75 bottle/cow | Provided by Veterinarian | ||
| Clostridia Vaccine | Provided by Veterinarian | ||
| Liver biopsy antibiotics excenel 2 cc/100 lbs for 3 days | Provided by Veterinarian | ||
| Providone Scrub | Aspen Veteterinary Resources | 21260221 | |
| Ethanol 70% | Sigma - Aldrich | 793213 | |
| Xylazine hydrochloride 100 mg/mL IV at 0.010-0.015 mg/kg bodyweight | Provided by Veterinarian | ||
| 2% lidocaine HCl (10-15 mL) | Provided by Veterinarian | ||
| 1 mg/kg IV injection of flunixin meglumine | Provided by Veterinarian | ||
| Isolation of Mitochondria (liver) | |||
| Equipment | |||
| Wheaton vial 30 mL with a Teflon pestle of 0.16 mm clearance | Fisher Scientific | 02-911-527 | |
| Homogenizer Motor | Cole Parmer | EW-04369-10 | |
| Homogenizer Probe | Cole Parmer | EW-04468-22 | |
| Auto Pipette (10 mL) | Cole Parmer | SK-21600-74 | |
| Beaker (500 mL) with ice | Fisher Scientific | FB100600 | |
| Refrigerated microfuge | Fisher Scientific | 75-002-441EW3 | |
| Microfuge tubes (1.5 mL) | Fisher Scientific | AM12400 | |
| Chemicals | |||
| Bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit (microplates for plate reader) | abcam | ab102536 | |
| Sucrose | Sigma - Aldrich | S7903-1KG | |
| Tris-HCl | Sigma - Aldrich | T1503-1KG | |
| EDTA | Sigma - Aldrich | EDS-1KG | |
| BSA (fatty acid free) | Sigma - Aldrich | A7030-50G | |
| Mannitol | Sigma - Aldrich | M4125-1KG | |
| Deionized water | Sigma - Aldrich | 38796 | |
| Hepes | Sigma - Aldrich | H3375-500G | |
| Use to create mitochondria isolation media: 220 mM mannitol, 70 mM sucrose, 20 mM HEPES, 20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, and 0.1% (w/v) fatty acid free BSA, pH 7.4 at 4 °C, will last 2 days in refrigerator | |||
| Mitochondrial Oxygen Comsuption | |||
| Equipment | |||
| Oxygraph Setup + Clark type oxygen electrode | Hansatech (PP Systems) | OXY1 | |
| Thermoregulated Water Pump | ADInstruments | MLE2001 | |
| Clark type Oxygen electrode | NA | NA | |
| Autopipette (1 mL) | Cole Parmer | SK-21600-70 | Included with Oxy1 |
| Small magnetic stir bar | Fisher Scientific | 14-513-95 | |
| Micropipette (10 μL) | Cole Parmer | SK-21600-60 | |
| pH meter | VWR | ||
| Chemicals | |||
| KCl | Sigma - Aldrich | P9333-1KG | |
| Hepes | Sigma - Aldrich | H3375-500G | |
| KH2PO4 | Sigma - Aldrich | P5655-1KG | |
| MgCl2 | Sigma - Aldrich | M1028-100ML | |
| EGTA | Sigma - Aldrich | E3889-100G | |
| Use to make mitochondrial oxygen consumption media: 120 mM KCL, 5 mM KH2PO4, 5 mM MgCl2, 5 mM Hepes and 1 mM EGTA, pH 7.4 at 30 °C with 0.3% defatted BSA | |||
| Rotenone (4 mM solution) | Sigma - Aldrich | R8875-5G | |
| Succinate (1 M solution) | Sigma - Aldrich | S3674-250G | |
| ADP (100 mM solution) | Sigma - Aldrich | A5285-1G | |
| Oligomycin (solution of 8 μg/mL in ethanol) | Sigma - Aldrich | 75351 | |
| FCCP | Sigma - Aldrich | C2920 | |
| Mitochondrial Membrane Potential and Proton Motive Force | |||
| Equipment | |||
| TPMP electrode | World Precision Instruments. | DRIREF-2 | |
| Chemicals-solutions do not need to be fresh but they do need to be kept in a freezer between runs | |||
| Malonate (0.1 mM solution) | Sigma - Aldrich | M1296 | |
| Oligomycin (8 μg/mL in ethanol), keep in freezer | Sigma - Aldrich | 75351 | |
| Nigericin (80 ng/mL in ethanol), keep in freezer | Sigma - Aldrich | N7143 | |
| FCCP | Sigma - Aldrich | C3920 | |
| TPMP | Sigma - Aldrich | T200 | |
| TPMP solution: 10 mM TPMP, 120 mM KCL, 5 mM Hepes and 1 mM EGTA, pH 7.4 at 30 °C with 0.3% defatted BSA |
References
- Brand, M. D., Divakaruni, A. S. The regulation and physiology of mitochondrial proton leak. Physiology. 26, 192-205 (2011).
- Stephenson, E. J., Hawley, J. A. Mitochondrial function in metabolic health: A genetic and environmental tug of war. Biochimica et Biophysica Acta. 1840, 1285-1294 (2014).
- Bartlett, K., Eaton, S. Mitochondrial B oxidation. European Journal of Biochemistry. 271, 462-469 (2004).
- Acetoze, G., Kurzbard, R., Klasing, K. C., Ramsey, J. J., Rossow, H. A. Oxygen Consumption, Respiratory Control Ratio (RCR) and Mitochondrial Proton Leak of broilers with and without growth enhancing levels of minerals supplementation challenged with Eimeria maxima (Ei). Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition. 101, e210-e215 (2016).
- Wallace, D. C., Fan, W. Energetics, epigenetics, mitochondrial genetics. Mitochondrion. 10, 12-31 (2010).
- Paradies, G., Petrosillo, G., Paradies, V., Ruggiero, F. M. Oxidative stress, mitochondrial bioenergetics and cardiolipin in aging. Free Radicals in Biology and Medicine. 48, 1286-1295 (2010).
- Acetoze, G., Champagne, J., Ramsey, J. J., Rossow, H. A. Liver mitochondrial oxygen consumption and efficiency of milk production in lactating Holstein cows supplemented with Copper, Manganese and Zinc. Journal of Animal Physiology Animal Nutrition. 102, e787-e797 (2017).
- Brown, D. R., DeNise, S. K., McDaniel, R. G. Mitochondrial respiratory metabolism and performance of cattle. Journal of Animal Science. 66, 1347-1354 (1988).
- Golden, M. S., Keisler, J. W., H, D. The relationship between mitochondrial function and residual feed intake in Angus steers. Journal of Animal Science. 84, 861-865 (2006).
- Lancaster, P. A., Carstens, G. E., Michal, J. J., Brennan, K. M., Johnson, K. A., Davis, M. E. Relationships between residual feed intake and hepatic mitochondrial function in growing beef cattle. Journal of Animal Science. 92, 3134-3141 (2014).
- Acetoze, G., Weber, K. L., Ramsey, J. J., Rossow, H. A. Relationship between liver mitochondrial respiration and proton leak kinetics in low and high RFI steers from two lineages of RFI Angus bulls. ISRN Vet Sci. 2015 (194014), (2015).
- Halliwell, B., Gutteridge, J. M. C. Protection against oxidants in biological systems: The superoxide theory of oxygen toxicity. Free Radicals in Biology and Medicine. , Oxford University Press. Oxford. 186-187 (1989).
- National Research Council. Nutrient Requirements of Dairy Cattle. , 7th revised edition, National Academy Press. Washington, DC. (2001).
- Ramsey, J. J., Harper, M. E., Weindruch, R. Restriction of energy intake, energy expenditure, and aging. Free Radical Biology and Medicine. 29, 946-968 (2000).
- Mehta, M. M., Weinberg, S. E., Chandel, N. S. Mitochondrial control of immunity: beyond ATP. Nature. 17, 608-620 (2017).
- Kirby, D. M., Thorburn, D. R., Turnbull, D. M., Taylor, R. W. Biochemical assays of respiratory chain complex activity. Methods in Cell Biology. 80, 93-119 (2007).
- Alex, A. P., Collier, J. L., Hadsell, D. L., Collier, R. J. Milk yield differences between 1x and 4x milking are associated with changes in mammary mitochondrial number and milk protein gene expression, but not mammary cell apoptosis or SOCS gene expression. Journal of Dairy Science. 98, 4439-4448 (2015).
- Lossa, S., Lionetti, L., Mollica, M. P., Crescenzo, R., Botta, M., Barletta, A., Liverini, G. Effect of high-fat feeding on metabolic efficiency and mitochondrial oxidative capacity in adult rats. British Journal of Nutrition. 90, 953-960 (2003).
- Boily, G., Seifert, E. L., Bevilacqua, L., He, X. H., Sabourin, G., Estey, C., Moffat, C., Crawford, S., Saliba, S., Jardine, K., Xuan, J., Evans, M., Harper, M. E., McBurney, M. W. SirT1 regulates energy metabolism and response to caloric restriction in mice. PloS One. 3 (3), e1759 (2008).
- Chen, Y., Hagopian, K., Bibus, D., Villaba, J. M., Lopez-Lluch, G., Navas, P., Kim, K., McDonald, R. B., Ramsey, J. J. The influence of dietary lipid composition on liver mitochondria from mice following 1 month of calorie restriction. Bioscience Reports. 33, 83-95 (2013).
- Chacko, B. K., Kramer, P. A., Ravi, S., Benavides, G. A., Mitchell, T., Dranka, B. P., Ferrick, D., Singal, A. K., Ballinger, S. W., Bailey, S. M., Hardy, R. W., Zhang, J., Zhi, D., Darley-Usmar, V. M. The bioenergetic health index: a new concept in mitochondrial translational research. Clinical Science. 127, 367-373 (2014).
