Summary
Her deler vi metoder for måling mitokondrie oksygenforbruk, en definere begrepet kosttilskudd energi, og proton lekkasje, den primære årsaken til ineffektivitet i mitokondrie generasjon av ATP. Disse resultatene kan utgjør 30% av energien går tapt i næringsstoffer utnyttelse til å vurdere mitokondrie funksjon.
Abstract
Oksygenforbruk, proton motiv kraft (PMF) og proton lekkasjen er målinger av mitokondrie åndedrett, eller hvor godt mitokondrier er kjøpedyktig konvertere NADH og FADH i ATP. Siden mitochondria er også det primære området for bruk av oksygen og næringsstoffer oksidasjon karbondioksid og vann, hvor effektivt de bruker oksygen og produsere ATP direkte gjelder effektiviteten av metabolisme til næringsstoff, næringsinnhold krav for dyret, og helse av dyret. Formålet med denne metoden er å undersøke mitokondrie åndedrett, som kan brukes til å undersøke virkningene av ulike, dietter og miljømessige effekter på mitokondrie metabolismen. Resultatene omfatter oksygenforbruk målt som proton avhengige åndedrett (staten 3) og proton lekkasje avhengige respirasjon (staten 4). Forholdet mellom staten 3 / stat 4 åndedrett defineres som åndedretts kontroll forhold (RCR) og kan representere mitokondrie energisk effektivitet. Mitokondrielt proton lekkasjen er en prosess der spredning av mitokondrie membran potensial (MMP) ved uncoupling oxidative fosforylering fra ADP redusere effektiviteten av ATP syntese. Oksygen og TRMP + følsom elektroder med mitokondrie underlag og elektronet transport kjeden hemmere brukes til å måle staten 3 og staten 4 åndedrett, mitokondrie membran PMF (eller potensial til å produsere ATP) og proton lekkasje. Begrensningene til denne metoden er at leveren vev må være så frisk som mulig og alle biopsier og analyser må utføres i mindre enn 10 h. Dette begrenser antall eksempler som kan samles inn og behandles av en enkelt person i dag å ca 5. Imidlertid er bare 1 g av leveren vev nødvendig, så store dyr, for eksempel melkeku, mengden sample nødvendig er liten i forhold til leveren størrelse og det er lite utvinning tid nødvendig.
Introduction
Mitokondrier er svært følsom for stress og mobilnettet miljøet kan bidra til en rekke metabolske sykdommer. Oksygenforbruk og proton lekkasje i mitokondrier er indikatorer mitokondrier helse. Metodene som er beskrevet i dette papir estimat mitokondrie energieffektiviteten med RCR basert på oksygenforbruk med og uten proton lekkasje. Disse resultatene kan utgjør 30% av energien går tapt i næringsstoffer utnyttelse1. Endringer i oksygen forbruk og proton lekkasjen kan identifisere mitokondrie dysfunksjon som bidrar til metabolsk sykdom og resulterer i redusert energieffektivitet. Disse metodene kan også brukes til å undersøke effekten av ulike behandlinger på mitokondrie åndedrett. Det overordnede målet med måle mitokondrie oksygenforbruk og proton lekkasje kinetics er å vurdere mitokondrie funksjon og energisk effektivitet.
Hepatic mitokondrie dysfunksjon er tilknyttet flere sykdommer i melkeku. Muligheten av cellenes stoffskifte å bytte mellom karbohydrater og lipid brensel Når møtt med en energi underskudd i tidlig amming er påvirket av antall og funksjon av mitokondrier i celle2. Feil i mitokondrier evnen til å tilpasse seg en økt etterspørsel etter energi og økt β-oksidasjon kan føre til opphopning av intracellulær lipid assosiert med insulinresistens og kan føre til dannelse av fettlever i tidlig amming mjølkekyr. Mitochondria, kan som stedet for keton kroppen produksjon og bruk, spille en nøkkelrolle i ketosis i mjølkekyr3. Manglende mitokondrier eller mitokondrie dysfunksjon vil påvirke drivstoff tilgjengelighet til periferien og gjenspeiles endringer i oksygenforbruk eller RCR.
Mitokondrielt oksygen forbruk endringer i respons til betennelse. Syv dager gamle slaktekylling ble randomisert til en gruppe infisert med Eimeria maxima og en kontroll gruppe4. Slaktekylling som ikke gjennomførte coccidiosis utfordring hadde lavere oksygenforbruk proton lekkasje og høyere RCR indikerer at leveren mitokondrier svare på en immun utfordring ved økende proton lekkasje. Mens proton lekkasje og reaktive oksygen arter produksjon ble en gang betraktet som et tegn på mitokondrie membran dysfunksjon og skadelig for energisk effektivitet, nå det er kjent at det er viktig for import av proteiner og kalsium i mitokondrier5 , og for generering av varme1.
Elektron lekkasje fra åndedretts kjeden gjør mitochondria reaktive oksygen arter produksjon og oksidative skader mitokondrie membran proteiner, lipider og Mitokondrielt DNA. Som mitokondrier alder, skade kan akkumulere spesielt til mtDNA forårsaker ytterligere dysfunksjon i mitokondrie metabolisme6 og større mottakelighet av kua sykdommen. I praksis fôres mange husdyr dyr høye nivåer av kosttilskudd som Cu, Zn og Mn å øke antioksidant-funksjonen. Men fôring høye nivåer av Cu, Zn og Mn redusert melk produksjon og økte oksygenopptak på grunn av proton lekkasje (staten 4 åndedrett)7.
Tidligere forskning rollen mitokondrie funksjon i energieffektiviteten i storfe har fokusert på endringer i mitokondrie oksygenforbruk og proton lekkasje. Svært få studier har blitt publisert i melkeku og de fleste avisene sammenligne effektivitet i form av gjenværende fôrinntak (RFI) mitokondrie funksjonen i storfe. Variasjon i mitokondrie åndedrett priser ble undersøkt av måle staten 3, staten 4 og RCR i lever fra både ammende Holstein kyr og ammende storfekjøtt kyr (Angus, Brangus og Hereford)8. Forskerne fant ikke noen sammenheng i mitokondrie åndedrett med vekst eller melking trekk for storfe, men rapporterte en sammenheng mellom mitokondrie åndedrett og melking trekk for Holsteins. I to studier, ble RFI sammenlignet i storfe til mitokondrie åndedrett priser (staten 3, staten 4 og RCR) i muskel mitokondrier9,10. Mitokondrielt åndedrett tallene endret svar DMI og lave priser var assosiert med mindre effektiv biff styrer. I en annen studie, RFI av styrer fra høyt eller lavt RFI okser ble sammenlignet med mitokondrie åndedrett priser og proton lekkasje kinetics mellom de to gruppene av avkom11. Det skyldtes forskjeller under vinning bekrefter konklusjonen at få gjør ikke effekten mitokondrie åndedrett i storfe.
I dette papiret, et eksperiment for å undersøke leveren RCR svar på fôring 3 antioksidant mineraler til ammende melkeku illustrerer bruken av metoder for å måle oksygenopptak ved 4 og 3 åndedrett og PMF.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metoder, protokollen og studier beskrevet her ble godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) ved University of California, Davis.
1. få en lever biopsi fra en Holstein melkekyr
Merk: En leveren biopsi bør utføres av en med lisens veterinarian. Leveren biopsies kan utføres på meieri området der kyrne er plassert. Ammende mjølkekyr kan fortsette å bli melket normalt og melk trenger ikke å bli trukket fra matforsyningen før eller etter inngrepet. Det anbefales at minst 4 personer er nødvendig for å utføre den lever biopsy på en melkekyr: en veterinarian utføre biopsi, en dyr behandling å stå på cow's hip å beskytte biopsi området og veterinær, en lab tekniker på utsiden av pennen fl eh verktøy, materialer og biopsi smak til og fra veterinær og vedlikeholde rene området, som kan være bak en kjøretøy (figur 1), og en tekniker å hente leveren prøven og begynne mitokondrie isolasjon.
- En måned før leveren biopsier, kyr gi en clostridia vaksine. Opprette kirurgisk pakker av autoklavering kirurgisk håndklær, biopsi instrument, skalpell holdere og kirurgisk utstyr.
- En dag før den lever biopsy, injisere kua med Ceftiofur hydroklorid 0.044 mL/kg kroppsvekt subcutaneously i halsen. Overvåke ku temperatur, inntak og fecal score bruke som en opprinnelig plan for normal funksjon.
- Opprette mitokondrier isolasjon media (MIM) containining 220 mM mannitol, 70 mM sukrose, 20 mM HEPES, 1 mM EDTA og 0,1% (w/v) fettsyrer gratis BSA, pH 7.4 på 4 ° C. Ca 30 mL per prøve vil være nødvendig.
- Holde ku fysisk utnytte en headlock samleiet med en stoppet etter behov (figur 2). Bruker stoppet, tie hodet på venstre side av stanchion. Om nødvendig, en kjemisk selvbeherskelse (Xylazine hydroklorid 100 mg/mL IV på 0.010-0.015 mg/kg kroppsvekt) kan brukes.
- Biopsy området finnes på den høyre 10 - 11 interkostalrom plassen (Figur 3). Tegne en rett linje fra høyre tuber coxae til punkt til høyre skulder. Webområdet biopsi er der linjen krysser med 10-11 interkostalrom plass. Sterilisere området kua være biopsied ved barbering en 10 cm firkantet området (Figur 4). Vaske området med 10% providone skrubbe (figur 5) bruker en sirkelbevegelse. Spray området med 70% etanol løsning (figur 6). Gjenta providone og etanol vasker.
Merk: Leveren er en litt annen posisjon i Holstein melkeku sammenlignet med storfe. - Sette inn 2% lidocaine HCl (10-15 mL) lokalt til området for å gi anestesi av hud og underliggende muskler og bindevev (figur 7). Gjenta providone og 70% etanol vasker.
Merk: Nerve avslutninger i huden og muskler, men ikke indre organer, så bare en lokal anesthestic er nødvendig. Maksimalt bør kua bare føler litt press og ingen smerter under biopsi prosedyren. - Lage en 1-2 cm stikk-snitt gjennom huden av 10-11 interkostalrom plass (Figur 8). Sende en Schackelford-Courtney bovin leveren biopsi instrument gjennom huden og direkte apparatet biopsi liten skallen retning mens du fortsetter gjennom membranen og i leveren (figur 9, Figur 10). Få et 1 g utvalg av leveren og fjerne apparatet (Figur 11). Lukk huden med Sutur plassering (Figur 12).
- Plasser leveren utvalg i en konisk rør med nok MIM å dekke eksempel på is umiddelbar mitokondrier isolasjon
- Sjekk snitt for noen rødhet, hevelse, varme, eller smerte innen 24 timer etter biopsi og injisere kua med Ceftiofur hydroklorid 0.044 mL/kg kroppsvekt subcutaneously i nakken en gang om dagen for de neste 3 dagene (figur 13). Overvåk cow's temperatur, inntak og fecal score daglig for 1 uke etter leveren biopsi. Hvis feber utvikler, kan du fortsette antibiotika av veterinær.
Merk: Hvis en ku viser tegn på smerte, som sparker incision sted, recumbancy, rødhet, varme eller reaksjon å berøre innen 1 time etter leveren biopsi, en 1 mg/kg kroppsvekt IV injeksjon av flunixin meglumine kan brukes til å lindre smerter og betennelse. En andre injeksjon kan gis om nødvendig. - Fjerne suturer 7 dager etter biopsi.
2. isolere mitokondrier fra melkekyr leveren
- Så snart som mulig etter leveren prøven er fjernet fra kua, vaske leveren prøven i MIM (trinn 1.3) fjerne røde blodlegemer og fint hakke prøven med saks. Leveren bør være hakket i et avkjølt beaker inneholder nok isolasjon media for å holde vevet fuktig.
- Plass hakket leveren i en 30 mL hetteglass med en teflon støter 0,16 mm klaring ruges i isen og inneholder MIM (1:4 m/v).
- Homogenize lever prøve i teflon støter på 500 rpm for min med 4 slag/min.
Merk: Den lever homogenate holdes i en is-pakket kanne i MIM under hele prosessen, og alle følgende sentrifugering er fullført på 4 ° C - Sentrifuge homogenate på 500 x g i 10 min, forkaste pellet, overføre nedbryting slik kjølt sentrifuge og deretter virvel resulterende nedbryting på 10.000 x g i 10 min å få mitokondrie pellets.
- Resuspend og vaske pellet i 10 mL MIM med fettsyrer gratis BSA og sentrifuge 8100 x g for 10 min. Forkast nedbryting.
- Resuspend og vaske pellet i 10 mL MIM uten fettsyrer gratis BSA og sentrifuge 8100 x g for 10 min. Forkast nedbryting.
- Avbryte pellet 200 µL av isolasjon media og plasser på is inntil anvendt for oksygenopptak og proton lekkasje kinetic analyser.
- Bestemme protein konsentrasjon av pellets suspensjon (1/100 fortynning) med Bicinchoninic syre (BCA) kit per produsentens protokollen BSA som standard. Alle protein anses å være mitokondrie protein.
3. måle mitokondrie oksygenforbruk (State 3 og statlige 4)
- Opprette oksygen forbruk media (OCM) fra 120 mM KCl, 5 mM KH2PO4, 5 mM MgCl2, 5 mM Hepes og 1 mM EGTA, pH 7.4 på 30 ° C med 0,3% defatted BSA. Omtrent 3 mL per prøve vil være nødvendig. Også forberede en løsning av 8 μg/mL oligomycin i etanol.
- Inkuber OCM på 30 ° C. Definere åndedrett kammer, pumpe og oksygen elektrode alt etter fabrikanten retningene (oxygraph system). Oxygraph programvaren skal allerede være installert på datamaskinen.
- Sted 1 mL av OCM i åndedrett kammeret og røre kraftig. Dette vil bidra til å sikre at løsningen blir mettet med luft.
- Legge til 0,35 mg protein mitokondrie protein åndedrett kammeret og opprettholde temperaturen på 30 ° C.
- Registrere oksygenforbruk for ca 5 min. Oxygraph systemet poster oksygen konsentrasjonen avtar så åndedrett øker, oksygen konsentrasjon. Når oksygenforbruk blir konstant (en synkende rett linje), posten oksygenforbruk (av linje = konsentrasjon av oksygen/klokkeslett). Dette er planlagt oksygenforbruk.
- Legge til 1,25 µL av 4 mM rotenon løsning å hemme komplekse jeg og legger deretter til 5 µL av 1 M succinate løsning å nå en siste konsentrasjon i luftveiene kammeret av 5 mM succinate. Dette er tilstanden 4 åndedrett.
- Legg 1 µL av 100 mM ADP løsning å nå en siste konsentrasjon i åndedrett kammeret av 100 μM. Oksygen konsentrasjon reduseres (økt åndedrett) og deretter etter ca 5 min blir en rett linje. Registrere oksygenforbruk (av linje = konsentrasjon av oksygen/klokkeslett). Dette er tilstanden 3 åndedrett.
- Valgfritt: På slutten av kjøringen, Legg FCCP (0,2 μM totalt volum) for å få maksimal åndedrett. Registrere åndedrett i ca 5 min (ca). Når oksygenforbruk blir konstant, posten oksygenforbruk. Dette er maksimalt oksygenopptak.
- Beregne åndedretts kontroll Ratio (RCR) ved hjelp av formelen staten 3 oksygenforbruk / staten 4 oksygenforbruk.
- Sug opp alle løsninger av åndedrett kammeret. Skyll kammeret flere ganger med dobbel deionisert vann.
4. måle mitokondrie membran potensialet (MMP) og Proton motiv kraft (PMF)
- Forberede løsning av 80 ng/mL nigericin i etanol.
Merk: Disse kjemikaliene er oppløst i etanol, og alt bør gjøres for å begrense mengden av etanol som legges til mindre enn 1 μL, siden etanol kan uncouple elektron transportsystemet og forårsake mitchondrial dysfunksjon. - Etter grundig skylling kammeret med dobbel deionisert vann, plasser 1 mL av OCM i åndedrett kammeret og røre kraftig med magnetic røre bar. Dette vil bidra til å sikre at løsningen blir mettet med luft. Legge til metyl-triphenyl-phosphonium (TPMP +) sensitive elektrode å kammer oppsett. TPMP + elektrode skal kobles til en pH-meter og verdier leses fra pH-meter.
- Legge til 0,35 mg mitokondrie protein åndedrett kammeret.
- Legg 1,25 µL av 4 mM rotenon løsning å hemme komplekse I. post respirasjonsfrekvensen for 2-5 minutter (ca). Når oksygenforbruk blir konstant, posten oksygenforbruk.
- Tilsett 0.56 μL av 8 μg/mL oligomycin løsning for en siste konsentrasjon av 2,8 µg oligomycin /0.35 mg mitokondrie protein å hemme ADP utnyttelse. Registrere respirasjonsfrekvensen for 2-5 minutter (ca). Når oksygenforbruk blir konstant, posten oksygenforbruk.
- Legg 0.112 μL 80 ng/mL nigericin løsning for å avskaffe pH graderingen over mitokondrie interne membran. Registrere respirasjonsfrekvensen for 2-5 minutter (ca). Når oksygenforbruk blir konstant, posten oksygenforbruk.
Merk: Rotenon og oligomycin brukes til å blokkere elektronet transport kjeden på komplekse jeg og ATP syntase, henholdsvis. Nigericin legges til konvertere transmembrane H + gradient til K + gradering som kan måles med en elektrode. - Forberede en standardkurven for TPMP + ved å legge til 5 µL av 10 mM TPMP + løsningen i mitokondrie inkubasjon. Gjenta dette trinnet fire ganger til en total konsentrasjon av 2,5 μM TPMP + er lagt.
- Starte åndedrett ved å legge til 5 μL 1M succinate kammeret.
- Registrere åndedrett til du får en stabil sporing, og deretter sjarmere systemet ved å legge til malonate. Tillegg av malonate bør være 0,5 µL, 1 µL, 1,5 µL, 3.0 µL, 6.0 µL, 9.0 µL, deretter 12.5 µL 0,1 mM Malonate løsning å oppnå påfølgende filer for malonate i inkubasjon kammeret 0,1, 0,2, 0.3, 0,6, 1.2, 1.8 og 2.5 mM.
- Samle inn data fra de to elektrodene (oksygen og TPMP+). Kjøp programvare fra oxygraph systemet kan brukes til å samle samtidig målinger av mitokondrie oksygenforbruk og mitokondrie membran potensial og observere endringer i oksygenforbruk i sanntid. Figur 14 viser hvordan oxygraph systemet registrerer oksygenforbruk som eksperimentet pågår.
- Beregne MMP i mV basert på han ligningen:
MMP = 61,5 Logg ([TPMP +] lagt-ekstern [TPMP +]) x TPMP+ binding korreksjon / (0,001 x mg av protein/mL x [TPMP +])
En TPMP + bindende rettelse av 0,4 µL/mg mitokondrie protein-1 brukes.
Eksempel beregning basert på konsentrasjoner i protokollen:
MMP = 61,5 x Logg (5 µM-2 µM) x 0,4 / (0,001 x 0,35 mg mitokondrie protein/mL x 2 µM)
MMP = 198.9 mV - Anslag PMF ved plotting av en graf av MMP vs oksygenforbruk (Figur 15). PMF rapporteres som oksygenforbruk på en membran potensial på 165 mV.
Merk: Titrating elektronet transportkjeden med malonate (0,1 til 2,5 mM) viser kinetic svaret proton lekkasjen MMP. Deretter bestemmer konspirert MMP mot oksygenforbruk proton lekkasje kinetics. PMF bestemmes ved å beregne oksygenforbruk på en vanlig membran potensial (165 mV). - På slutten av siste kjøring av prøven, legge FCCP (0,2 μM totalt volum) for å indusere maksimal åndedrett og slipp TPMP + planlagte korreksjon.
- Sug opp alle løsninger av åndedrett kammeret. Skyll kammeret flere ganger med dobbel deionisert vann. På slutten av dagen, bør kammeret også være skylles noen ganger med etanol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Positive resultater viser RCR og proton lekkasje kinetics er vist i tabell 1 og Figur 15, henholdsvis. I denne studien7, RCR og protein lekkasjen kinetics ble målt i Holstein mjølkekyr på 70 dager i melk etter kyr hadde blitt matet 1 av 5 ulike nivåer av Cu, Zn og Mn i 28 dager. Staten 4, maksimal proton lekkasje-avhengige åndedrett, hadde en tendens til å bli påvirket av mineral inntak av Cu, Mn og Zn (p < 0.1). Staten 3 åndedrett (maksimal ATP stimulert åndedrett) og RCR = staten 3 / staten 4 (åndedretts kontroll ratio) var ikke påvirket av mineral inntak. Staten 4 åndedrett var høyest i LowMn og laveste i som angir at Mn spiller en viktig rolle i å minimalisere proton lekkasje avhengige åndedrett. Mangan, gjennom enzymet Mn Superoxide Dismutase er kjent for å redusere frie radikaler i mitokondrie matrix og redusere proton lekkasje12. Høyere staten 4 åndedrett var assosiert med lavere melk og melk protein avkastning. Siden proton lekkasjen er en viktig komponent i energieffektivitet, kan redusere staten 4 åndedrett gjennom Mn tilskudd forbedre effektiviteten.
| Behandlinger1 | ||||||
| Høy | Med | Lav | LowMn | Kontroll | SEM | |
| Melk, kg | 47.4ab | 50.9en | 46.0ab | 43.6b | 49,7en | 2.9 |
| Melkeprotein, kg | 1,38ab | 1,44en | 1,40ab | 1,23b | 1.43en | 0.09 |
| Staten 3 | 75.8 | 64.4 | 78.2 | 73 | 64,1 | 13 |
| Staten 4 | 26.2ab | 22.6ab | 25.9ab | 27.1en | 22.0b | 3 |
| RCR | 2.89 | 2.76 | 2,98 | 2,65 | 2.83 | 0,27 |
| en b Radvis ikke etterfulgt av samme hevet bokstav er signifikant forskjellig (P < 0.1). | ||||||
| 1 høy behandling inneholder høyeste nivåer av Cu, Zn og Mn alt godt over krav13, Med behandling inneholder nivåene Cu, Zn og Mn over krav, lav behandling inneholder lavere nivåer av Cu, Zn og Mn men fortsatt over krav, lav Mn behandling inneholder de laveste nivåene av Mn (og lavere nivåer av Cu og Zn), men fortsatt over krav og kontroll behandling inneholder de laveste nivåene av Cu og Zn, som er nær krav. | ||||||
Tabell 1: effekt av Cu, Mn og Zn tilskudd på leveren mitokondrie oksygen forbruk og melk produksjon fra mjølkekyr på 70 dager i melk. Denne tabellen er tilrettelagt Acetoze et al. 20177.
Mitokondrielt proton lekkasjen er en prosess som avleder MMP gjennom bevegelse av protoner over mitokondrie interne membran uten produksjon av ATP14. Proton lekkasje kinetics vurderes ved å beregne utbredelsen av oksygenforbruk på en vanlig membran potensial på 165 mV. En lavere membran potensial betyr at protoner er "lekker" over mitokondrie membranen, som resulterer i lavere ATP syntese (Figur 15). I Holstein ku studien var hepatic proton lekkasje avhengige åndedrett størst i LowMn og laveste kontroll, noe som stemmer med resultater i tabell 1, at staten 4 åndedrett var størst i LowMn og laveste kontrollen.
Figur 15. Proton lekkasje kinetics i Holstein kyr matet ulike mengder Zn, Cu og Mn. Dette diagrammet er basert på data fra Acetoze et al. 20177. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Negative resultater er vist i tabell 2 og Figur 16. Feed effektivitet (RFI) var høyere i Angus styrer født fra lav RFI okser enn høy RFI okser, men dette ble ikke reflektert i mitokondrie RCR (tabell 2) eller proton lekkasje kinetics (Figur 16). Det var ingen forskjeller i mitokondrie åndedrett og proton lekkasje kinetics mellom grupper av styrer, men det var en aldersforskjell RFI. Det var også ingen forskjeller (p = 0,88) i hepatic mitokondrie proton lekkasje i høy og lav RFI styrer (Figur 16). Det var store standard feil forbundet med mitokondrie åndedrett målinger, og proton lekkasje kinetic kurver var flat. Leveren prøver fra denne studien ble innhentet etter ble slaktet styrer, en prosess som forsinket leveren prøvetaking og behandling av en time. Variasjon i mitokondrie åndedrett tiltak kan gjenspeile mitokondrie åndedrett degradering grunnet vev død. Proton lekkasje kinetic linjer var flat fordi oksygen forbruk mål ikke begynne før 8 min når platå hadde allerede nådd grunnet en utstyr som feiler.
| Lav RFI | Høy RFI | SEM | P -verdi | |
| (n = 7) | (n = 8) | |||
| RFI | -0.58 | -0.01 | 0,1 | 0,05 |
| Staten 3 | 31.3 | 30,8 | 9.42 | 0,9 |
| Staten 4 | 9.76 | 10.4 | 3.23 | 0,8 |
| RCR | 3.05 | 3.03 | 0.24 | 0.93 |
Tabell 2: ytelse og mitokondrie åndedrett av høye og lave gjenværende Feed inntak (RFI) Angus bull avkom. Denne tabellen har blitt tilpasset fra Acetoze et al. 201511.
Figur 16. Proton lekkasje kinetics for avkom av høye og lave RFI Angus okser. Denne grafen har blitt tilpasset fra Acetoze et al. 201511. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 1: rense område for kirurgiske og biopsi materialer ligger på baksiden av et kjøretøy og utenfor ku pennen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: beherskelse av kua bruker en stoppet knyttet til en cross stang av hodet låsen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: området kua å rengjøre for biopsi og plasseringen av biopsi på høyre 10 - 11 interkostalrom plass funnet ved å tegne en rett linje fra høyre tuber coxae til punkt til høyre skulder. Webområdet biopsi er der linjen krysser med 10-11 interkostalrom plass. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: barbering en 10 cm område av kua å forberede å sterilisere for biopsy. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: vask biopsi området kua med 10% providone scrub benytter en sirkelbevegelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6. Spray biopsi området område med 70% etanol løsning. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7: injisere 2% lidocaine HCl (10-15 mL) lokalt til området for å gi anestesi i huden. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 8: en 1-2 cm stikk-snitt gjennom huden av 10-11 interkostalrom plass til å sette inn biopsi verktøyet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 9: innsetting av bovin leveren biopsi instrument gjennom huden. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 10: biopsi apparatet kan rettes i en liten skallen retning mens du fortsetter gjennom membranen og i leveren. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 11: en 1 g utvalg av leveren flyttes fra biopsi instrument til Falconer tube for transport til mitokondrie isolasjon stasjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 12: Suturing huden for å lukke biopsi snitt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 13: injeksjon av kua med Ceftiofur hydroklorid 0.044 mL/kg kroppsvekt subcutaneously i halsen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 14: Oxygraph programvare resultater viser oksygen forbruk svar til tillegg til hvert enkelt stoff å måle mitokondrie membran potensial (MMP) og proton motiv kraft (PMF). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det mest kritiske punktet i protokollen er å få en representant leveren Vevsprøve og begynner isolering av mitokondrier så snart som mulig etter biopsi. Variasjon i åndedrett målinger er lav (tabell 1) på grunn av en kort tid fra kua til laboratoriet. For å redusere transporttid, lite laboratorium ble satt opp på kontoret til meieriet, og lever prøver ble kjørt til office laboratoriet som hver ble samlet inn slik at mitokondrier ble isolert i 10 min av biopsi. Oppsett og testing av åndedrett kammeret og elektroder (oksygen, TPMP +) med pH-meter brukes til å registrere forskjeller i proton graderinger dagen før innsamling og prosessering prøver kan unngå feil som mangler tidlig mål i proton lekkasje Kinetics (Figur 16).
Behovet for friske leveren prøver og rask isolering av mitokondrier begrenses antall eksempler som kan samles inn og behandles i dag. Hvert eksempel tar ca 5-6 timer å fullføre; Derfor kan bare ca 5 eksempler per dag, samles og analyseres per åndedrett kammer. Dette er ikke en høy gjennomstrømning metode. utvalgsstørrelsen for behandlinger er begrenset og små feil kan øke variasjonen forbundet med resultater og muligheten til å oppdage betydning.
Isolasjon teknikken kan ekskludere noen mitokondrier som er knyttet til noen celle komponenter og forbli i pellet eller mindre mitokondrier kan gå tapt i pellet vasker under sentrifugering trinnene. Dette kan føre til resultater som ikke gjenspeiler hele befolkningen i mitokondrier. Mitokondrier kan endre størrelse og tetthet avhengig av fysiologiske stater som sult og trening (opplæring)15. Estimere mitokondrie tall med enzym aktivitet bruker citrate syntase16 eller succinate dehydrogenase17 for å bekrefte resultatene kan være nødvendig.
Ingen endringer ble gjort til opprinnelige teknikker i gnagere mitokondrie isolasjon18, åndedrett19 og proton lekke kinetics20. Denne teknikken endringer kan gjøres avhengig av vev kilde av mitokondrier og eksperimentelle behandlinger. BSA (defatted) brukes til å binde frie fettsyrer i vev. Hvis vevet har mye av fettsyrer (større enn 10%) tilknyttet, mer defatted BSA kan legges fordi frie fettsyrer vil forstyrre mitokondrie målinger.
Måle mitokondrie oksygenforbruk og proton lekkasje kinetics bruker denne teknikken er standard prosedyre. Leveren er vevet valgfrihet hovedsakelig fordi den har en masse mitokondrier, de er ganske enkelt å trekke ut og leveren er det primære området av næringsstoffer. Endringer av denne teknikken har blitt brukt til å måle oksygenforbruk i andre vev som muskel og melkekjertlene. Imidlertid må mitokondrie isolasjon teknikker endres for å passe vevet. For eksempel i muskler, mitokondrier er innebygd i muskel fiber og så isolasjon prosedyren må inkludere et protein fordøyelse og fordøyelsen må kontrolleres for å sikre at mitokondrie funksjonen ikke avbrytes.
Det finnes andre metoder for å måle mitokondrie åndedrett som krever en analyserer spesielt designet for å måle åndedrett. Cellene må være høstet fra vev og fast til inkubasjon plater. Analyserer tiltak hele cellen oksygen forbruksraten (OCR; basale), ATP knyttet OCR (tilknyttet mitokondrier), nonmitochondrial OCR og maksimal OCR. Men siden mitochondria er hemmet under noen av inkubering, er isolerte mitokondrier målinger ikke mulig. Denne metoden har blitt brukt til å undersøke OCR endringer med sykdom og narkotika intervensjoner21 hos mennesker.
Gjeldende og fremtidige applikasjoner
Bidraget fra proton lekkasje å energibehov av dyret kan være store og indikativ av fysiologiske dyret inkludert vekst, amming og sykdom. Tidligere er denne teknikken primært brukt til å undersøke association of mitokondrie oksygenforbruk og bidrag av proton lekkasje å mate eller energisk effektivitet. Men som vår forståelse av rollen mitokondrier i stoffskiftet utvides, vil betydningen av denne teknikken også øke spesielt i kombinasjon med andre mitokondrie tiltak som elektronet transportkjeden enzym aktiviteter, kalsium Dynamics apoptose og enzym aktiviteter i TCA syklus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Denne forskningen ble støttet av Alltech og USDA Luke midler gjennom Center for mat dyr sunnhet på UC Davis skolen av Veterinary-medisin.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Liver Biopsy | |||
| Equipment | |||
| Schackelford-Courtney bovine liver biopsy instrument | Sontec Instruments Englewood CO | 1103-904 | |
| Suture | Fisher Scientific | 19-037-516 | |
| Suture needles | NA | NA | Included with Suture |
| Scalpels | Sigma - Aldrich | S2896 / S2646 | # for handle and blades |
| Surgery towels | Fisher Scientific | 50-129-6667 | |
| Falcon tubes 50 mL | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Tweezers | Sigma - Aldrich | Z168750 | |
| 50 mL syringes | Fisher Scientific | 22-314387 | |
| Injection needles (22, 2 1/2) | VWR | MJ8881-200342 | |
| Cow halter | Tractor Supply Co. | 101966599 | |
| Cotton swabbing | Fisher Scientific | 14-959-102 | |
| cotton gauze squares (4x4) | Fisher Scientific | 22-246069 | |
| Medical scissors | Sigma - Aldrich | Z265969 | |
| Chemicals | |||
| Coccidiosis Vaccine 0.75 bottle/cow | Provided by Veterinarian | ||
| Clostridia Vaccine | Provided by Veterinarian | ||
| Liver biopsy antibiotics excenel 2 cc/100 lbs for 3 days | Provided by Veterinarian | ||
| Providone Scrub | Aspen Veteterinary Resources | 21260221 | |
| Ethanol 70% | Sigma - Aldrich | 793213 | |
| Xylazine hydrochloride 100 mg/mL IV at 0.010-0.015 mg/kg bodyweight | Provided by Veterinarian | ||
| 2% lidocaine HCl (10-15 mL) | Provided by Veterinarian | ||
| 1 mg/kg IV injection of flunixin meglumine | Provided by Veterinarian | ||
| Isolation of Mitochondria (liver) | |||
| Equipment | |||
| Wheaton vial 30 mL with a Teflon pestle of 0.16 mm clearance | Fisher Scientific | 02-911-527 | |
| Homogenizer Motor | Cole Parmer | EW-04369-10 | |
| Homogenizer Probe | Cole Parmer | EW-04468-22 | |
| Auto Pipette (10 mL) | Cole Parmer | SK-21600-74 | |
| Beaker (500 mL) with ice | Fisher Scientific | FB100600 | |
| Refrigerated microfuge | Fisher Scientific | 75-002-441EW3 | |
| Microfuge tubes (1.5 mL) | Fisher Scientific | AM12400 | |
| Chemicals | |||
| Bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit (microplates for plate reader) | abcam | ab102536 | |
| Sucrose | Sigma - Aldrich | S7903-1KG | |
| Tris-HCl | Sigma - Aldrich | T1503-1KG | |
| EDTA | Sigma - Aldrich | EDS-1KG | |
| BSA (fatty acid free) | Sigma - Aldrich | A7030-50G | |
| Mannitol | Sigma - Aldrich | M4125-1KG | |
| Deionized water | Sigma - Aldrich | 38796 | |
| Hepes | Sigma - Aldrich | H3375-500G | |
| Use to create mitochondria isolation media: 220 mM mannitol, 70 mM sucrose, 20 mM HEPES, 20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, and 0.1% (w/v) fatty acid free BSA, pH 7.4 at 4 °C, will last 2 days in refrigerator | |||
| Mitochondrial Oxygen Comsuption | |||
| Equipment | |||
| Oxygraph Setup + Clark type oxygen electrode | Hansatech (PP Systems) | OXY1 | |
| Thermoregulated Water Pump | ADInstruments | MLE2001 | |
| Clark type Oxygen electrode | NA | NA | |
| Autopipette (1 mL) | Cole Parmer | SK-21600-70 | Included with Oxy1 |
| Small magnetic stir bar | Fisher Scientific | 14-513-95 | |
| Micropipette (10 μL) | Cole Parmer | SK-21600-60 | |
| pH meter | VWR | ||
| Chemicals | |||
| KCl | Sigma - Aldrich | P9333-1KG | |
| Hepes | Sigma - Aldrich | H3375-500G | |
| KH2PO4 | Sigma - Aldrich | P5655-1KG | |
| MgCl2 | Sigma - Aldrich | M1028-100ML | |
| EGTA | Sigma - Aldrich | E3889-100G | |
| Use to make mitochondrial oxygen consumption media: 120 mM KCL, 5 mM KH2PO4, 5 mM MgCl2, 5 mM Hepes and 1 mM EGTA, pH 7.4 at 30 °C with 0.3% defatted BSA | |||
| Rotenone (4 mM solution) | Sigma - Aldrich | R8875-5G | |
| Succinate (1 M solution) | Sigma - Aldrich | S3674-250G | |
| ADP (100 mM solution) | Sigma - Aldrich | A5285-1G | |
| Oligomycin (solution of 8 μg/mL in ethanol) | Sigma - Aldrich | 75351 | |
| FCCP | Sigma - Aldrich | C2920 | |
| Mitochondrial Membrane Potential and Proton Motive Force | |||
| Equipment | |||
| TPMP electrode | World Precision Instruments. | DRIREF-2 | |
| Chemicals-solutions do not need to be fresh but they do need to be kept in a freezer between runs | |||
| Malonate (0.1 mM solution) | Sigma - Aldrich | M1296 | |
| Oligomycin (8 μg/mL in ethanol), keep in freezer | Sigma - Aldrich | 75351 | |
| Nigericin (80 ng/mL in ethanol), keep in freezer | Sigma - Aldrich | N7143 | |
| FCCP | Sigma - Aldrich | C3920 | |
| TPMP | Sigma - Aldrich | T200 | |
| TPMP solution: 10 mM TPMP, 120 mM KCL, 5 mM Hepes and 1 mM EGTA, pH 7.4 at 30 °C with 0.3% defatted BSA |
References
- Brand, M. D., Divakaruni, A. S. The regulation and physiology of mitochondrial proton leak. Physiology. 26, 192-205 (2011).
- Stephenson, E. J., Hawley, J. A. Mitochondrial function in metabolic health: A genetic and environmental tug of war. Biochimica et Biophysica Acta. 1840, 1285-1294 (2014).
- Bartlett, K., Eaton, S. Mitochondrial B oxidation. European Journal of Biochemistry. 271, 462-469 (2004).
- Acetoze, G., Kurzbard, R., Klasing, K. C., Ramsey, J. J., Rossow, H. A. Oxygen Consumption, Respiratory Control Ratio (RCR) and Mitochondrial Proton Leak of broilers with and without growth enhancing levels of minerals supplementation challenged with Eimeria maxima (Ei). Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition. 101, e210-e215 (2016).
- Wallace, D. C., Fan, W. Energetics, epigenetics, mitochondrial genetics. Mitochondrion. 10, 12-31 (2010).
- Paradies, G., Petrosillo, G., Paradies, V., Ruggiero, F. M. Oxidative stress, mitochondrial bioenergetics and cardiolipin in aging. Free Radicals in Biology and Medicine. 48, 1286-1295 (2010).
- Acetoze, G., Champagne, J., Ramsey, J. J., Rossow, H. A. Liver mitochondrial oxygen consumption and efficiency of milk production in lactating Holstein cows supplemented with Copper, Manganese and Zinc. Journal of Animal Physiology Animal Nutrition. 102, e787-e797 (2017).
- Brown, D. R., DeNise, S. K., McDaniel, R. G. Mitochondrial respiratory metabolism and performance of cattle. Journal of Animal Science. 66, 1347-1354 (1988).
- Golden, M. S., Keisler, J. W., H, D. The relationship between mitochondrial function and residual feed intake in Angus steers. Journal of Animal Science. 84, 861-865 (2006).
- Lancaster, P. A., Carstens, G. E., Michal, J. J., Brennan, K. M., Johnson, K. A., Davis, M. E. Relationships between residual feed intake and hepatic mitochondrial function in growing beef cattle. Journal of Animal Science. 92, 3134-3141 (2014).
- Acetoze, G., Weber, K. L., Ramsey, J. J., Rossow, H. A. Relationship between liver mitochondrial respiration and proton leak kinetics in low and high RFI steers from two lineages of RFI Angus bulls. ISRN Vet Sci. 2015 (194014), (2015).
- Halliwell, B., Gutteridge, J. M. C. Protection against oxidants in biological systems: The superoxide theory of oxygen toxicity. Free Radicals in Biology and Medicine. , Oxford University Press. Oxford. 186-187 (1989).
- National Research Council. Nutrient Requirements of Dairy Cattle. , 7th revised edition, National Academy Press. Washington, DC. (2001).
- Ramsey, J. J., Harper, M. E., Weindruch, R. Restriction of energy intake, energy expenditure, and aging. Free Radical Biology and Medicine. 29, 946-968 (2000).
- Mehta, M. M., Weinberg, S. E., Chandel, N. S. Mitochondrial control of immunity: beyond ATP. Nature. 17, 608-620 (2017).
- Kirby, D. M., Thorburn, D. R., Turnbull, D. M., Taylor, R. W. Biochemical assays of respiratory chain complex activity. Methods in Cell Biology. 80, 93-119 (2007).
- Alex, A. P., Collier, J. L., Hadsell, D. L., Collier, R. J. Milk yield differences between 1x and 4x milking are associated with changes in mammary mitochondrial number and milk protein gene expression, but not mammary cell apoptosis or SOCS gene expression. Journal of Dairy Science. 98, 4439-4448 (2015).
- Lossa, S., Lionetti, L., Mollica, M. P., Crescenzo, R., Botta, M., Barletta, A., Liverini, G. Effect of high-fat feeding on metabolic efficiency and mitochondrial oxidative capacity in adult rats. British Journal of Nutrition. 90, 953-960 (2003).
- Boily, G., Seifert, E. L., Bevilacqua, L., He, X. H., Sabourin, G., Estey, C., Moffat, C., Crawford, S., Saliba, S., Jardine, K., Xuan, J., Evans, M., Harper, M. E., McBurney, M. W. SirT1 regulates energy metabolism and response to caloric restriction in mice. PloS One. 3 (3), e1759 (2008).
- Chen, Y., Hagopian, K., Bibus, D., Villaba, J. M., Lopez-Lluch, G., Navas, P., Kim, K., McDonald, R. B., Ramsey, J. J. The influence of dietary lipid composition on liver mitochondria from mice following 1 month of calorie restriction. Bioscience Reports. 33, 83-95 (2013).
- Chacko, B. K., Kramer, P. A., Ravi, S., Benavides, G. A., Mitchell, T., Dranka, B. P., Ferrick, D., Singal, A. K., Ballinger, S. W., Bailey, S. M., Hardy, R. W., Zhang, J., Zhi, D., Darley-Usmar, V. M. The bioenergetic health index: a new concept in mitochondrial translational research. Clinical Science. 127, 367-373 (2014).
