Summary
ونشاطر هنا، أساليب لقياس استهلاك الأوكسجين المتقدرية، تعريف مفهوم علم الطاقة الغذائية، وتسرب بروتون، السبب الرئيسي لعدم الكفاءة في جيل الميتوكوندريا من ATP. هذه النتائج يمكن أن تمثل 30 في المائة الطاقة المفقودة في استخدام المواد الغذائية للمساعدة في تقييم الوظيفة المتقدرية.
Abstract
استهلاك الأوكسجين، دافع بروتون القوة (تحلان) وتسرب بروتون قياسات التنفس المتقدرية، أو مدى الميتوكوندريا قادرة على تحويل ATP NADH والقوات المسلحة الهايتية. منذ الميتوكوندريا هي أيضا الموقع الأساسي لاستخدام الأوكسجين والمغذيات الأكسدة إلى ثاني أكسيد الكربون والماء، مدى فعالية استخدام الأوكسجين، وإنتاج ATP مباشرة تتصل بكفاءة الأيض المغذيات، المتطلبات الغذائية من الحيوان، و صحة الحيوان. والغرض من هذا الأسلوب هو فحص التنفس المتقدرية، التي يمكن استخدامها لدراسة آثار المخدرات المختلفة، والوجبات الغذائية والآثار البيئية على الأيض المتقدرية. وتشمل النتائج استهلاك الأوكسجين قياس التنفس يتوقف بروتون (3 الدولة) وبروتون تسرب تعتمد التنفس (4 الدولة). يعرف بأنه نسبة التحكم الجهاز التنفسي (آر) نسبة التنفس الدولة 4 (3) الدولة ويمكن أن تمثل كفاءة حيوية المتقدرية. تسرب بروتون المتقدرية هي عملية تسمح تبديد للغشاء الميتوكوندريا المحتملة (MMP) يفصل الفسفرة من ADP تناقص كفاءة توليف ATP. تستخدم أقطاب حساس الأكسجين وترمب + مع ركائز mitochondrial ومثبطات سلسلة نقل الإلكترون لقياس الدولة 3 و 4 حالة التنفس، غشاء الميتوكوندريا تحلان (أو يمكن أن تنتج ATP) وتسرب بروتون. القيود على هذا الأسلوب هي أن نسيج الكبد يجب أن تكون طازجة قدر الإمكان ويجب تنفيذ جميع خزعات وفحوصات في أقل من 10 ح. وهذا يحصر عدد العينات التي يمكن جمعها ومعالجتها بواسطة شخص واحد في يوم واحد لحوالي 5. ومع ذلك، مطلوب 1 جرام فقط من أنسجة الكبد، حتى في الحيوانات الكبيرة، مثل الأبقار الحلوب، كمية العينة المطلوبة صغيرة بالنسبة لحجم الكبد، وهناك القليل من الوقت الانتعاش اللازم.
Introduction
الميتوكوندريا حساسة للغاية للتأكيد وبيئتها الخلوية يمكن أن تسهم في مجموعة متنوعة واسعة من الأمراض الأيضية. استهلاك الأوكسجين وتسرب بروتون في الميتوكوندريا مؤشرات الصحة الميتوكوندريا. الطرق الموضحة في هذه الورقة كفاءة الطاقة المتقدرية تقدير استخدام آر استناداً إلى استهلاك الأوكسجين مع أو بدون تسرب بروتون. هذه النتائج يمكن أن تمثل 30 في المائة الطاقة المفقودة في استخدام المغذيات1. يمكن تحديد التغييرات في الاستهلاك وبروتون تسرب الأوكسجين خلل mitochondrial الذي يساهم في الأمراض الأيضية وتؤدي إلى انخفاض الطاقة الكفاءة. يمكن أيضا استخدام هذه الأساليب دراسة تأثير العلاجات المختلفة في التنفس المتقدرية. والهدف العام لقياس استهلاك الأوكسجين mitochondrial وحركية تسرب بروتون تقييم الوظيفة المتقدرية وكفاءة حيوية.
خلل المتقدرية الكبدية ارتبطت بالعديد من الأمراض في الأبقار الحلوب. تتأثر قدرة الأيض الخلوية للتبديل بين أنواع الوقود الكربوهيدرات والدهون عندما تواجه بعجز الطاقة في الرضاعة المبكرة بعدد ووظيفة الميتوكوندريا في الخلية2. العيوب الموجودة في الميتوكوندريا قادرة على التكيف مع زيادة طلب على الطاقة وزيادة بيتا--الأكسدة يمكن أن يؤدي إلى تراكم الدهون داخل الخلايا المرتبطة بمقاومة الأنسولين ويمكن أن يؤدي إلى تشكيل الكبد الدهني في الأبقار الحلوب الرضاعة المبكرة. الميتوكوندريا، كموقع هيئة كيتون الإنتاج والاستخدام، يمكن أن تلعب دوراً رئيسيا في الكيتوزيه في الأبقار الحلوب3. الافتقار إلى الميتوكوندريا أو خلل mitochondrial سوف تؤثر على توافر الوقود إلى الهامش، وتنعكس في التغيرات في استهلاك الأكسجين أو آر.
التغييرات استهلاك الأكسجين الميتوكوندريا استجابة لالتهاب. دجاجة عمره سبعة أيام تم عشوائياً إلى مجموعة المصابين مع ماكسيما ايميريا و مجموعة تحكم4. الفراريج التي لم تطرأ التحدي الكوكسيديا قد خفض استهلاك الأكسجين بسبب تسرب بروتون وار أعلى مما يشير إلى أن الميتوكوندريا الكبد الاستجابة لتحدي منأى بزيادة بروتون تسرب. حين تسرب بروتون ورد الفعل إنتاج الأنواع الأوكسجين كان يعتبر علامة على الخلل في غشاء الميتوكوندريا وتضر بكفاءة حيوية، الآن ومن المعروف أن من المهم للبروتينات والكالسيوم استيراد الميتوكوندريا5 ، ومن أجل توليد الحرارة1.
تسرب إلكترون من سلسلة التنفس يجعل الميتوكوندريا عرضه لإنتاج الأنواع الأكسجين التفاعلية والضرر التأكسدي للغشاء الميتوكوندريا والبروتينات، والدهون والحمض النووي. كما سن الميتوكوندريا، يمكن أن تتراكم الأضرار خاصة إلى متدنا تسبب مزيدا من الخلل في التمثيل الغذائي المتقدرية6 وقابلية أكبر للبقرة للمرض. في الممارسة العملية، ويتم تغذية العديد من المواشي الحيوانات مستويات عالية من المكملات الغذائية مثل النحاس والزنك ومينيسوتا لتعزيز وظيفة المضادة للأكسدة. ومع ذلك، تغذية مستويات عالية من النحاس، الزنك والمنغنيز انخفاض إنتاج الحليب وزيادة استهلاك الأكسجين بسبب بروتون تسرب (4 حالة التنفس)7.
البحوث السابقة بشأن دور الوظيفة المتقدرية في كفاءة استخدام الطاقة في الماشية تركز على التغيرات في استهلاك الأكسجين الميتوكوندريا وتسرب بروتون. وقد نشرت دراسات قليلة جداً في الأبقار الحلوب وأوراق معظم مقارنة كفاءة الإنتاج في شكل كمية الأعلاف المتبقية (آر إف أي) للوظيفة المتقدرية في الأبقار. تقلب في التنفس المتقدرية بحثت معدلات قياس الدولة 3، 4 وار في كبد من بقرة هولشتاين الحوامل والمرضعات من لحوم البقر الأبقار (انجوس، برانجوس وهيريفورد)8. الباحثون لم تجد أي علاقة في التنفس المتقدرية مع النمو أو الصفات للأبقار الحلوب ولكنها قدمت تقريرا علاقة بين التنفس المتقدرية وحلب الصفات الهولشتاين. في دراستين، تمت مقارنة RFI في الأبقار إلى معدلات التنفس المتقدرية (الدولة 3، الدولة 4 وار) في العضلات الميتوكوندريا9،10. تغيير معدلات التنفس المتقدرية ردا على DMI وانخفاض معدلات كانت ترتبط بأقل كفاءة من يرسم لحوم البقر. وفي دراسة أخرى، قورنت RFI ليرسم من الثيران آر إف أي ارتفاع أو انخفاض معدلات التنفس المتقدرية وبروتون تسرب حركية بين هاتين المجموعتين من ذرية11. وتعزى الاختلافات مكسب يؤكد الاستنتاج بأن اكتساب عدم تأثير التنفس المتقدرية في الأبقار.
في هذه الورقة، وتجربة دراسة الكبد سي ردا على تغذية 3 المضادة للأكسدة المعادن المرضعات ماشية الألبان يوضح استخدام أساليب لقياس استهلاك الأوكسجين أثناء الدولة 4 و 3 التنفس وتحلان.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
جميع الأساليب والبروتوكول والدراسات الموضحة هنا بموافقة "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) من جامعة كاليفورنيا في ديفيز.
1-الحصول على عينة من كبد من بقرة هولشتاين الألبان
ملاحظة: ينبغي إجراء خزعة كبد بطبيب بيطري مرخص. يمكن إجراء خزعات الكبد على الموقع الألبان حيث توجد الأبقار. الأبقار الحلوب المرضعات يمكن الاستمرار في أن تكون حلب عادة والحليب لا تحتاج إلى أن تنسحب من الإمدادات الغذائية قبل أو بعد الإجراء. من المستحسن أن مالا يقل عن 4 أشخاص هناك حاجة لإجراء خزعة الكبد على بقرة الألبان: طبيب بيطري لإجراء الخزعة، معالج حيوان على الوقوف في الورك أن البقرة لحماية منطقة خزعة وطبيب بيطري، فني مختبر في خارج القلم إلى ترانسف أية أدوات ومواد وخزعة عينة من الطبيب البيطري والحفاظ على المنطقة نظيفة، الذي يمكن أن يكون في الجزء الخلفي من سيارة (الشكل 1)، وفني لاسترداد عينة الكبد وتبدأ العزلة المتقدرية.
- شهر واحد قبل خزعات الكبد، الأبقار تعطي تطعيم كلوستريديا. إنشاء حزم الجراحية مناشف التعقيم الجراحي، وصك خزعة، أصحاب مشرط والمعدات الجراحية.
- خزعة الكبد، قبل يوم واحد من حقن البقرة هيدروكلوريد سيفتيوفور 0.044 مل/كغ وزن الجسم تحت الجلد في الرقبة. رصد درجة الحرارة البقر والمدخول وعشرات البراز لاستخدامها كخط أساس لوظيفة طبيعية.
- إنشاء الميتوكوندريا العزلة الإعلامية (ميم) كونتينينينج 220 مم المانيتول، السكروز 70 ملم، 20 ملم حبيس ويدتا 1 ملم 0.1% (w/v) الأحماض الدهنية الحرة BSA، درجة الحموضة 7.4 في 4 درجات مئوية. ستكون هناك حاجة إلى حوالي 30 مل كل عينة.
- كبح جماح البقر فعلياً استخدام headlock مع هالتر حسب الحاجة (الشكل 2). استخدام الرسن، ربط رأسها إلى الجانب الأيسر من ستانتشيون. إذا لزم الأمر، ضبط النفس كيميائية (إكسيلازيني هيدروكلوريد 100 مغ/مل الرابع في 0.010-0.015 مغ/كغ وزن الجسم) يمكن استخدامها.
- تم العثور على مجال عينة في حق 10 11 المساحة ربية (الشكل 3). رسم خط مستقيم من الورك درنة الحق إلى نقطة الكتف الأيمن. الموقع خزعة حيث يتقاطع هذا الخط مع مساحة ربية 10 11. تعقيم منطقة البقر أن فحص بحلق منطقة مربعة 10 سم (الشكل 4). تغسل المنطقة بنسبة 10 في المائة بروفيدوني فرك (الشكل 5) باستخدام حركة دائرية. رش المنطقة بمحلول الإيثانول 70% (الشكل 6). كرر يغسل بروفيدوني والإيثانول.
ملاحظة: الكبد في موقف مختلف قليلاً في هولشتاين ماشية الألبان مقارنة بالابقار. - حقن ليدوكائين 2% HCl (10-15 مل) محلياً إلى المنطقة لتقديم التخدير من الجلد والعضلات والنسيج الضام (الشكل 7) الأساسية. كرر بروفيدوني ويغسل إيثانول 70%.
ملاحظة: النهايات العصبية في الجلد والعضلات، ولكن الأجهزة الداخلية لا، ذلك إلا محلي أنيسثيستيك المسبق. على الأكثر، البقرة ينبغي إلا تشعر ببعض الضغوط ولا الألم أثناء إجراء خزعة. - جعل شق طعنه سم 1-2 عن طريق جلد الفضاء ربية 10 11 (الشكل 8). تمرير أداة خزعة كبد بقرى كورتني شاكيلفورد عن طريق الجلد والمباشرة في الصك خزعة في اتجاه الجمجمة طفيفة بينما تواصل من خلال الحجاب الحاجز وفي الكبد (الشكل 9، الرقم 10). الحصول على عينة 1 غ من الكبد وإزالة هذا الصك (الشكل 11). إغلاق الجلد بخياطة التنسيب (الشكل 12).
- ضع عينة الكبد في أنبوب مخروطي مع الفلز كافية لتغطية عينة، على الجليد للعزل الفوري الميتوكوندريا
- شق الاختيار لأي احمرار، تورم، الحرارة، أو ألم في غضون 24 ساعة خزعة وحقن البقرة هيدروكلوريد سيفتيوفور 0.044 مل/كغ وزن الجسم تحت الجلد في الرقبة مرة واحدة في يوم لمدة 3 الأيام (الشكل 13). رصد درجة الحرارة أن البقرة والمدخول وعشرات البراز يوميا لمدة أسبوع واحد بعد خزعة الكبد. إذا كان يطور حمى، تواصل المضادات الحيوية بناء على تقدير الطبيب البيطري.
ملاحظة: إذا كان هذا يعرض بقرة علامات الألم، مثل الركل في موقع شق، ريكومبانسي، والاحمرار، والحرارة، أو رد فعل للمس ضمن ح 1 بعد خزعة الكبد، يمكن استخدام حقنه رابعا 1 مغ/كغ وزن الجسم من ميجلوميني فلونيكسين لتخفيف الألم والالتهاب. يمكن أن تدار حقن ثاني إذا لزم الأمر. - إزالة خيوط 7 أيام بعد خزعة.
2-عزل الميتوكوندريا من البقرة الحلوب الكبد
- وقت ممكن بعد إزالة عينة الكبد من البقرة، يغسل عينة الكبد في الفلز (الخطوة 1.3) إزالة خلايا الدم الحمراء وفرم ناعما العينة مع المقص. ينبغي أن يكون مفروم الكبد في كوب مبردة تحتوي على وسائط العزلة ما يكفي للحفاظ الأنسجة الرطبة.
- وضع الكبد المفروم في قنينة زجاج 30 مل مع مدقة تفلون إزالة 0.16 مم المحتضنة في الجليد، ويحتوي على الفلز (1:4 w/v).
- مجانسة عينة الكبد في مدقة تفلون 500 لفة في الدقيقة لدقيقة مع السكتات الدماغية الدقيقة 4.
ملاحظة: يتم الاحتفاظ هوموجيناتي الكبد في الكأس وجبات الجليد في الفلز أثناء العملية برمتها، ويتم إكمال كافة الخطوات التالية استخدام الطرد المركزي عند 4 درجة مئوية - الطرد المركزي هوموجيناتي في 500 غرام x لمدة 10 دقائق، وتجاهل بيليه، نقل المادة طافية إلى أنبوب الطرد مركزي المبرد وثم الطرد المركزي الناتجة عن المادة طافية في س 10,000 ز لمدة 10 دقيقة للحصول على بيليه المتقدرية.
- ريسوسبيند وغسل بيليه في 10 مل الفلز مع الأحماض الدهنية الحرة جيش صرب البوسنة والطرد المركزي في غ س 8100 للمادة 10 دقيقة تجاهل طافية.
- ريسوسبيند وغسل بيليه في 10 مل الفلز دون الأحماض الدهنية الحرة جيش صرب البوسنة والطرد المركزي في غ س 8100 للمادة 10 دقيقة تجاهل طافية.
- تعليق بيليه في 200 ميليلتر من العزلة الإعلامية ووضع على الجليد حتى استخدامها لاستهلاك الأوكسجين وبروتون تسرب الاختبارات الحركية.
- تحديد تركيز البروتين من تعليق بيليه (تمييع 1/100) باستخدام مجموعة (اتفاق التعاون الأساسي) حمض بيسينتشونينيك الواحدة والبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة مع جيش صرب البوسنة كالمعيار. يعتبر جميع البروتين البروتين المتقدرية.
3-قياس استهلاك الأوكسجين المتقدرية (الدولة 4 3 والدولة)
- إنشاء وسائط استهلاك الأكسجين (OCM) من عيار 120 ملم بوكل، 5 مم خ2ص4، 5 مم مجكل2، حبيس 5 و 1 ملم عطا، درجة الحموضة 7.4 في 30 درجة مئوية مع 0.3% كاكاو جيش صرب البوسنة. ستكون هناك حاجة إلى حوالي 3 مل كل عينة. كما تعد حلاً من 8 ميكروغرام/مل أوليجوميسين في الإيثانول.
- احتضان OCM عند 30 درجة مئوية. إعداد قطب الدائرة وضخ الأكسجين تنفس وفقا لتوجيهات الشركة المصنعة (نظام أوكسيجراف). البرنامج أوكسيجراف يجب أن تكون مثبتة بالفعل على جهاز الكمبيوتر.
- ضع 1 مل OCM داخل قاعة التنفس ويقلب بشدة. هذا سوف يساعد على ضمان أن الحل يصبح مشبعة بالهواء.
- إضافة البروتين 0.35 ملغ من البروتين المتقدرية إلى دائرة التنفس والحفاظ على درجة حرارة 30 درجة مئوية.
- تسجيل استهلاك الأكسجين لمدة 5 دقائق تقريبا. الزيادات التنفس، وتركيز الأكسجين وذلك يقلل تركيز الأوكسجين سجلات النظام أوكسيجراف. عندما يصبح استهلاك الأكسجين ثابت (خط مستقيم متناقص)، استهلاك الأكسجين السجل (منحدر خط = تركيز الأكسجين/الزمنية). وهذا الأساس استهلاك الأوكسجين.
- إضافة ميليلتر 1.25 من 4 مم والروتينون حل لتمنع مجمع أنا ثم قم بإضافة 5 ميليلتر م 1 سوكسيناتي حل للتوصل إلى تركيز نهائية في قاعة التنفسية succinate 5 ملم. هذا هو التنفس الدولة 4.
- أضف 1 ميليلتر من 100 ملم ADP الحل للوصول إلى تركيز نهائية في قاعة التنفس من 100 ميكرومتر. سوف ينخفض تركيز الأكسجين (زيادة التنفس) ومن ثم بعد حوالي 5 دقائق يصبح خط مستقيم. تسجيل استهلاك الأكسجين (منحدر خط = تركيز الأكسجين/الزمنية). هذا هو التنفس 3 الدولة.
- اختياري: في نهاية الشوط، إضافة فككب (الحجم الإجمالي 0.2 ميكرومتر) للحث على التنفس القصوى. تسجيل التنفس لمدة حوالي 5 دقائق (تقريبا). عندما يصبح استهلاك الأوكسجين استهلاك الأوكسجين المستمر، وسجل. هذا استهلاك الأوكسجين القصوى.
- حساب نسبة التحكم الجهاز التنفسي (آر) باستخدام معادلة الاستهلاك الأكسجين 3 الدولة/الولاية 4 استهلاك الأوكسجين.
- نضح كافة الحلول خارج قاعة التنفس. شطف الدائرة عدة مرات مع المياه مزدوجة.
4-قياس إمكانات غشاء الميتوكوندريا (MMP) والقوة المحركة بروتون (تحلان)
- إعداد حل نيجيريسين نانوغرام/مليلتر 80 في الإيثانول.
ملاحظة: يتم حل هذه المواد الكيميائية في الإيثانول، وينبغي بذل كل جهد ممكن للحد من الكمية الإيثانول التي يتم إضافتها إلى أقل من 1 ميكروليتر، حيث يمكن فصل نظام نقل الإلكترون الإيثانول وتسبب الخلل في ميتشوندريال. - بعد دقة الشطف الدائرة مع المياه مزدوجة، ضع 1 مل من OCM في قاعة التنفس ويقلب بقوة مع شريط إثارة مغناطيسية. هذا سوف يساعد على ضمان أن الحل يصبح مشبعة بالهواء. إضافة الميثيل-ثلاثي فينيل-فوسفونيوم (تبمب +) الحساسة الكهربائي الدائرة الإعداد. يجب أن تكون متصلاً تبمب + القطب مقياس الأس الهيدروجيني وتتم قراءة القيم من مقياس الأس الهيدروجيني.
- إضافة 0.35 ملغ بروتين المتقدرية إلى دائرة التنفس.
- إضافة ميليلتر 1.25 من 4 مم والروتينون حل تعوق التنفس "المعقدة أولاً السجل" لمدة 2-5 دقائق (تقريبا). عندما يصبح استهلاك الأوكسجين استهلاك الأوكسجين المستمر، وسجل.
- إضافة ميكروليتر 0.56 ميكروغرام/مل 8 أوليجوميسين حل لتركيز نهائي من 2.8 ميكروغرام أوليجوميسين 0.35 ملغ بروتين المتقدرية تحول دون استغلال ADP. تسجيل التنفس لمدة 2-5 دقائق (تقريبا). عندما يصبح استهلاك الأوكسجين استهلاك الأوكسجين المستمر، وسجل.
- إضافة ميكروليتر 0.112 80 نانوغرام/مل نيجيريسين حل لإلغاء التدرج درجة الحموضة عبر الغشاء الداخلي المتقدرية. تسجيل التنفس لمدة 2-5 دقائق (تقريبا). عندما يصبح استهلاك الأوكسجين استهلاك الأوكسجين المستمر، وسجل.
ملاحظة: يتم استخدام والروتينون وأوليجوميسين لكتلة الإلكترون النقل سلسلة في المجمع الأول و ATP synthase، على التوالي. نيجيريسين إضافة إلى تحويل transmembrane H + التدرج على تدرج K + الذي يمكن أن يقاس مع قطب كهربائي. - إعداد منحنى قياسي لتبمب + بإضافة 5 ميليلتر من 10 مم تبمب + الحل للاحتضان المتقدرية. كرر هذه الخطوة أربع مرات أكثر حتى تم إضافة مجموع تركيز 2.5 ميكرومتر تبمب +.
- بدء التنفس بإضافة 5 ميكروليتر من سوكسيناتي م 1 للدائرة.
- سجل التنفس حتى حققت عملية تتبع مستقرة، ومن ثم تيتراتي النظام بإضافة مالوناتي. ينبغي أن تكون إضافات مالوناتي 0.5 ميليلتر، 1 ميليلتر، ميليلتر 1.5, 3.0 ميليلتر، ميليلتر 6.0، 9.0 ميليلتر, ثم 12.5 ميليلتر من 0.1 مالوناتي حل لتحقيق إضافات متتالية من تركيزات مالوناتي في غرفة الحضانة من 0.1، 0.2، 0.3، 0.6، 1.2، 1.8، و 2.5 ملم.
- جمع البيانات من قطبين (الأوكسجين وتبمب+). يمكن استخدام برامج الحصول على البيانات من نظام أوكسيجراف لجمع قياسات متزامنة لاستهلاك الأكسجين الميتوكوندريا وغشاء الميتوكوندريا المحتملة، ومراقبة التغيرات في استهلاك الأوكسجين في الوقت الحقيقي. ويبين الشكل 14 كيف يسجل النظام أوكسيجراف استهلاك الأوكسجين كما تقدم التجربة.
- حساب نظام التمثيل التناسبي المختلط في المتوسط استناداً إلى المعادلة] [نرنست]:
نظام التمثيل التناسبي المختلط = 61.5 سجل ([+ تبمب] وأضاف – الخارجية [+ تبمب]) تصحيح ملزمة x TPMP+/(0.001 x ملغ من البروتين/mL x [+ تبمب])
يتم استخدام تصحيح ربط تبمب + 0.4 ميليلتر/ملغ من البروتين المتقدرية-1 .
مثال على حساب استناداً إلى التركيزات في البروتوكول:
نظام التمثيل التناسبي المختلط = 61.5 سجل س (5 ميكرون – 2 ميكرومتر) × 0.4/(0.001 × 0.35 ملغ المتقدرية البروتين/مل x 2 ميكرومتر)
نظام التمثيل التناسبي المختلط = 198.9 mV - تقدير تحلان برسم رسم بياني لنظام التمثيل التناسبي المختلط مقابل استهلاك الأوكسجين (الشكل 15). تحلان لم تبلغ عن استهلاك الأكسجين في إمكانات غشاء 165 mV.
ملاحظة: المعايرة في سلسلة نقل الإلكترون مع مالوناتي (0.1 إلى 2.5 ملم) يظهر الاستجابة الحركية لتسرب بروتون لنظام التمثيل التناسبي المختلط. ثم، التآمر MMP ضد استهلاك الأوكسجين يحدد البروتون تسرب حركية. يتحدد تحلان بحساب استهلاك الأكسجين في غشاء مشتركة محتملة (165 mV). - في نهاية الشوط الأخير من العينة، إضافة فككب (الحجم الإجمالي 0.2 ميكرومتر) للحث على التنفس القصوى وإطلاق سراح تبمب + لتصحيح خط الأساس.
- نضح كافة الحلول خارج قاعة التنفس. شطف الدائرة عدة مرات مع المياه مزدوجة. في نهاية اليوم، الدائرة ينبغي أيضا أن تشطف عدة مرات مع الإيثانول.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وترد نتائج إيجابية تظهر حركية تسرب آر وبروتون في الجدول 1 و الشكل 15، على التوالي. في تسرب7وار والبروتين في هذه الدراسة تم قياس حركية في هولشتاين الأبقار الحلوب في 70 يوما في الحليب بعد قد تم تغذية الأبقار 1 5 مستويات مختلفة من النحاس والزنك والمنغنيز لمدة 28 يوما. كانت الدولة 4، بروتون أقصى تسرب تعتمد على التنفس، وميل إلى تتأثر بكمية المعادن Cu والمنغنيز والزنك (ف < 0.1). التنفس الدولة 3 (ATP أقصى تحفيز التنفس) وار = الدولة 3/4 الدولة (نسبة التحكم الجهاز التنفسي) لم تتأثر بكمية المعادن. وكان تنفس الدولة 4 أعلى في لوومن وأقل في عنصر التحكم، مما يشير إلى أن Mn يلعب دوراً هاما في التقليل من التنفس يتوقف تسرب بروتون. المنغنيز، عن طريق إنزيم Mn دسموتاز الفاءق المعروف للحد من أنواع الأكسجين التفاعلية في مصفوفة mitochondrial والحد من تسرب بروتون12. أعلى 4 حالة التنفس ارتبط بانخفاض الحليب وإنتاج بروتين الحليب. منذ تسرب بروتون عنصر هام في الكفاءة في استخدام الطاقة، الحد من التنفس 4 الدولة عن طريق مكملات Mn يمكن تحسين الكفاءة.
| العلاجات1 | ||||||
| عالية | ميد | منخفض | لوومن | عنصر التحكم | ووزارة شؤون المرأة | |
| الحليب، كغم | 47.4ab | 50.9 | 46.0ab | 43.6ب | 49.7 | 2.9 |
| بروتين اللبن, كجم | 1.38ab | 1.44 | 1.40ab | 1.23ب | 1.43 | 0.09 |
| الدولة 3 | 75.8 | 64.4 | 78.2 | 73 | 64.1 | 13 |
| الدولة 4 | 26.2ab | 22.6ab | 25.9ab | 27.1 | 22.0ب | 3 |
| RCR | 2.89 | 2.76 | 2.98 | 2.65 | 2.83 | 0.27 |
| أ ب الوسائل ضمن صف لم يتبع نفس الرسالة مرتفع تختلف اختلافاً كبيرا (ف < 0.1). | ||||||
| 1 المعاملة عالية تحتوي على مستويات أعلى من النحاس والزنك والمنغنيز جيدا أعلاه متطلبات13، معاملة ميد يحتوي على مستويات متوسطة من النحاس والزنك والمنغنيز أعلاه الاحتياجات، معاملة منخفضة تحتوي على مستويات أدنى من النحاس والزنك والمنغنيز ولكن لا يزال أعلاه المتطلبات، معاملة Mn منخفض يحتوي على مستويات أدنى من مينيسوتا (وانخفاض مستويات النحاس والزنك) ولكن لا يزال أعلاه الاحتياجات ومراقبة معاملة يحتوي على مستويات أدنى من النحاس والزنك، وقريبة من متطلبات. | ||||||
الجدول 1: تأثير الاتحاد الجمركي، والمنغنيز، والزنك مكملات على إنتاج الأكسجين الميتوكوندريا الكبد الاستهلاك والحليب من الأبقار الحلوب في 70 يوما في الحليب. وقد تم تكييف هذا الجدول من أسيتوزي et al. عام 20177.
بروتون المتقدرية تسرب هو عملية التي تبدد نظام التمثيل التناسبي المختلط من خلال حركة البروتونات عبر الغشاء الداخلي المتقدرية دون إنتاج ATP14. يتم تقييم حركية تسرب بروتون بحساب معدلات استهلاك الأوكسجين في إمكانات غشاء مشتركة من 165 mV. غشاء انخفاض محتمل يعني أن البروتونات هي 'تسريب' عبر الغشاء الميتوكوندريا، مما يؤدي إلى انخفاض ATP التوليف (الشكل 15). في الدراسة بقرة هولشتاين، كان بروتون كبدي تسرب التنفس تعتمد أكبر في لوومن وأدنى في عنصر التحكم، التي تتفق مع النتائج في الجدول 1، أن التنفس 4 الدولة كان أعظم في لوومن وأدنى في عنصر التحكم.
الرقم 15. بروتون تسرب حركية في بقرة هولشتاين تغذية كميات مختلفة من النحاس والمنغنيز والزنك. هذا الرسم البياني يستند إلى بيانات من أسيتوزي et al. عام 20177. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
ويوضح الجدول 2 و الشكل 16النتائج السلبية. الكفاءة تغذية (آر إف أي) كان أعلى في أنجس يرسم ولد من الثيران RFI منخفضة من ارتفاع RFI الثيران، ولكن هذا لا ينعكس في الميتوكوندريا آر (الجدول 2) أو بروتون تسرب حركية (الشكل 16). لم تكن هناك فروق في التنفس المتقدرية وبروتون تسرب حركية بين مجموعات من يرسم ولكن كان هناك فرق في RFI. كما لم تكن هناك فروق (p = 0.88) في بروتون المتقدرية الكبدية تسرب في ارتفاع وانخفاض يرسم RFI (الشكل 16). كانت هناك أخطاء قياسية الكبيرة المرتبطة بقياسات التنفس المتقدرية، وبروتون تسرب الحركية المنحنيات المسطحة. وتم الحصول على عينات الكبد من هذه الدراسة بعد أن تم ذبح يرسم، عملية التي تأخر جمع عينة الكبد وتجهيزها قبل ساعة. قد يعكس الاختلاف في تدابير التنفس المتقدرية التنفس المتقدرية تدهور بسبب موت الأنسجة. بروتون تسرب خطوط الحركية كانت مسطحة لأن قياسات استهلاك الأوكسجين لم تبدأ حتى 8 دقيقة عند الهضبة قد وصلت بالفعل بسبب عطل معدات.
| RFI منخفضة | RFI عالية | ووزارة شؤون المرأة | قيمة P | |
| (n = 7) | (n = 8) | |||
| آر إف أي | -0.58 | -0.01 | 0.1 | 0.05 |
| الدولة 3 | 31.3 | 30.8 | 9، 42 | 0.9 |
| الدولة 4 | 9.76 | 10.4 | 3.23 | 0.8 |
| RCR | 3.05 | 3.03 | 0.24 | 0.93 |
الجدول 2: أداء والتنفس المتقدرية من أنجس كمية الأعلاف المتبقية (آر إف أي) عالية ومنخفضة الثور ذرية. وقد تم تكييف هذا الجدول من أسيتوزي et al. عام 201511.
الرقم 16. بروتون حركية تسرب لذرية بولز أنجس RFI عالية ومنخفضة. وقد تم تكييف هذا الرسم البياني من أسيتوزي et al. عام 201511. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 1: تنظيف المنطقة للعمليات الجراحية والمواد خزعة يقع في الجزء الخلفي من سيارة وخارج القلم البقر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2: ضبط النفس البقر باستخدام هالتر مرتبطة بقطب عبر قفل الرأس. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: منطقة البقر لتنظيف لخزعة وموقع خزعة في الفضاء ربية حق 10 11 برسم خط مستقيم من الورك درنة الحق إلى نقطة الكتف الأيمن. الموقع خزعة حيث يتقاطع هذا الخط مع مساحة ربية 10 11. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: حلق منطقة 10 سم من البقر للاستعداد لتعقيم الخزعة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5: تغسل المنطقة خزعة من البقر مع فرك بروفيدوني 10% باستخدام حركة دائرية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 6. رذاذ خزعة كل منطقة مع محلول إيثانول 70%. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 7: حقن ليدوكائين 2% HCl (10-15 مل) محلياً إلى المنطقة لتقديم تخدير الجلد. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 8: شق طعنه سم 1-2 عن طريق جلد الفضاء ربية 10 11 إدراج أداة خزعة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 9: الإدراج الصك خزعة الكبد البقري من خلال الجلد. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 10: ينبغي أن يوجه هذا الصك خزعة في اتجاه الجمجمة طفيفة بينما تواصل من خلال الحجاب الحاجز وفي الكبد. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 11: ز 1 عينة من الكبد يتم نقلها من صك خزعة إلى أنبوب فالكونر للنقل إلى محطة العزل المتقدرية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 12: خياطة الجلد لإغلاق شق خزعة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 13: حقن البقر مع هيدروكلوريد سيفتيوفور 0.044 مل/كغ وزن الجسم تحت الجلد في الرقبة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 14: أوكسيجراف البرمجيات النتائج تظهر الأوكسجين الردود الاستهلاك إضافة لكل مادة على حدة لقياس غشاء الميتوكوندريا المحتملة (MMP) ودافع بروتون للقوة (تحلان). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
معظم النقطة الحرجة في البروتوكول هو الحصول على عينة تمثيلية من أنسجة كبد وبداية عزلة الميتوكوندريا، في أقرب وقت ممكن بعد خزعة. التباين في قياسات التنفس المنخفض (الجدول 1) بسبب وقت نقل قصيرة من البقرة إلى مختبر. لتقليل وقت النقل، أنشئ مختبر صغير في المكتب لمنتجات الألبان، وطردوا كبد عينات إلى مختبر المكتب كما جمعت كل ذلك أن الميتوكوندريا كانت معزولة داخل 10 دقيقة من خزعة. إعداد واختبار التنفس الدائرة واقطاب (الأكسجين، تبمب +) مع مقياس الأس الهيدروجيني المستخدمة لتسجيل الاختلافات في التدرجات بروتون اليوم قبل جمع وتجهيز العينات يمكن تفادي الأعطال مثل القياسات مبكرة في تسرب بروتون في عداد المفقودين حركية (الشكل 16).
بسبب الحاجة إلى عينات الكبد الطازج والعزلة السريع من الميتوكوندريا، يقتصر عدد العينات التي يمكن جمعها ومعالجتها في يوم واحد. كل عينة يستغرق حوالي 5-6 ح لاستكمال؛ ولذلك، يمكن جمع عينات فقط حوالي 5 في اليوم الواحد وتحليل كل دائرة التنفس. هذا ليس أسلوب عالية إنتاجية؛ حجم العينة لعلاجات محدودة والأخطاء الصغيرة يمكن أن تزيد من تقلب المقترنة بالنتائج والقدرة على اكتشاف أهمية.
تقنية العزل قد تستبعد بعض الميتوكوندريا التي ترتبط ببعض مكونات الخلية وتظل جزءا لا يتجزأ من بيليه، أو قد فقدت الميتوكوندريا أصغر في يغسل بيليه خلال الخطوات الطرد المركزي. وهذا قد يؤدي إلى نتائج لا تعكس كامل سكان الميتوكوندريا. يمكن تغيير في حجم وكثافة تبعاً للدول الفسيولوجية مثل الجوع الميتوكوندريا وممارسة (التدريب)15. قد يتطلب الأمر تقدير عدد الميتوكوندريا مع نشاط الإنزيم باستخدام سترات synthase16 أو succinate نازعة17 للتأكد من صحة النتائج التي توصلت إليها.
تم إدخال أية تعديلات على التقنيات الأصلية المنشأة في القوارض لعزل المتقدرية18،19 من التنفس وبروتون تسرب حركية20. يمكن إجراء تعديلات على هذا الأسلوب تبعاً لمصدر الأنسجة الميتوكوندريا وعلاجات تجريبية. جيش صرب البوسنة (كاكاو) يستخدم لربط الأحماض الدهنية الحرة في الأنسجة. إذا كان النسيج للكثير من الأحماض الدهنية (أكبر من 10 ٪) المرتبطة بها، وأكثر كاكاو جيش صرب البوسنة يمكن إضافتها للأحماض الدهنية الحرة سوف تتداخل مع القياسات المتقدرية.
قياس استهلاك الأوكسجين mitochondrial وحركية تسرب بروتون باستخدام هذا الأسلوب هو الإجراء القياسي. وقد الكبد الأنسجة الاختيار أساسا لأنه فقد الكثير من الميتوكوندريا وسهلة نسبيا لاستخراج الكبد هو الموقع الرئيسي لتجهيز المواد الغذائية. إدخال تعديلات على هذه التقنية قد استخدمت لقياس استهلاك الأكسجين في الأنسجة الأخرى مثل العضلات والثديية. ومع ذلك، يجب أن يتم تعديل تقنيات العزل المتقدرية لاحتواء الأنسجة. على سبيل المثال، في العضلات، الميتوكوندريا المضمنة في ألياف العضلات وحيث يجب أن تشمل إجراءات العزل يجب أن تسيطر هضم بروتين والهضم لضمان عدم توقف الوظيفة المتقدرية.
وهناك طرق أخرى لقياس التنفس المتقدرية التي تحتاج محلل مصممة خصيصا لقياس التنفس. يجب أن تحصد من الأنسجة خلايا وثابتة إلى لوحات الحضانة. معدل استهلاك الأوكسجين الخلية كلها تدابير محلل (التعرف الضوئي على الحروف؛ والقاعدية)، ترتبط ATP التعرف الضوئي على الحروف (المرتبطة الميتوكوندريا)، نونميتوتشوندريال التعرف الضوئي على الحروف والتعرف الضوئي على الحروف القصوى. ومع ذلك، حيث يتم تثبيط الميتوكوندريا أثناء بعض الحضانة، قياسات الميتوكوندريا المعزولة غير ممكنة. وقد استخدمت هذا الأسلوب دراسة التغيرات التعرف الضوئي على الحروف مع المرض والمخدرات التدخلات21 في البشر.
التطبيقات الحالية والمستقبلية
يمكن أن تكون مساهمة تسرب بروتون لمتطلبات الطاقة الحيوانية الكبيرة والإرشادية للدولة الفسيولوجية للحيوان بما في ذلك النمو، والرضاعة والمرض. في الماضي، استخدمت هذا الأسلوب أساسا لدراسة رابطة استهلاك الأكسجين الميتوكوندريا ومساهمة من تسرب بروتون لتغذية أو كفاءة حيوية. ومع ذلك، كما يوسع فهمنا لدور الميتوكوندريا في الأيض، هذا الأسلوب أيضا ستزداد الأهمية خاصة في تركيبة مع تدابير أخرى المتقدرية مثل أنشطة إنزيم "سلسلة نقل الإلكترون"، الكالسيوم الديناميات في الأنشطة المبرمج وإنزيم دورة TCA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
وأيد هذا البحث الأموال اللتيتش وتظليل وزارة الزراعة من خلال المركز "الصحة الحيوانية الأغذية" في جامعة كاليفورنيا ديفيس مدرسة الطب البيطري.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Liver Biopsy | |||
| Equipment | |||
| Schackelford-Courtney bovine liver biopsy instrument | Sontec Instruments Englewood CO | 1103-904 | |
| Suture | Fisher Scientific | 19-037-516 | |
| Suture needles | NA | NA | Included with Suture |
| Scalpels | Sigma - Aldrich | S2896 / S2646 | # for handle and blades |
| Surgery towels | Fisher Scientific | 50-129-6667 | |
| Falcon tubes 50 mL | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Tweezers | Sigma - Aldrich | Z168750 | |
| 50 mL syringes | Fisher Scientific | 22-314387 | |
| Injection needles (22, 2 1/2) | VWR | MJ8881-200342 | |
| Cow halter | Tractor Supply Co. | 101966599 | |
| Cotton swabbing | Fisher Scientific | 14-959-102 | |
| cotton gauze squares (4x4) | Fisher Scientific | 22-246069 | |
| Medical scissors | Sigma - Aldrich | Z265969 | |
| Chemicals | |||
| Coccidiosis Vaccine 0.75 bottle/cow | Provided by Veterinarian | ||
| Clostridia Vaccine | Provided by Veterinarian | ||
| Liver biopsy antibiotics excenel 2 cc/100 lbs for 3 days | Provided by Veterinarian | ||
| Providone Scrub | Aspen Veteterinary Resources | 21260221 | |
| Ethanol 70% | Sigma - Aldrich | 793213 | |
| Xylazine hydrochloride 100 mg/mL IV at 0.010-0.015 mg/kg bodyweight | Provided by Veterinarian | ||
| 2% lidocaine HCl (10-15 mL) | Provided by Veterinarian | ||
| 1 mg/kg IV injection of flunixin meglumine | Provided by Veterinarian | ||
| Isolation of Mitochondria (liver) | |||
| Equipment | |||
| Wheaton vial 30 mL with a Teflon pestle of 0.16 mm clearance | Fisher Scientific | 02-911-527 | |
| Homogenizer Motor | Cole Parmer | EW-04369-10 | |
| Homogenizer Probe | Cole Parmer | EW-04468-22 | |
| Auto Pipette (10 mL) | Cole Parmer | SK-21600-74 | |
| Beaker (500 mL) with ice | Fisher Scientific | FB100600 | |
| Refrigerated microfuge | Fisher Scientific | 75-002-441EW3 | |
| Microfuge tubes (1.5 mL) | Fisher Scientific | AM12400 | |
| Chemicals | |||
| Bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit (microplates for plate reader) | abcam | ab102536 | |
| Sucrose | Sigma - Aldrich | S7903-1KG | |
| Tris-HCl | Sigma - Aldrich | T1503-1KG | |
| EDTA | Sigma - Aldrich | EDS-1KG | |
| BSA (fatty acid free) | Sigma - Aldrich | A7030-50G | |
| Mannitol | Sigma - Aldrich | M4125-1KG | |
| Deionized water | Sigma - Aldrich | 38796 | |
| Hepes | Sigma - Aldrich | H3375-500G | |
| Use to create mitochondria isolation media: 220 mM mannitol, 70 mM sucrose, 20 mM HEPES, 20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, and 0.1% (w/v) fatty acid free BSA, pH 7.4 at 4 °C, will last 2 days in refrigerator | |||
| Mitochondrial Oxygen Comsuption | |||
| Equipment | |||
| Oxygraph Setup + Clark type oxygen electrode | Hansatech (PP Systems) | OXY1 | |
| Thermoregulated Water Pump | ADInstruments | MLE2001 | |
| Clark type Oxygen electrode | NA | NA | |
| Autopipette (1 mL) | Cole Parmer | SK-21600-70 | Included with Oxy1 |
| Small magnetic stir bar | Fisher Scientific | 14-513-95 | |
| Micropipette (10 μL) | Cole Parmer | SK-21600-60 | |
| pH meter | VWR | ||
| Chemicals | |||
| KCl | Sigma - Aldrich | P9333-1KG | |
| Hepes | Sigma - Aldrich | H3375-500G | |
| KH2PO4 | Sigma - Aldrich | P5655-1KG | |
| MgCl2 | Sigma - Aldrich | M1028-100ML | |
| EGTA | Sigma - Aldrich | E3889-100G | |
| Use to make mitochondrial oxygen consumption media: 120 mM KCL, 5 mM KH2PO4, 5 mM MgCl2, 5 mM Hepes and 1 mM EGTA, pH 7.4 at 30 °C with 0.3% defatted BSA | |||
| Rotenone (4 mM solution) | Sigma - Aldrich | R8875-5G | |
| Succinate (1 M solution) | Sigma - Aldrich | S3674-250G | |
| ADP (100 mM solution) | Sigma - Aldrich | A5285-1G | |
| Oligomycin (solution of 8 μg/mL in ethanol) | Sigma - Aldrich | 75351 | |
| FCCP | Sigma - Aldrich | C2920 | |
| Mitochondrial Membrane Potential and Proton Motive Force | |||
| Equipment | |||
| TPMP electrode | World Precision Instruments. | DRIREF-2 | |
| Chemicals-solutions do not need to be fresh but they do need to be kept in a freezer between runs | |||
| Malonate (0.1 mM solution) | Sigma - Aldrich | M1296 | |
| Oligomycin (8 μg/mL in ethanol), keep in freezer | Sigma - Aldrich | 75351 | |
| Nigericin (80 ng/mL in ethanol), keep in freezer | Sigma - Aldrich | N7143 | |
| FCCP | Sigma - Aldrich | C3920 | |
| TPMP | Sigma - Aldrich | T200 | |
| TPMP solution: 10 mM TPMP, 120 mM KCL, 5 mM Hepes and 1 mM EGTA, pH 7.4 at 30 °C with 0.3% defatted BSA |
References
- Brand, M. D., Divakaruni, A. S. The regulation and physiology of mitochondrial proton leak. Physiology. 26, 192-205 (2011).
- Stephenson, E. J., Hawley, J. A. Mitochondrial function in metabolic health: A genetic and environmental tug of war. Biochimica et Biophysica Acta. 1840, 1285-1294 (2014).
- Bartlett, K., Eaton, S. Mitochondrial B oxidation. European Journal of Biochemistry. 271, 462-469 (2004).
- Acetoze, G., Kurzbard, R., Klasing, K. C., Ramsey, J. J., Rossow, H. A. Oxygen Consumption, Respiratory Control Ratio (RCR) and Mitochondrial Proton Leak of broilers with and without growth enhancing levels of minerals supplementation challenged with Eimeria maxima (Ei). Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition. 101, e210-e215 (2016).
- Wallace, D. C., Fan, W. Energetics, epigenetics, mitochondrial genetics. Mitochondrion. 10, 12-31 (2010).
- Paradies, G., Petrosillo, G., Paradies, V., Ruggiero, F. M. Oxidative stress, mitochondrial bioenergetics and cardiolipin in aging. Free Radicals in Biology and Medicine. 48, 1286-1295 (2010).
- Acetoze, G., Champagne, J., Ramsey, J. J., Rossow, H. A. Liver mitochondrial oxygen consumption and efficiency of milk production in lactating Holstein cows supplemented with Copper, Manganese and Zinc. Journal of Animal Physiology Animal Nutrition. 102, e787-e797 (2017).
- Brown, D. R., DeNise, S. K., McDaniel, R. G. Mitochondrial respiratory metabolism and performance of cattle. Journal of Animal Science. 66, 1347-1354 (1988).
- Golden, M. S., Keisler, J. W., H, D. The relationship between mitochondrial function and residual feed intake in Angus steers. Journal of Animal Science. 84, 861-865 (2006).
- Lancaster, P. A., Carstens, G. E., Michal, J. J., Brennan, K. M., Johnson, K. A., Davis, M. E. Relationships between residual feed intake and hepatic mitochondrial function in growing beef cattle. Journal of Animal Science. 92, 3134-3141 (2014).
- Acetoze, G., Weber, K. L., Ramsey, J. J., Rossow, H. A. Relationship between liver mitochondrial respiration and proton leak kinetics in low and high RFI steers from two lineages of RFI Angus bulls. ISRN Vet Sci. 2015 (194014), (2015).
- Halliwell, B., Gutteridge, J. M. C. Protection against oxidants in biological systems: The superoxide theory of oxygen toxicity. Free Radicals in Biology and Medicine. , Oxford University Press. Oxford. 186-187 (1989).
- National Research Council. Nutrient Requirements of Dairy Cattle. , 7th revised edition, National Academy Press. Washington, DC. (2001).
- Ramsey, J. J., Harper, M. E., Weindruch, R. Restriction of energy intake, energy expenditure, and aging. Free Radical Biology and Medicine. 29, 946-968 (2000).
- Mehta, M. M., Weinberg, S. E., Chandel, N. S. Mitochondrial control of immunity: beyond ATP. Nature. 17, 608-620 (2017).
- Kirby, D. M., Thorburn, D. R., Turnbull, D. M., Taylor, R. W. Biochemical assays of respiratory chain complex activity. Methods in Cell Biology. 80, 93-119 (2007).
- Alex, A. P., Collier, J. L., Hadsell, D. L., Collier, R. J. Milk yield differences between 1x and 4x milking are associated with changes in mammary mitochondrial number and milk protein gene expression, but not mammary cell apoptosis or SOCS gene expression. Journal of Dairy Science. 98, 4439-4448 (2015).
- Lossa, S., Lionetti, L., Mollica, M. P., Crescenzo, R., Botta, M., Barletta, A., Liverini, G. Effect of high-fat feeding on metabolic efficiency and mitochondrial oxidative capacity in adult rats. British Journal of Nutrition. 90, 953-960 (2003).
- Boily, G., Seifert, E. L., Bevilacqua, L., He, X. H., Sabourin, G., Estey, C., Moffat, C., Crawford, S., Saliba, S., Jardine, K., Xuan, J., Evans, M., Harper, M. E., McBurney, M. W. SirT1 regulates energy metabolism and response to caloric restriction in mice. PloS One. 3 (3), e1759 (2008).
- Chen, Y., Hagopian, K., Bibus, D., Villaba, J. M., Lopez-Lluch, G., Navas, P., Kim, K., McDonald, R. B., Ramsey, J. J. The influence of dietary lipid composition on liver mitochondria from mice following 1 month of calorie restriction. Bioscience Reports. 33, 83-95 (2013).
- Chacko, B. K., Kramer, P. A., Ravi, S., Benavides, G. A., Mitchell, T., Dranka, B. P., Ferrick, D., Singal, A. K., Ballinger, S. W., Bailey, S. M., Hardy, R. W., Zhang, J., Zhi, D., Darley-Usmar, V. M. The bioenergetic health index: a new concept in mitochondrial translational research. Clinical Science. 127, 367-373 (2014).
